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Se as formigas têm uma glândula antibiótica, como podem espalhar infecções hospitalares?

Se as formigas têm uma glândula antibiótica, como podem espalhar infecções hospitalares?



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A Wikipedia descreve como os antibióticos são produzidos nas formigas:

"As glândulas metapleurais ... são responsáveis ​​pela produção de um líquido antibiótico que se acumula em um reservatório ... também conhecido como bolha ... Da bolha, as formigas podem limpar a secreção na superfície de seu exoesqueleto. Isso ajuda a prevenir o crescimento de bactérias e esporos de fungos nas formigas e dentro de seus ninhos. "

Então, como as formigas são frequentemente citadas como um problema importante em hospitais, espalhando infecções do lixo e através dos pacientes? Não deveriam seus antibióticos naturais prevenir isso?


Eu trabalhei em hospitais (EUA) a maior parte da minha vida, tratando de casos adquiridos na comunidade e, de forma mais pertinente, a esta questão, nosocomial infecções (adquiridas em hospitais), e leram muitos artigos sobre o assunto.

eu tenho jamais visto formigas mencionado em qualquer lugar.

Pessoas, moscas, baratas e ratos, sim.

Formigas, não.

No entanto, as formigas são vetores em alguns estudos estrangeiros. A palavra-chave nesses estudos é potencial.

Como você afirmou,

A partir da bula, as formigas podem limpar a secreção para a superfície de seu exoesqueleto. Isso ajuda a prevenir o crescimento de bactérias e esporos de fungos nas formigas e dentro de seu ninho.

Nenhum antibiótico cobre todos os organismos. Além disso, as secreções são para proteger as formigas contra infecções, não contra o estado de portador.

As bactérias patogênicas são cultivadas a partir das próprias formigas. A formiga pode ser considerada semelhante a um ser humano: os humanos produzem anticorpos contra patógenos, mas são vetores de muitas doenças. As formigas se protegem por meio de secreções, mas são hospedeiras de patógenos em potencial.

Parte I: Revisão de dados científicos sobre transmissão de agentes infecciosos em ambientes de saúde
Higiene hospitalar e controle de infecção
Formigas associadas a microrganismos patogênicos em hospitais brasileiros: atenção a um vetor silencioso
Formigas em ambiente hospitalar e seu potencial como vetores bacterianos mecânicos Associação de Insetos / Bactérias e Infecção Nosocomial


As formigas podem carregar e realmente carregam cargas várias vezes maiores que seu próprio peso. Eu cresci em uma área com muitas formigas, e uma cena comum era uma longa trilha de formigas atuando como uma linha de abastecimento de alimentos. Uma vez que um pedaço é localizado, eles criam uma longa trilha de feremonas para esse pedaço. Um grande grupo de formigas está sempre trabalhando para quebrar a comida em pedaços menores, e várias formigas estão geralmente voltando para a colônia carregando grandes migalhas. Freqüentemente, essas migalhas são a primeira coisa que você nota, em vez das formigas reais, porque costumam ser muito maiores do que as próprias formigas.

Em um hospital, a maior parte da comida que as formigas vasculhariam teria caído do prato de um ser humano. Muitos desses seres humanos seriam portadores de doenças. Eu esperaria que a trilha que essas formigas percorriam estivesse repleta de migalhas que caem de sua carga ao longo do caminho. Se fossem grandes o suficiente para vermos, chamariam a atenção das formigas e as carregariam de volta para sua colônia. Mas uma partícula da poeira microscópica que eles deixam para trás pode carregar vários espécimes do germe que deixou algum paciente bagunçado, mesmo que a formiga que o soltou fosse relativamente estéril.


Além do fato de que as formigas carregam bactérias em suas partículas de alimentos, também pode haver razões alternativas para que elas possam espalhar infecções.

Assim como os antibióticos derivados de bactérias e fungos causaram a evolução de cepas de patógenos resistentes (MRSA, por exemplo), também pode ser o caso de as bactérias que vivem naturalmente ao redor das formigas desenvolverem algum grau de resistência ao formigaibióticos, talvez por efluxo de quantidades suficientes deles por superexpressão de proteínas da bomba para os níveis que o formigaOs ibióticos são apenas moderadamente bacteriostáticos em vez de bactericidas. Essas bactérias podem então cair das formigas enquanto estão no hospital e causar doenças.

É razoável supor que isso poderia evoluir, uma vez que as formigas freqüentemente se comunicam socialmente umas com as outras, e qualquer bactéria ou fungo resistente pode então colonizar rapidamente um nicho anteriormente vazio, criando assim uma pressão evolutiva significativa para isso.


Papel funcional do ácido fenilacético das secreções da glândula metapleural no controle de patógenos fúngicos em formigas cortadeiras evolutivamente derivadas

As colônias de formigas cultivadoras de fungos variam de quatro a cinco ordens de magnitude em tamanho. Eles empregam compostos de bactérias actinomicetas e glândulas exócrinas como agentes antimicrobianos. Atta as colônias têm milhões de formigas e são particularmente relevantes para a compreensão de estratégias higiênicas, uma vez que abandonaram a dependência primária de seus ancestrais do controle biológico baseado em antibióticos em favor do uso de secreções químicas da glândula metapleural (MG). Atta Os MGs são únicos na síntese de grandes quantidades de ácido fenilacético (PAA), um agente antimicrobiano conhecido, mas pouco investigado. Nós mostramos que particularmente as operárias menores reduzem significativamente as taxas de germinação de Escovopsis e Metarhizium esporos após a aplicação ativa de PAA em alvos experimentais de infecção em fragmentos de jardim e transferência dos esporos para as cavidades infrabucais das formigas. Em vitro ensaios indicaram ainda que Escovopsis cepas isoladas de formigas cortadeiras derivadas evolutivamente são menos sensíveis ao PAA do que cepas de formigas cultivadoras de fungos filogeneticamente mais basais, consistente com a dinâmica de uma corrida armamentista evolutiva entre a virulência e o controle de Escovopsis, mas não Metarhizium. Atta as formigas formam colônias maiores com diferenciação de castas mais extrema em relação a outras attines, em sociedades caracterizadas por uma quase completa ausência de conflitos reprodutivos. Nossa hipótese é que essas mudanças estão associadas a inovações evolutivas únicas no manejo químico de pragas que parecem robustas contra a pressão de seleção por resistência por micopatógenos especializados.

1. Introdução

Grupos sociais maiores tendem a ter maiores cargas de doença, exigindo medidas compensatórias para profilaxia e controle [1–4]. A evolução social humana tem visto grandes aumentos na carga de doenças desde o início de nossa história evolutiva. As doenças foram particularmente prejudiciais durante a revolução agrícola neolítica [5] e a urbanização subsequente [6], e só foram combatidas de forma eficaz pela evolução cultural durante os últimos dois séculos [7,8]. As formigas cultivadoras de fungos (Attini) vivem em sociedades agrárias. Como outros animais sociais [5,9], eles estão sob a ameaça de vários agentes de doenças (por exemplo, [10]), mas também tiveram milhões de anos de tempo evolutivo para se adaptarem por meio da seleção natural. Entre gêneros e espécies, os tamanhos das colônias de attine variam de várias dezenas a milhões de indivíduos e a extensão do polimorfismo do trabalhador aumenta com o tamanho da colônia [10-12], fornecendo oportunidades interessantes para entender como as estratégias de gerenciamento de doenças covariam com a complexidade social [13-15] .

As formigas cultivadoras de fungo têm dois simbiontes obrigatórios, as linhagens de cultivar de basidiomiceto das quais dependem para nutrição e o patógeno de cultivar de ascomiceto, Escovopsis nenhum dos simbiontes foi encontrado em vida livre, exceto cultivares de alguns attines basais [10-12]. Para controlar geralmente as infecções, os attines desenvolveram diversas táticas profiláticas e de saúde pública, que envolvem comportamentos individuais [13-17], comportamentos coletivos [18] e uma variedade de compostos antimicrobianos [14,19,20]. As fontes primárias desses compostos são microrganismos mutualistas, incluindo Pseudonocardia e outras bactérias actinomicetas [19-23] e secreções de glândulas exócrinas, particularmente das glândulas metapleurais (MGs) [14,15,24-26].

Os MGs emparelhados têm aglomerados de células secretoras conectadas a um reservatório de armazenamento com uma abertura estreita [12,25-27]. Os táxons de attina diferem em sua dependência de antimicrobianos glandulares ou produzidos por bactérias: espécies (ou gêneros) com actinomicetos cuticulares visíveis parecem aplicar secreções de MG principalmente para proteger a ninhada, enquanto as secreções de MG são usadas mais geralmente contra infecções de fungos, ninhadas e adultos em formigas que carecem dessas bactérias [14,15]. A significância do uso da secreção de MG no controle da doença foi amplamente inferida a partir de observações comportamentais do tratamento de MG, combinado com dados correlativos sobre a inibição do crescimento do patógeno ([14,15], mas consulte [27-29]). A transferência de secreções de MG para tecidos infectados não foi confirmada por ensaios químicos específicos para o alvo, e poucos estudos testaram a eficácia de compostos específicos como antibióticos [30]. Neste estudo, testamos explicitamente a hipótese de que um único componente abundante da secreção de MG desempenha um papel fundamental na profilaxia da doença e no controle da infecção em Atta formigas cortadeiras.

Na Vivo, As secreções de MG de formigas atinas são conhecidas por suprimir as taxas de germinação de conídios [14,30] e aumentar a sobrevivência de operárias infectadas [31]. Em vitro, conídios e micélios de Escovopsis e outros microrganismos mostram sensibilidade diferente a uma variedade de compostos de MG de Acromyrmex formigas cortadeiras [30], mas não se pode esperar que isso se aplique da mesma forma em Atta onde os trabalhadores perderam culturas de actinomicetos cuticulares. No Atta cefalotes e Atta sexdens, o ácido fenilacético (PAA) é conhecido por ser o principal componente das secreções de MG, sendo responsável por mais de 80% e 57,3% da mistura total, respectivamente [32,33], enquanto os MGs de Acromyrmex os trabalhadores não são conhecidos por produzir PAA [33], e as secreções de MG raramente são usadas para limpeza durante Escovopsis infecções [14].

Nossa hipótese é que os patógenos fúngicos são sensíveis ao PAA secretado por Atta formigas cortadeiras, e que esta forma de defesa química evoluiu para substituir o controle biológico ancestral via antibióticos derivados de culturas de actinomicetos cuticulares [14,20,28]. Para o PAA ter evoluído como uma adaptação de gestão de doenças direcionada contra micopatógenos de jardim especializados, incluindo Escovopsis, esperávamos que as formigas tivessem uma série de comportamentos correlacionados para garantir que o uso do PAA fosse específico e preciso, de forma que a probabilidade de evolução da resistência permanecesse a menor possível. Apresentamos na Vivo e em vitro ensaios sobre a farmacologia do PAA na secreção de MG de A. cephalotes para testar até que ponto este composto é instrumental na inibição Escovopsis, usando outros patógenos generalistas como controle. Discutimos os resultados de nosso estudo em relação às informações complementares sobre o controle de doenças em formigas cultivadoras de fungos em geral, e Acromyrmex e outro Atta formigas cortadeiras em particular. Finalmente, abordamos alguns dos fatores evolutivos que podem prevenir problemas de resistência no controle de doenças químicas por formigas cultivadoras de fungos.

2. Material e métodos

(a) Coletas e comportamentos de resposta higiênica

Para todos os experimentos, usamos subcolônias de A. cephalotes e 15 outras espécies de formigas atinas criadas a partir de colônias coletadas em campo no Parque Nacional da Soberania ou próximo a Gamboa, no centro do Panamá, entre 2004 e 2010 (veja o material eletrônico suplementar). Amostras de vouchers das formigas estão depositadas no Museo de los Invertebrados, Universidad de Panamá. As subcolônias foram usadas para monitorar quatro comportamentos específicos de defesa contra doenças: (i) tratamento de fungos, que envolve formigas 'lambendo' a superfície do jardim para remover partículas que estão presumivelmente contaminadas [17] (ii) tratamento de MG, que ocorre quando uma trabalhadora estende as pernas para levantar o corpo do substrato e flexionar uma perna dianteira ao longo da articulação fêmoro-tibial para trazer a superfície posterior do metatarso em contato com a abertura de um dos MGs (iii) plantio de cultivar, que envolve um trabalhador cortando um pedaço de jardim de fungo saudável e transplantá-lo para uma área de jardim infectada para inundar o crescimento do patógeno com crescimento compensatório do fungicida mutualista e (iv) remoção de ervas daninhas, que ocorre quando uma formiga remove um pedaço do jardim e o coloca em um depósito de lixo [15,17] . Alguns comportamentos profiláticos resultam no acúmulo de partículas de resíduos nas bolsas infrabucais das formigas operárias, que são então descartadas no lixão [15,16].

Cinco colônias de A. cephalotes foram coletados para quantificar o comportamento profilático. De cada colônia, estabelecemos cinco subcolônias com 1,0 g de jardim de fungos e 20 operárias de tamanho médio (largura da cabeça (HW) = 1,2–1,6 mm). Essas subcolônias foram submetidas a um dos quatro tratamentos experimentais ou não foram manipuladas como controles (cf. [28]). Os tratamentos envolveram inoculações únicas com conídios secos de insetos patógenos. Beauveria bassiana ou Metarhizium brunneum, ou de uma das duas cepas de Escovopsis isolado de jardins de fungos de A. cephalotes. Cada subcolônia experimental foi inoculada com ca 1,5 × 10 6 conídios secos [14,15], e os controles foram inoculados com simulação esfregando um pedaço de papel estéril no jardim de fungos. As subcolônias foram observadas por 60 minutos após a inoculação, e a frequência de cada comportamento profilático registrada. Para os comportamentos fúngicos e de catação de MG, que eram relativamente frequentes, as frequências comportamentais foram então convertidas em taxas (comportamentos por minuto) e analisadas usando um modelo linear misto, com o tratamento experimental como efeito principal fixo e a colônia como efeito aleatório.

(b) Identificação de ácido fenilacético na secreção da glândula metapleural e sua distribuição em jardins

Selecionamos cinco operárias pequenas (HW ≈ 1,0 mm) e cinco grandes (HW & gt 1,8 mm) de cada uma das cinco colônias. Os trabalhadores com reservatórios MG cheios foram selecionados pela presença visível de líquido leitoso na bula MG, a cobertura externa visível do reservatório da glândula. Um tubo capilar fino foi inserido através do meato da bula, o que nos permitiu coletar ca 0,5-1,0 µl de secreção acumulada de ambos os MGs de cada formiga [33]. As secreções de MG das cinco operárias em cada classe de tamanho foram reunidas para cada ninho em um frasco de 0,5 ml e dissolvidas em 20 µl de pentano. Injetamos 2 µl de cada amostra em um espectrômetro de massa de cromatografia gasosa (GC-MS) para confirmar a presença e abundância relativa de PAA nas secreções de MG. Identificamos o PAA por comparação dos espectros de massa, índices de retenção por cromatografia gasosa e tempos de retenção com os de uma amostra de referência pura (Sigma-Aldrich). A abundância relativa foi estimada a partir da área do pico do PAA em relação à soma de todos os componentes do MG. Protocolos completos de GC – MS são fornecidos no material eletrônico suplementar.

Confirmamos que o PAA não está naturalmente presente no fungo simbionte basidiomiceto das formigas ou em M. brunneum e B. bassiana culturas. Amostramos fungos simbiontes de cultivares puros isolados de três colônias de A. cephalotes, usando nove amostras de simbionte por colônia e 10 amostras de cultivares puras de cada patógeno. Nós coletamos ca 0,05 g de fungo de placas de Petri e colocado esses fragmentos diretamente em um frasco com pentano grau HPLC para análises de GC-MS. Para determinar se o PAA estava presente nos jardins de fungos após a preparação de MG, usamos três colônias de A. cephalotes, construindo 20 subcolônias com 1 g de jardim de fungos, 20 operárias médias e seis pupas de cada colônia. Inoculamos os jardins de fungos de 10 deles com ca 1,5 × 10 6 conídios secos de M. brunneum antes de adicionar os trabalhadores, e nos 10 restantes, um pedaço de papel esterilizado foi esfregado no jardim de fungos como um tratamento de controle antes de adicionar trabalhadores [14]. Três horas depois, congelamos as placas de Petri a −20 ° C por 20 min e, em seguida, colocamos 0,05 g do jardim de fungo em um frasco com solvente para análises de GC-MS.

(c) Transferência de ácido fenilacético durante a limpeza da glândula metapleural

Para determinar se o PAA é transferido do MG das formigas para alvos de infecção no jardim, comparamos extratos da superfície do tarso de operárias infectadas e não infectadas A. cephalotes subcolônias usando GC – MS. Vinte subcolônias de cada uma das três A. cephalotes as colônias foram estabelecidas com 15 trabalhadores médios e 1,0 g de jardim de fungo cada (subcolônias totais, N = 60). Posteriormente, 30 subcolônias foram usadas como controles não manipulados e 30 outras subcolônias foram cada uma inoculadas com ca 2,5 × 10 6 conídios secos de M. brunneum. Aumentamos as concentrações de conídios neste experimento para garantir que quase todas as formigas limpassem seu MG após a infecção [28]. Sessenta minutos após a infecção, as subcolônias foram transferidas para um freezer a −20 ° C por aproximadamente 20 minutos para matar todas as formigas. Para cada subcolônia infectada e de controle, selecionamos aleatoriamente seis operárias, removemos suas patas dianteiras, intermediárias e traseiras e as colocamos em frascos separados com pentano. Depois de deixar em repouso por 5 min, 2 µl do sobrenadante foram injetados no GC-MS para determinar a presença de PAA. Os dados de presença e ausência foram analisados ​​por meio de uma tabela de contingência.

Para avaliar a transferência quantitativa de PAA para patógenos, criamos nove subcolônias de cada uma de quatro A. cephalotes colônias, cada uma contendo 1,0 g de jardim de fungo, três pupas e 30 operárias de mídia selecionadas aleatoriamente. Três subcolônias foram infectadas com ca 1,5 × 10 6 conídios secos de M. brunneum, B. bassiana ou Escovopsis, como descrito acima. o Escovopsis usado foi derivado de uma colônia separada de A. cephalotes coletados no mesmo local de campo que as colônias experimentais. Após a inoculação com conídios fúngicos, os trabalhadores limparam o jardim do fungo para que os detritos se acumulassem nas bolsas infrabucais e, posteriormente, fossem descartados como pelotas infrabucais [15]. Três horas após a inoculação, as subcolônias foram congeladas por 20 min, após os quais 30 pellets intactos foram coletados e agrupados em um único frasco que foi armazenado a -20 ° C antes da análise química. A composição química dos pellets foi avaliada colocando os 30 pellets por tratamento em 25 µl de pentano, contendo 0,001 µg µl -1 de pentadecano como padrão interno, e deixados em repouso por 5 min.Em seguida, injetamos 2 µl deste extrato no GC-MS e estimamos a concentração absoluta de PAA em comparação com o padrão interno. As concentrações de PAA foram comparadas usando um modelo linear misto com o tipo de patógeno (M. brunneum, B. bassiana ou Escovopsis) como um efeito principal fixo, e colônia e interação colônia por patógeno como efeitos aleatórios. As concentrações de PAA foram transformadas em log para homogeneizar a variância dentro do grupo.

(d) Efeitos inibitórios na germinação de esporos de patógenos em Atta

Oito colônias de A. cephalotes foram usados ​​para quantificar o efeito inibitório das secreções de MG nas taxas de germinação de conídios que formigas operárias acumularam em seus sedimentos infrabucais após a infecção. Quatro colônias foram expostas a M. brunneum e quatro para Escovopsis isolado de um separado A. cephalotes colônia do mesmo local de coleta. Para avaliar se as formigas reduziram a viabilidade de conídios patogênicos, registramos a germinação de pelotas infrabucais após a infecção para quatro classes de tamanho HW de formigas: mínimas (HW menor que 0,8 mm), menores (HW 1,0-1,2 mm), meios (HW 1,2 –1,6 mm) e maiores (HW mais de 1,8 mm). De cada colônia, criamos 12 subcolônias (três repetições para cada classe de tamanho de HW), cada uma com 1 g de jardim de fungo, 20 operárias, três larvas e três pupas, e as expusemos a ca 2,5 × 10 6 conídios secos de M. brunneum ou Escovopsis, uma dose alta o suficiente para que as formigas gerem e descartem rapidamente pelotas infrabucais com conídios de fungos patogênicos.

Três horas após a infecção, todas as pelotas infrabucais depositadas pelas formigas foram coletadas das subcolônias com uma agulha estéril e semeadas em placas de Petri com ágar batata dextrose (PDA, 19,5 g por 500 ml de água destilada) [28]. Setenta e duas horas depois, contamos o número de pellets que apresentaram germinação fúngica consistente com a morfologia do patógeno utilizado. As taxas de germinação foram comparadas usando um modelo linear generalizado misto usando erros binomiais. Os principais efeitos foram o tipo de patógeno (M. brunneum ou Escovopsis), classe de tamanho do trabalhador e sua interação. A colônia foi incluída como uma variável aleatória aninhada no tipo de patógeno, porque diferentes colônias foram tratadas com diferentes patógenos.

(e) Análises comparativas da produção de ácido fenilacético e eficiência inibitória em formigas atinas

Para determinar a distribuição do PAA nas secreções de MG entre as formigas atinas, testamos 16 espécies representativas: Mycocepurus smithii, Apterostigma collare, Ap. goniodos, Myrmicocrypta ednaella, Cyphomyrmex longiscapus, Trachymyrmex sp. 10, Trachymyrmex sp. 3, T. cornetzi, T. zeteki, Sericomyrmex amabilis, S.cf. amabilis, Acromyrmex echinatior, Ac. octoespinoso, A. cephalotes, A. sexdens e A. colombica. As colônias foram mantidas em laboratório por pelo menos duas semanas antes dos experimentos (veja o material eletrônico suplementar). Amostramos cinco ninhos para cada espécie e criamos uma subcolônia de cada um deles com 0,5 g de jardim de fungo, três pupas e 20 operárias. Essas subcolônias foram infectadas com ca 1,5 × 10 6 conídios secos de M. brunneum e 4-7 h mais tarde, pellets infrabucais depositados pelos trabalhadores foram coletados (N = 25 pelotas por subcolônia para formigas cortadeiras e N = 50 pellets de espécies não cortadeiras, para obter uma quantidade semelhante de material de pellet). Os pellets foram colocados em um frasco e congelados a −20 ° C até as análises de GC-MS, quando adicionamos 20 µl de pentano a cada frasco, e agitamos suavemente até que o pellet se dissolva. Para cada amostra, 2 µl desta solução foram injetados no GC – MS. Usamos dados de um estudo anterior [34] para comparar a frequência de MG aliciamento com a presença de PAA nas pelotas infrabucais.

Medimos o efeito inibitório do PAA sobre Escovopsis cepas isoladas dos jardins de 10 espécies attine, representando oito gêneros (Meu c. smithii, Ap. pilosum, Myr. ednaella, C. costatus, S. amabilis, T. zeteki, Ac. echinatior, Ac. octoespinoso, A. cephalotes e A. colombica) Macromorfologia, cor dos conídios e taxas de crescimento nas placas foram usados ​​para distinguir Escovopsis morfotipos [35-38], que confirmou que trabalhamos com uma boa representação da diversidade filogenética geral (material eletrônico suplementar, figura S1). Além de Escovopsis, também testamos a sensibilidade ao PAA de dois entomopatógenos generalistas, M. brunneum, B. bassiana e dois com ervas daninhas Trichoderma contaminantes coletados de Atta jardins de fungos (veja o material eletrônico suplementar para métodos micológicos).

Usando PDA como meio de crescimento em placas de Petri (15 × 60 mm), adicionamos diferentes concentrações (100, 200, 400, 500 e 800 µg ml −1) de PAA padrão analítico (Sigma-Aldrich), usando o solvente aprótico polar dimetilsulfóxido (DMSO) como transportador. Três dias depois, inoculamos um tampão de 8 mm de diâmetro de cultura pura de cada fungo em três réplicas de placas para cada concentração de PAA e adicionamos três controles (apenas PDA, PDA + DMSO e 100 µg ml −1 do fungicida cicloheximida como um fator positivo ao controle). Dez dias após o tratamento, usamos uma câmera Nikon Coolpix L110 para fotografar cada placa para determinar a extensão do crescimento do fungo, após o que calculamos as áreas de crescimento (cm 2) usando o software I mage J v. 1.37v (seguinte [39]) (material eletrônico suplementar, figura S1). O efeito da concentração de PAA no crescimento do fungo foi modelado ajustando-se um modelo linear generalizado com erros binomiais para cada Escovopsis deformação, com base na cobertura proporcional da área média total disponível (21 cm 2). A concentração de PAA na qual o crescimento do fungo foi restrito a 50% da área do prato (ID50) foi estimado pela previsão inversa dos modelos ajustados.

3. Resultados

(a) Ácido fenilacético como composto de defesa para controlar a infecção com patógenos fúngicos

A frequência da preparação de fungos e da preparação de MG por A. cephalotes trabalhadores foi significativamente diferente entre os grupos de tratamento de infecção e controles (ANOVA unilateral, F4,16 = 8.71, p & lt 0,001 e F4,16 = 4.44, p = 0,013, respectivamente material eletrônico suplementar, tabela S1), mas essas frequências não diferiram entre os quatro tipos de desafios de patógenos (testes post hoc de Tukey p & gt 0,05). Nenhuma diferença entre os tratamentos foi observada no plantio de cultivares ou nos comportamentos de remoção de ervas daninhas logo após a infecção (ambos p & gt 0,5 material eletrônico suplementar, tabela S1).

PAA esteve presente em todas as amostras de A. cephalotes As secreções de MG foram coletadas (figura 1), mas o procedimento de coleta significou que muitas amostras estavam contaminadas com compostos normalmente encontrados na hemolinfa. As quatro amostras sem tal contaminação confirmaram que o PAA era o composto dominante na secreção de MG em operárias grandes (abundância relativa: 54 e 88%) e pequenas (78 e 81%). O PAA também foi detectado em todas as pelotas produzidas pelas quatro classes de tamanho de trabalhador. Nenhum PAA foi detectado em culturas puras do simbionte fúngico ou de qualquer um dos patógenos, mas o PAA foi detectado em um total de cinco dos 30 jardins de fungos de subcolônias após a infecção com M. brunneum (material eletrônico suplementar, tabela S2). Nenhum PAA foi detectado nas patas dianteiras, intermediárias ou traseiras antes da infecção e, após a infecção, o PAA foi encontrado apenas nas pernas dianteiras (material eletrônico suplementar, tabela S2 N = 171, χ 2 = 20,03, d.f. = 2, p & lt 0,0001) implicando que as formigas operárias transferiram o PAA para apontar fontes de infecção escovando a abertura do MG com suas patas dianteiras e, em seguida, entrando em contato com o alvo.

Figura 1. Perfil típico do cromatograma gasoso da secreção da glândula metapleural de um A. cephalotes trabalhador. O grande pico em um tempo de retenção de 10,21 min foi identificado como PAA (estrutura mostrada à direita do pico) com base em seu espectro de massa (inserção).

As colônias não diferiram significativamente em seu efeito inibitório contra patógenos (efeito aleatório Z = 1.55, p = 0,122), mas havia diferenças claras entre as classes de tamanho dos trabalhadores (figura 2 F3,88 = 42.2, p & lt 0,001). As operárias menores inibiram mais fortemente a germinação de conídios de pellets de ambos M. brunneum e Escovopsis sp. que trabalhadores médios e maiores (figura 2). Todas as quatro classes de tamanho de trabalhador inibiram o crescimento de Escovopsis pelotas significativamente mais do que o crescimento de M. brunneum pelotas (figura 2 F1,7 = 49.6, p & lt 0,001), com diferenças na eficiência de inibição entre as classes de tamanho também sendo altamente significativas (classe de tamanho × interação do tipo de fungo: F3,88 = 6.87, p & lt 0,001).

Figura 2. Uso de PAA de glândulas metapleurais de diferentes classes de tamanho de trabalhador de A. cephalotes, mostrando a proporção média (+ s.e.) de pelotas infrabucais que não germinaram. Operárias mínimas (HW = 0,6-0,8 mm) e operárias menores (HW = 1,0-1,2 mm) inibiram mais fortemente a germinação de M. brunneum esporos (barras pretas) do que Escovopsis sp. (isolado de um A. cephalotes ninho) (barras cinza) em relação à mídia (HW = 1,4–1,6 mm) e operárias principais (HW = 1,8–2,2 mm).

Trabalhadores de médio porte de A. cephalotes não diferiu na quantidade de PAA transferida para pellets após infecções com diferentes patógenos (figura 3 F2,6 = 0.375, p = 0,702), e não houve efeito da colônia de origem (tratado como um efeito aleatório) nesta análise (F3,6 = 0.576, p = 0,652), sugerindo que as colônias usam PAA para uma ampla gama de infecções fúngicas. Houve, no entanto, um patógeno significativo por interação de colônia (F6,24 = 4.15, p = 0,005, figura 3), sugerindo que as colônias podem responder de maneira diferente a diferentes infecções fúngicas.

Figura 3. Quantidade média de PAA + s.e. extraído de pelotas infrabucais produzidas por A. cephalotes trabalhadores quando desafiados com três patógenos fúngicos diferentes em quatro colônias de teste.

(b) Ácido fenilacético como uma substância derivada evolutivamente para o controle de doenças químicas em Atta

O PAA foi encontrado em todas as pelotas de fungos depositadas por trabalhadores de A. colombica, A. sexdens e A. cephalotes, mas nunca foi detectado em uma seleção representativa de espécies attine simpátricas de sete outros gêneros, incluindo espécies como Trachymyrmex sp. 10 e S. amabilis que são conhecidos por terem altas taxas de remoção de MG [14,15,34] (material eletrônico suplementar, tabela S3) e poucas ou nenhuma bactéria actinomicete como defesa alternativa. O PAA também estava ausente em duas espécies do gênero formiga cortadeira irmã, Ac. echinatior e Ac. octoespinoso, que têm actinomicetos cuticulares e taxas intermediárias de catação de MG quando seus ninhos estão infectados com M. brunneum (material eletrônico suplementar, tabela S3).

Bioensaios mostraram que o PAA inibiu o crescimento de Escovopsis morfotipos em uma extensão diferente. Morfotipos obtidos de espécies de attine inferiores foram mais sensíveis (ID50 isto é, a concentração necessária para 50% de inibição: média ± s.e. = 156,8 ± 32,8 μg ml −1), enquanto os morfotipos isolados de attines superiores (incluindo formigas cortadeiras) exigiram concentrações mais altas para inibição (figura 4: ID50 = 373,6 ± 15,1 μg ml −1 t8 = 6.76, p & lt 0,001). Dentro das atines superiores, no entanto, não houve diferença significativa entre a sensibilidade dos morfotipos de formigas cortadeiras e não cortadeiras (t4 = −0.235, p = 0,826). Não Escovopsis morfotipo cresceu em concentrações de PAA de 800 μg ml −1, mas o entomopatógeno M. brunneum e as duas linhagens de Trichoderma mostrou menos de 50% de inibição nesta concentração elevada. Beauveria bassiana mostrou geralmente baixo crescimento nas placas de Petri, mas era bastante insensível à concentração de PAA (intervalo de inibição sempre 50-85% em todo o intervalo de 0-800 μg ml-1).

Figura 4. Efeitos inibitórios do PAA sobre Escovopsis cepas retiradas de jardins de fungos de diferentes espécies de formigas atinas e de outros patógenos fúngicos mais gerais. A inibição foi medida como a proporção da área da placa de Petri com meio PDA que permaneceu livre de Escovopsis crescimento após 10 dias. Círculos marcam o ID estimado50 (concentração de PAA que restringiu o crescimento a 50% da área da placa) para cada cepa fúngica, com barras de erro mostrando os limites de confiança de 95% da estimativa. ID estimado50 valores para nãoEscovopsis os fungos são menores que 0 ou maiores que 800 µg ml −1. As formigas attine das quais Escovopsis as cepas isoladas são agrupadas de acordo com o tipo de agricultura de fungos que praticam [10].

4. Discussão

Este estudo documenta o uso de um agente antimicrobiano por Atta formigas cortadeiras para o controle de micoparasitas especializados e generalizados. Atta formigas cultivadoras de fungos desenvolveram colônias verdadeiramente em grande escala e "orgânicas", caracterizadas por extrema diferenciação de castas e ausência quase completa dos conflitos reprodutivos típicos que caracterizam muitos Hymenoptera eussociais [40,41]. Nossos resultados sugerem que eles também desenvolveram inovações únicas no gerenciamento de doenças. Os avanços na gestão de doenças também caracterizaram a evolução cultural das sociedades humanas em grande escala [5], por isso é de interesse explorar a extensão da analogia entre esses dois domínios da evolução social. Abordamos como nosso estudo complementa o trabalho anterior com formigas cortadeiras e seus parentes próximos, o que torna Atta gerenciamento de doenças único e como até mesmo as sociedades de insetos mais sofisticadas continuam a enfrentar ameaças de doenças em rápida evolução.

(a) Desvendando os detalhes do controle profilático e agudo de doenças em formigas cortadeiras

Os resultados confirmaram a hipótese de que o PAA tem atividade antimicrobiana [42], e que é o composto de MG mais abundante em A. cephalotes [33]. O PAA já demonstrou ser o composto de MG mais abundante em A. sexdens [24,33], e o segundo mais abundante em A. laevigata [25]. Embora tenha sido inferido anteriormente que o ácido orgânico menos abundante Myrmicacin (ácido 3-hidroxidecanóico) é usado para controlar "ervas daninhas" de jardim de fungos por Atta [32], não detectamos este composto nas secreções de A. cephalotes. Estimamos que um trabalhador de médio porte pode produzir 0,45 µg de PAA durante uma infecção, o que é consideravelmente menos do que 1,4 µg de PAA que foi estimado para ser produzido por um "tamanho médio" A. sexdens trabalhador [12]. Heuristicamente, usando nosso valor mais baixo, uma colônia madura de A. cephalotes com 1 milhão de trabalhadores médios poderia, assim, produzir cerca de 0,5 g de PAA. Estudos futuros são necessários para determinar a eficácia na Vivo dosagem de PAA para inibir a propagação de Escovopsis e outros patógenos dentro do jardim, e se essa produção em massa ajuda a explicar por que há poucas evidências de que Escovopsis mata regularmente grandes colônias de qualquer Atta espécies, embora as infecções crônicas sejam amplamente prevalentes [43]. Estudos anteriores relataram que o PAA só é encontrado em Atta, mas não em outros gêneros de formigas atinas [24,25,32,33,44], um resultado que confirmamos em uma seleção substancial de formigas atinas panamenhas. Este estudo complementa nossas descobertas anteriores de que Atta adotou o controle de doenças químicas sintetizadas, em contraste com seu táxon irmão de formigas cortadeiras, Acromyrmex, que manteve culturas cuticulares ancestrais de Pseudonocardia actinomicetos para controlar Escovopsis infecções [14,45]. No entanto, uma mudança do controle biológico para o químico de um patógeno especializado não é necessariamente mais sustentável [14,28], a menos que o cuidado aprimorado e a flexibilidade de uso superem os possíveis riscos mais elevados de evolução da resistência ao longo do tempo.

Os resultados do nosso estudo confirmam que o coquetel de ferramentas comportamentais e químicas que Atta os trabalhadores empregam, em grande parte, de acordo com os critérios de sustentabilidade do senso comum [14,15]. O principal componente de controle ativo PAA parece ser transferido dinamicamente dos MGs para as patas dianteiras dos trabalhadores para alvos de infecção de patógenos de jardim de insetos e fungos, após o que uma série de outros comportamentos de limpeza garantem que as partículas infecciosas se acumulem nas bolsas infrabucais de (particularmente operárias de pequeno e médio porte), onde são mortas antes da remoção permanente do ninho. Nosso estudo, portanto, fornece evidência experimental que tem faltado até agora [27,28] em mostrar que Atta trabalhadores podem controlar as taxas de germinação de conídios de especialistas (Escovopsis cepas) e generalizadas (B. bassiana e Metarhizium anisopliae) patógenos fúngicos, mas que são especialmente eficientes no controle de diferentes morfotipos de Escovopsis, o único patógeno conhecido que se especializa em jardins de fungos attine. Devido a essa especialização, é mais provável que mostre respostas coevolucionárias ao aumento da eficiência do controle.

o na Vivo resultados experimentais confirmaram que A. cephalotes trabalhadores aumentaram a frequência de MG aliciamento quando expostos a um desafio por conídios fúngicos, mas esse aumento foi independente da espécie de fungo utilizada, conforme observado em Acromyrmex quando os trabalhadores foram inoculados com conídios de Metarhizium e Escovopsis [29], indicando que o PAA é ativo contra patógenos especializados e generalistas. Nossa descoberta de que a quantidade de PAA transferida pode ser diferente para diferentes colônias expostas a diferentes patógenos sugere que Atta os trabalhadores podem ajustar a quantidade e a qualidade de sua secreção de MG em resposta ao tipo de desafio da doença, como foi recentemente mostrado para simpátricos Acromyrmex [29]. Dois estudos mostraram agora que compostos e secreções de MG Acromyrmex espécies podem reduzir o crescimento micelial ou inibir a germinação de Escovopsis conídios [29,30], mas Acromyrmex trabalhadores apenas ocasionalmente visam Escovopsis infecções comportamentais com suas secreções de MG [14], consistente com seus actinomicetos sendo a principal estratégia de controle [14,45]. Nosso em vitro ensaios mostraram ainda que as concentrações de PAA necessárias para controlar Escovopsis foram menores do que aqueles necessários para controlar outros patógenos, consistentes com a hipótese de que essas secreções de MG, e PAA em particular, são defesas funcionais alternativas que substituíram os antibióticos produzidos por bactérias actinomicetos usados ​​por Acromyrmex e mais simpátrico Trachymyrmex controlar Escovopsis [14,15,28].

(b) O controle químico de pragas em fazendas de formigas em grande escala pode enfrentar problemas de resistência?

Atta e Acromyrmex ambos processam a vegetação viva para cultivo de fungos e seus sistemas alternativos de controle químico e biológico de pragas provavelmente foram elaborados evolutivamente desde que os gêneros se dividiram em cerca de 10 Mya [10]. A hipótese de que Atta não teria sido capaz de ultrapassar Acromyrmex em termos de pegada ecológica (e status das formigas-pragas), a menos que tenha desenvolvido maneiras de prevenir ou limitar severamente a evolução da resistência contra o controle químico de pragas, parece razoável. Compreender como isso foi alcançado é importante, por causa das analogias com a agricultura humana em grande escala, que é atormentada por problemas de resistência a pesticidas após apenas algumas décadas de uso [46]. É interessante que concentrações mais altas de PAA são necessárias para inibir outros patógenos (figura 4), com exceção de B. bassiana, o que sugere que a síntese de PAA poderia ter evoluído porque Escovopsis é particularmente vulnerável a este composto. Também é digno de nota que Escovopsis cepas de espécies attine inferiores (ou seja, gêneros de formigas attina mais basais) foram mais suscetíveis ao PAA (ID50 cerca de 160 µg ml −1) do que Escovopsis isolado dos jardins de attines superiores (ID50 cerca de 370 µg ml −1). Este resultado está de acordo com estudos anteriores de Escovopsis isola de Atta mostrando que essas linhagens são geralmente diferentes daquelas encontradas em formigas atinas superiores não cortadeiras [36] e ainda mais diferentes daquelas normalmente encontradas em atinas inferiores [37,38]. Somente Escovopsis cepas do gênero attine basal Apterostigma são altamente variáveis, com algumas cepas sendo semelhantes às encontradas em Atta [36–38].

Freqüentemente, infere-se que os padrões diferenciais de suscetibilidade e resistência são o resultado de uma corrida armamentista evolucionária na qual os antagonistas naturais alcançaram um equilíbrio dinâmico de cabo de guerra. Como Atta e Acromyrmex são susceptíveis de compartilhar as mesmas cepas de Escovopsis [35] e criar cepas muito semelhantes do cultivar simbiótico [47,48], não é surpreendente que Escovopsis cepas isoladas de Atta e Acromyrmex foram igualmente sensíveis ao PAA. No entanto, a transmissão horizontal de cepas de fungos de jardim entre colônias simpátricas de Atta e Acromyrmex não parece ocorrer em nosso centro de estudo no Panamá [48], de modo que qualquer transmissão horizontal Escovopsis cepa parasitando ambos Atta e Acromyrmex enfrentará o desafio de ter que lidar com antibióticos bacterianos actinomicetos e formiga PAA ao longo das gerações. Isso pode tornar mais difícil para Escovopsis para desenvolver maior virulência e levanta a questão de por que Escovopsis linhagens não parecem ter evoluído especificidade para qualquer Atta ou Acromyrmex [35].

As práticas de controle químico baseadas no PAA de Atta têm muitas características que podem ajudar a manter a sustentabilidade, mesmo que não haja Acromyrmex hospedeiros para co-infectar. Em primeiro lugar, os resultados do nosso presente estudo mostram que o PAA nunca é usado profilaticamente (material eletrônico suplementar, tabela S1), ou seja, não é detectado em jardins ou nas patas de formigas a menos que haja uma infecção. Em segundo lugar, a aplicação de PAA é direcionada com extrema precisão apenas para fontes de infecção e reforçada por elaborados comportamentos complementares, como capina ativa, limpeza manual e tratamento concentrado na cavidade infrabucal (ou seja, longe do jardim) para reduzir o sucesso da germinação de esporos de fungos patogênicos. Notavelmente, o tratamento com pelotas infrabucais foi consideravelmente menos eficaz contra Metarhizium, um patógeno de inseto generalista que nunca desenvolverá resistência [49], do que contra o patógeno de jardim especializado Escovopsis (Figura 2). Embora Escovopsis esporos em pelotas depositadas ainda podem germinar parcialmente em vitro (figura 2), isso dificilmente seria um fator de seleção para resistência, a menos que essas hifas consigam encontrar o caminho de volta para um jardim de fungos para esporular, o que parece altamente improvável, pois não serão atraentes para trabalhadores forrageiros. Mais pesquisas nas interações dinâmicas entre Atta, Acromyrmex e sua cultivar e Escovopsis os simbiontes continuarão sendo altamente recompensadores para a compreensão da emergência geral ou prevenção de problemas de resistência em simbioses agrícolas.

(c) A perspectiva comparativa do manejo de doenças em formigas cultivadoras de fungos

Apesar do progresso substancial, não temos dados comparativos suficientes para entender completamente as transições paralelas nos sistemas de saúde pública que co-ocorreram com as transições evolutivas na fungicultura atine e na organização social [10,11,14,15,17]. Sabemos que mudanças dramáticas nas fontes de compostos antimicrobianos ocorreram em toda a árvore filogenética de attine, de modo que antimicrobianos produzidos por bactérias actinomicetos parecem ser a chave para o controle Escovopsis em muitas espécies de Trachymyrmex e Acromyrmex, e em vários gêneros de formigas attinas basais, enquanto as secreções de MG cumprem esse papel em Atta, Sericomyrmex [14] e possivelmente em alguns Trachymyrmex espécies [15] que não possuem actinomicetos visíveis. No entanto, as interações entre os diferentes antimicrobianos não são completamente compreendidas. Por exemplo, não sabemos se outros componentes MG, outros produtos exócrinos ou metabólitos bacterianos podem aumentar o efeito inibitório do PAA ou restringir as respostas devido a trocas com outras funções vitais. Além disso, informações sobre os compostos antimicrobianos produzidos pelos actinomicetos cuticulares associados a Acromyrmex e Trachymyrmex espécie é muito escassa [21-23], limitando nossa compreensão do sistema de biocontrole que ancestral Atta espécies abandonadas ao evoluir para o controle químico baseado em PAA.

Descobrindo que o menor Atta trabalhadores têm o maior efeito inibitório sobre a germinação do pellet é de interesse. Esses minúsculos trabalhadores são ativamente recrutados por trabalhadores maiores para os locais de infecção [50], o que sugere que eles têm um papel especial no gerenciamento de doenças, consistente com seus MGs serem desproporcionalmente grandes em comparação com os de trabalhadores maiores [51]. Estudos comparativos entre formigas atinas e não cortadeiras, e entre formigas cortadeiras e não cortadeiras, mostraram que Atta e Acromyrmex ambos têm MGs significativamente aumentados em todas as castas operárias [52,53]. Tamanhos relativos de MG também variam entre patrilinos na mesma colônia de dois panamenhos Acromyrmex espécies [54]. O tamanho do MG é, portanto, hereditário nas castas estéreis, mas não nas rainhas, levantando questões intrigantes sobre trocas com outras características de desempenho dispendiosas, tanto em geral quanto para o gerenciamento de doenças em particular [54].

Abundância relativa de actinomicetos visíveis em exoesqueletos de formigas [14] e MG-grooming são características-chave, mas ainda sabemos muito pouco sobre a pressão do patógeno em ninhos de formigas cortadeiras no campo ([20,28], mas veja [55 ]), variação sazonal na pressão e defesa da doença [56] e os possíveis papéis dos artrópodes mirmecófilos na transmissão ou controle da doença [12]. Detecção e cognição também são susceptíveis de ser de importância fundamental, como o menor Atta as castas operárias investem mais biomassa em seus cérebros em relação aos companheiros de ninho maiores [57,58], mas permanece desconhecido se eles têm uma sensibilidade elevada a sinais que indicam infecção. Grandes trabalhadores de Ac. echinatior são melhores na discriminação entre cepas de simbiontes fúngicos do que trabalhadores médios e pequenos, consistente com a divisão de trabalho em tarefas cognitivas entre as castas de trabalhadores [59] e com tarefas de remoção de doenças que requerem tempo significativo e esforços metabólicos sendo delegados às pequenas castas de trabalhadores.

Finalmente, é intrigante que o PAA tenha evoluído repetidamente como um composto antimicótico em microrganismos (por exemplo, [42,60]) e que algumas bactérias actinomicetas do gênero Streptomyces também produzem PAA [42], enquanto outras cepas deste gênero de actinomicetos foram isoladas da cutícula de Acromyrmex formigas produtoras de outros antibióticos [22,23]. No entanto, nada se sabe sobre na Vivo dosagens eficazes de PAA quando usado como um antimicótico por formigas attine, e pouco se sabe sobre a produção quantitativa de PAA por bactérias (por exemplo, [42,60]). Em humanos, o PAA é um composto muito potente que controla patógenos em concentrações de 2 µg ml −1 [60], aumentando ainda mais a questão não resolvida de por que esse composto não é mais comum entre os attines se é tão potente para o controle de doenças fúngicas.


Regulação e especificidade da secreção antifúngica da glândula metapleural em formigas cortadeiras

As formigas têm glândulas metapleurais (MGs) emparelhadas para produzir secreções para higiene profilática. Essas glândulas exócrinas são particularmente bem desenvolvidas em formigas cortadeiras, mas não se sabe se as formigas podem regular ativamente a secreção de MG. Em um conjunto de experimentos controlados usando conídios de cinco fungos, mostramos que as formigas ajustam a quantidade de secreção de MG à virulência do fungo com o qual estão infectadas. Além disso, aplicamos volumes fixos de secreção de MG de formigas desafiadas com doses constantes de conídios em esteiras de ágar da mesma espécie de fungo. Isso mostrou que os halos de inibição foram significativamente maiores para formigas desafiadas com patógenos / ervas daninhas virulentos e leves do que para os controles e Escovopsis- formigas desafiadas. Concluímos que o sistema de defesa MG das formigas cortadeiras possui características que lembram um sistema imunológico cuticular adicional, com componentes específicos e inespecíficos, sendo alguns constitutivos e outros induzidos.

1. Introdução

As glândulas metapleurais (MGs), estruturas pareadas na margem póstero-lateral do mesosoma, são encontradas apenas em formigas e são uma das apomorfias definidoras da família Formicidae [1,2]. As secreções de MGs podem ter muitas funções, mas a produção de compostos antimicrobianos para o saneamento geral do ninho é a mais difundida e geral [3-6]. A evolução das glândulas que produzem secreções com funções profiláticas generalizadas parece uma adaptação lógica para as formigas, pois as colônias costumam ser densamente compactadas e os indivíduos interagem continuamente com o substrato do ninho (geralmente solo) e alimentos (frequentemente cadáveres), onde abundam os microrganismos [7 , 8]. Apesar de sua provável importância para a evolução e diversificação das formigas, poucos estudos investigaram os detalhes da função do MG. A cobertura taxonômica desses estudos é dispersa, e a maioria enfoca principalmente formigas com funções MG excepcionalmente derivadas [9,10].

As formigas cortadeiras (Attini) são uma exceção parcial a essa escassez de informações, pois o tamanho do reservatório MG pode ser medido com relativa facilidade e esses tamanhos mostram alometrias interessantes entre as castas operárias [11-13]. O papel antimicrobiano das secreções de MG em formigas cortadeiras é potencialmente de importância particular, porque essas formigas precisam se proteger contra entomopatógenos e seus jardins de fungos mutualistas contra parasitas e competidores [14], o que parece ter levado a MGs ampliados em Atta e Acromyrmex formigas cortadeiras [13], onde a evolução secundária do acasalamento múltiplo da rainha também permitiu que uma variação genética considerável para o tamanho do MG fosse mantida [15,16].

Estudos sobre secreções de MG em formigas atinas mostraram que a produção dessas secreções é metabolicamente cara [17], que elas contêm uma diversidade de ácidos carboxílicos de vários comprimentos de cadeia e compostos proteicos [18,19], e que seu funcionamento pode ser sujeito a trade-offs metabólicos [20,21]. No entanto, testes específicos de função antimicrobiana têm permanecido raros, principalmente devido às dificuldades técnicas de extração de quantidades muito pequenas dessas secreções glandulares [9,18,19]. Conseqüentemente, o papel antimicrobiano das secreções de MG tem geralmente sido inferido em vez de medido, ou tem se concentrado em testes de composto único, em vez da variação dependente da condição nas secreções naturais de MG [5].

Acredita-se que as secreções de MG se espalhem principalmente de forma passiva sobre a cutícula da formiga [22], mas um estudo recente de Fernández-Marín et al. [23] mostraram que a aquisição ativa de pequenas quantidades de secreção com as patas dianteiras, seguida de limpeza concentrada, ocorre frequentemente nas formigas que crescem com fungos. A maioria dos propágulos de doenças bacterianas, virais e protozoárias deve ser ingerida por formigas para se tornarem infectantes, mas fungos patogênicos entram nas formigas hospedeiras através da cutícula [8]. Isso levou à expectativa de que as secreções de MG em formigas cortadeiras possam funcionar predominantemente como defesa antifúngica, noção corroborada por Fernández-Marín. et al. [21,23], mostrando que várias espécies de attine aumentam sua taxa de catação ativa com secreção de MG após serem expostas a conídios fúngicos (esporos assexuados). As formigas também aplicam secreções de MG a infecções de fungos em jardins, após o que os fragmentos miceliais comprometidos, mas tratados, são armazenados na bolsa infrabucal (uma cavidade logo atrás do aparelho bucal da formiga), onde qualquer conídio remanescente provavelmente será morto pela mistura de MG e as secreções das glândulas labiais antes que as pelotas de detritos sejam descartadas [23,24]. No entanto, permaneceu desconhecido se qualquer aumento induzido por infecção na preparação com secreções de MG é acompanhado por um aumento na quantidade ou ajuste na potência específica das secreções.

O presente estudo examinou se as secreções de MG de Acromyrmex octospinosus As formigas cortadeiras podem ser ajustadas de acordo com os conídios fúngicos aos quais as formigas estão expostas, usando cinco espécies de fungos que representam três grandes categorias de ameaça (entomopatógeno, saprófita generalista e patógeno de fungo de jardim).

2. Material e métodos

(a) Experimentos de inoculação fúngica

Quatro colônias representativas de Acromyrmex octospinosus, coletado na Gamboa, Panamá, em 2005 (colônia Ao273) e 2007 (colônias Ao404, Ao482 e Ao492), foram usados ​​nos experimentos. As colônias foram colhidas por causa de sua similaridade de tamanho, com aproximadamente 1 litro de jardim de fungo e 50–100 grandes trabalhadores de jardim facilmente disponíveis em cada um dos episódios consecutivos de amostragem. As colônias foram mantidas em condições padronizadas em uma sala climática a 25 ° C e 70 por cento de umidade relativa na Universidade de Copenhague. Para evitar variações específicas de idade ou casta na composição das secreções de MG, usamos apenas grandes jardineiras com aproximadamente a mesma classe de idade intermediária [25].

Dois fungos entomopatogênicos (Beauveria bassiana e Metarhizium brunneum- anteriormente chamado Metarhizium anisopliae, mas agora distinguido como uma espécie irmã [26]), dois fungos saprofíticos com o potencial de causar baixa patogenicidade (Aspergillus niger e Gliocladium virens) e um parasita especializado que ataca o cultivo de fungos das formigas (Escovopsis weberi) foram escolhidos como agentes de doença. Beauveria bassiana (KVL 03-90) e M. brunneum (KVL 04-57) foram obtidos da coleção de ações do Departamento de Agricultura e Ecologia da Universidade de Copenhague, enquanto A. niger (DSM 1957) e G. virens (DSM 1963) foram adquiridos da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. o E. weberi cepa foi coletada de um A. octospinosus ninho na Gamboa por Hermogenes Fernández-Marín no início de 2010, e identificado com base em caracteres morfológicos [27].

Primeiro testamos a patogenicidade e virulência dessas cinco espécies de fungos em A. octospinosus trabalhadores inoculando formigas com conídios de fungos e monitorando sua sobrevivência. De cada colônia, coletamos uma amostra aleatória de 60 operárias principais, das quais inoculamos metade e usamos a outra metade como controle. As inoculações foram conduzidas segurando suavemente os indivíduos com um par de pinças macias esterilizadas e pipetando 2 μl de suspensão fúngica (aproximadamente 10 7 conídios ml −1) em 0,05 por cento de Triton-X (para evitar a aglomeração de conídios) no propodeum. Os indivíduos inoculados foram colocados separadamente em potes de plástico (diâmetro 2,5 cm, altura 4 cm), onde foram mantidos a 25 ° C com suprimento ad libitum de 10 por cento de sacarose. A outra metade dos trabalhadores (grupo controle) foi tratada com 2 μl de solução de Triton-X 0,05 por cento aplicada da mesma maneira. Posteriormente, a mortalidade das formigas foi avaliada diariamente durante 14 dias (dados de sobrevivência em material eletroico suplementar, tabela S1). As formigas que morreram durante este período foram esterilizadas na superfície por lavagem com 70 por cento de etanol seguido por 96 por cento de etanol para evitar o crescimento de fungos de contaminantes externos. As formigas esterilizadas na superfície foram colocadas em um pote de plástico forrado com papel de filtro úmido. Os cadáveres foram inspecionados após 10 dias para pontuar a presença ou ausência de crescimento de hifas na superfície cuticular e verificar se essas hifas produziam conídios do fungo com o qual as formigas foram inoculadas (dados de esporulação em material eletrônico suplementar, tabela S2). As inoculações de fungos e controles foram realizados simultaneamente para que a avaliação da mortalidade de formigas e as inspeções de cadáveres fossem concluídas dentro de duas semanas do início dos experimentos.

A carga de trabalho dos experimentos era tal que os tratamentos só podiam ser realizados em paralelo pela mesma pessoa (o primeiro autor) para duas colônias de cada vez. Os experimentos com colônias Ao273 e Ao404 foram, portanto, realizados seis meses antes dos experimentos com colônias Ao482 e Ao492. Essa variância de erro reduzida, visto que a variância entre as colônias pode ser parcializada em análises estatísticas subsequentes (onde acabou sendo insignificante).

Tabela 1. MANOVA de medidas repetidas, testando a eficiência inibitória das secreções da glândula metapleural de operárias principais de A. octospinosus (variável dependente) em cinco infecções fúngicas e controles, após inoculação com a mesma espécie de fungo (tratamento) e com quatro colônias diferentes como fatores independentes. Para dentro de bioensaios, damos um valor aproximado F estatísticas baseadas no lambda de Wilks entre os bioensaios, relatamos F Estatisticas.

(b) Extração e quantificação das secreções das glândulas metapleurais

Para examinar as respostas quantitativas da secreção de MG em formigas inoculadas, montamos um segundo experimento estruturado como um planejamento fatorial de medidas repetidas bidirecionais, para medir a quantidade de secreção de MG de formigas inoculadas e controle para cada uma das cinco espécies de fungos diferentes. Para inocular formigas com cada uma das cinco espécies de fungos e obter quantidades suficientes de secreções glandulares após esses tratamentos, retiramos 30 operárias principais de cada colônia por vez e as dividimos aleatoriamente em seis grupos de cinco indivíduos para serem inoculados com os cinco diferentes tipos de conídios ou para servir de controle.

O procedimento de inoculação foi como mencionado antes, mas as formigas foram mortas por congelamento em nitrogênio líquido 12 h após a inoculação, e as extrações das glândulas foram realizadas imediatamente após o abate. Mergulhar em nitrogênio líquido serve a dois propósitos em extrações glandulares: (i) para evitar o fluxo passivo ou limpeza ativa de secreções de MG durante o processo de extração, e (ii) para interromper as reações químicas de secreções de MG para que todas as secreções coletadas no reservatório ( um átrio esclerotizado onde as secreções glandulares foram armazenadas [6]) representou o mesmo estado (após inoculações de fungos ou aplicação de solução controle) no momento da extração. A quantidade de secreção foi medida perfurando o reservatório MG (externamente visível como a bolha [28]) com uma agulha muito fina de montagem de inseto, após a qual uma seringa graduada de 10 μl de Hamilton foi inserida para extrair a secreção acumulada. As secreções de ambos os reservatórios das glândulas emparelhadas foram extraídas na mesma seringa (ou seja, agrupadas), e seu volume registrado (dados de quantidade de MG em material eletrônico suplementar, tabela S3). Para garantir que todas as secreções presentes foram extraídas com nosso método, dissecamos o reservatório de uma amostra de formigas após as extrações glandulares com uma lâmina de barbear fina e examinamos o reservatório ao microscópio. Esses reservatórios foram encontrados vazios e secos [17]. Dissecções semelhantes foram realizadas em uma subamostra de formigas antes das extrações glandulares, e esses reservatórios estavam úmidos ou com secreções "escorrendo" do ponto perfurado. Os procedimentos de extração e quantificação foram feitos para todos os cinco indivíduos do mesmo grupo de tratamento em rápida sucessão (geralmente durando 10-20 min). As secreções extraídas do mesmo tratamento para todos os cinco indivíduos foram depositadas como gotículas em uma lâmina de microscópio esterilizada, após o que 10 μl da amostra combinada de secreções de MG foram coletadas e imediatamente dissolvidas em 1 ml de pentano, tampadas para evitar a evaporação e usadas para testar a qualidade dessas secreções de MG.

(c) Teste de qualidade das secreções da glândula metapleural após desafio com conídios fúngicos

A eficácia das secreções de MG em formigas inoculadas e controle foi medida com em vitro ensaios de inibição que medem a zona de inibição. Todas as cinco espécies de fungos foram cultivadas em placas de ágar batata dextrose (PDA). Os conídios (esporos assexuados nas hifas) foram colhidos, limpos e diluídos para aproximadamente 10 5 conídios ml -1, uma concentração baixa o suficiente para prevenir o supercrescimento de fungos que poderia mascarar os halos de inibição. Antes de usar as espécies fúngicas para esses bioensaios inibidores, avaliações de germinação de conídios foram realizadas para garantir que os conídios fúngicos eram viáveis. Todas as espécies de fungos tiveram mais de 90 por cento de germinação (M. brunneum 99% B. bassiana 96% A. niger 97.8% G. virens 93.6% E. weberi 91.5%).

Para alcançar um crescimento fúngico uniforme, volumes de 1 ml de suspensões de conídios fúngicos foram pipetados na superfície das placas de PDA e espalhados uniformemente usando uma espátula Drigalski. As placas de PDA foram divididas em seis segmentos iguais, e um disco de papel de filtro esterilizado (5 mm de diâmetro) foi colocado no centro de cada segmento. Cerca de 10 μl da secreção de MG agrupada extraída das formigas após a inoculação foi dissolvida em 1 ml de pentano (ver §2b) e 10 µl foram então pipetados para os discos de papel. O sexto segmento foi usado como controle e recebeu 10 μl de pentano. Para examinar se os efeitos inibidores das secreções de MG foram devidos a atividades enzimáticas, realizamos uma subamostra de ensaios de inibição (secreções de MG de formigas tratadas com M. brunneum e solução de controle) incubando as secreções de MG em banho-maria a 100 ° C por 5 min antes da aplicação para desnaturar os componentes proteicos.

Todas as placas de ágar foram incubadas a 25 ° C por 24 horas, após as quais os halos nas esteiras fúngicas causados ​​pela ação inibitória das secreções aplicadas foram medidos (ver painel na figura 3). O ensaio da zona de inibição foi replicado em dez placas de PDA para cada espécie de fungo (dados do raio do halo de inibição em material eletrônico suplementar, tabela S4).

(d) Análises estatísticas

A sobrevivência das formigas inoculadas ao longo de 14 dias foi analisada por meio de um modelo de riscos proporcionais, com colônias, tratamentos fúngicos e sua interação como efeitos principais. Indivíduos sobreviventes foram incluídos como casos censurados. As diferenças post hoc em pares entre colônias e tratamentos com fungos foram baseadas em testes de razão de risco, com o nível de significância sendo ajustado com o procedimento de Bonferroni para corrigir as comparações múltiplas. A proporção de formigas esporulantes foi analisada por meio de um modelo linear generalizado com estrutura de erro binomial, com tratamentos fúngicos e colônias como efeitos principais.

As diferenças nas quantidades de secreção de MG produzidas por formigas inoculadas com diferentes conídios fúngicos foram analisadas usando ANOVA de duas vias, testando as diferenças entre as colônias e os tratamentos fúngicos, com cada formiga fornecendo um ponto de dados que consiste em volumes de secreção combinados de seus dois MGs. No caso de significância geral, os testes de comparação múltipla post hoc de Tukey foram realizados para examinar quais tratamentos fizeram as formigas produzirem significativamente mais secreção de MG. Aproximadamente um terço dos reservatórios de MG do trabalhador foram relatados anteriormente como sendo preenchidos com secreção em condições não desafiadas [17], então presumimos que seríamos capazes de medir quaisquer aumentos de volume de secreção em relação a tais controles.

Para testar as diferenças na eficiência inibitória entre as secreções de MG de formigas inoculadas com diferentes espécies de fungos, usamos uma análise de variância multivariada de medidas repetidas (MANOVA), com área de halo de espécies de bioensaio fúngica como o conjunto de variável dependente, e espécies de fungos e colônia como variáveis ​​independentes. Isso nos permitiu avaliar se a identidade das espécies de fungos inoculados teve efeito sobre a atividade inibidora das secreções de MG e se esse efeito era específico para o fungo testado.

Para testar as diferenças na eficiência inibitória entre secreções de MG fervidas e secreções de MG não aquecidas, realizamos um teste de Student t-teste para as comparações disponíveis. As análises foram realizadas usando o software jmp (v. 9.02, SAS institute).

3. Resultados

A sobrevivência das formigas diferiu significativamente entre os tratamentos fúngicos (razão de verossimilhança, LR: χ 2 = 654,18, d.f. = 5, p & lt 0,0001), com o tratamento explicando aproximadamente 60 por cento da variação na sobrevivência (R 2 LR = 0,597). Formigas inoculadas com fungos entomopatogênicos M. brunneum e B. bassiana sofreu mortalidade consistentemente maior do que aqueles inoculados com a solução de controle. Formigas inoculadas com A. niger também sofreu consistentemente maior mortalidade do que aquelas inoculadas com a solução controle, mas mortalidade significativamente menor em comparação com formigas inoculadas com ambos os fungos entomopatogênicos (figura 1). Mortalidades de formigas inoculadas com G. virens e E. weberi não diferiu significativamente da mortalidade de formigas inoculadas com a solução de controle (figura 1), confirmando achados anteriores de E. weberi os conídios não são prejudiciais às formigas [29]. A sobrevivência geral das formigas diferiu significativamente entre as quatro colônias experimentais (LR: χ 2 = 14,47, d.f. = 3, p = 0,0023), refletindo a variação da resistência entre as colônias. Houve também uma interação significativa entre colônia e tratamento fúngico (LR: χ 2 = 36,41, d.f. = 15, p = 0,0015), refletindo diferenças pequenas, mas consistentes em como cada colônia respondeu a cada fungo (figura 1), embora a colônia e a interação entre a colônia e o tratamento explicassem menos de 5 por cento da variação na sobrevivência (R 2 LR = 0,020 e 0,049, respectivamente). A proporção de formigas mortas esporulando diferiu significativamente entre os tratamentos com fungos (LR: χ 2 = 150, d.f. = 5, p & lt 0,0001), mas não entre colônias experimentais (LR: χ 2 = 8,58, d.f. = 3, p = 1,0000). Nenhuma esporulação foi detectada para G. virens, E. weberi e tratamentos de controle, exceto pequena contaminação de fungos saprofíticos desconhecidos que também ocorreram nos controles e foram, portanto, ignorados. No entanto, todos os cadáveres de formigas expostos a B. bassiana e M. brunneum, e (dependendo da colônia) entre 33 e 63 por cento dos cadáveres de formigas expostas a A. niger, produziu conídios característicos.

Figura 1. Sobrevivência de formigas de quatro Acromyrmex octospinosus colônias (umad) desafiado com conídios de uma variedade de espécies de fungos ou uma solução de controle. Diferentes símbolos representam desafios ou controles de conídios fúngicos: círculo preenchido, um fungo entomopatogênico Metarhizium brunneum círculo aberto, um fungo entomopatogênico Beauveria bassiana triângulo preenchido, um patógeno de inseto potencialmente leve Aspergillus niger triângulo aberto, uma provável erva daninha de jardim Gliocladium virens diamante preenchido, um parasita de cultivar de formigas Escovopsis weberi e diamante aberto, uma solução de controle. Desafios fúngicos e controles marcados com a mesma letra não diferiram significativamente em sua sobrevivência (teste post hoc de Tukey usando correção de Bonferroni para tratamentos múltiplos).

Os trabalhadores das quatro colônias não diferiram significativamente nas quantidades de secreção de MG que seus grandes trabalhadores produziram (F3,120 = 0.08, p = 0,97), nem em suas respectivas respostas aos diferentes tratamentos fúngicos (F15,120 = 0.77, p = 0,70), então os dados foram agrupados para apresentação na figura 2. Houve, no entanto, diferenças significativas na quantidade de secreção de MG produzida após os diferentes tratamentos de inoculação (F5,120 = 19.45, p & lt 0,0001), com B. bassiana e M. brunneum tratamentos que provocam cerca de duas vezes mais secreção de MG em comparação com os controles. Tratamentos com A. niger, G. virens e E. weberi eliciou significativamente menos secreção do que M. brunneum e B. bassiana, e não diferiu significativamente dos controles (teste de Tukey, figura 2).

Figura 2. Histogramas mostrando as distribuições de frequência do volume de secreção da glândula metapleural extraído de operárias (n = 20) exposto a cada um dos cinco fungos e tratamentos de controle. Como não houve efeito da colônia sobre o volume de secreção, as distribuições de frequência foram feitas agrupando indivíduos de todas as quatro colônias.

Em todos os cinco grupos de tratamento e controle, extraímos em média 3,6 ± 0,1 μl (média ± s.e.) de secreção de reservatórios de MG de 120 trabalhadores. Dos tratamentos de controle, extraímos 2,3 ± 0,1 μl de secreção de reservatórios de 20 trabalhadores MG. Usando a escala de conteúdo do reservatório MG desenvolvida por Poulsen et al. [17], estimamos que estes correspondiam a reservatórios cheios de aproximadamente um terço em média, enquanto os 40 M. brunneum- e B. bassiana-as formigas desafiadas tinham 4,8 ± 0,3 μl e 4,8 ± 0,3 μl de secreção em seus respectivos reservatórios, indicando que estavam aproximadamente dois terços cheios em média. As 40 formigas inoculadas com A. niger e G. virens tinham 3,7 ± 0,1 μl e 3,0 ± 0,2 μl de secreção em seus respectivos reservatórios, o que equivale a estar quase meio preenchidos. Os 20 E. weberi As formigas inoculadas apresentaram em média 2,8 ± 0,2 μl de secreção em seus reservatórios, o que não foi significativamente diferente das formigas controle. Em nossa amostra total, quatro formigas (3%) tiveram um reservatório vazio por razões desconhecidas: uma de cada da M. brunneum, B. bassiana, G. virens e E. weberi grupo de tratamento (figura 2). Usando nossa aproximação de volume, quatro trabalhadores tiveram seu reservatório quase totalmente preenchido com secreção (aprox. 6,5 μl) - três do B. bassiana e um do M. brunneum grupo de tratamento (figura 2) - indicando uma resposta induzida à infecção por fungos entomopatogênicos.

Houve diferenças altamente significativas na eficiência da atividade antifúngica das secreções de MG de formigas tratadas com diferentes espécies de fungos (tabela 1 e figura 3). Secreções retiradas de formigas inoculadas com B. bassiana, M. brunneum, A. niger e G. virens exibiu maior atividade antifúngica em comparação com secreções de MG retiradas de E. weberi e tratamentos de controle. Não houve diferenças significativas entre as colônias na eficácia das secreções de MG ou interações entre a colônia e o tratamento com fungos, indicando que a resposta foi independente da colônia. Entre as colônias, no entanto, houve diferenças significativas na sensibilidade dos diferentes fungos às secreções de MG (tabela 1), com G. virens sendo um pouco mais sensível e B. bassiana menos sensível às secreções de MG do que as outras espécies (figura 3). Também houve uma interação significativa entre as espécies de fungos às quais as formigas operárias foram expostas e a sensibilidade do fungo às secreções de MG dessas formigas (tabela 1), que se deveu principalmente a uma resposta relativamente constante dos fungos do bioensaio à MG. secreções para controles e formigas tratadas com E. weberi, e um padrão diferente de eficácia das secreções de MG de formigas inoculadas com M. brunneum ou B. bassiana (Figura 3).

Figura 3. Atividade antifúngica das secreções das glândulas metapleurais extraídas de formigas operárias expostas a seis tratamentos e testadas em cinco tipos de bioensaios fúngicos, medida como a largura do halo em um ensaio de zona de inibição (média ± 95% CI). Secreções de glândulas metapleurais de formigas tratadas com fungos entomopatogênicos (Metarhizium brunneum e Beauveria bassiana) e fungos saprofíticos / com ervas daninhas / levemente patogênicos (Aspergillus niger e Gliocladium virens) tiveram atividades antifúngicas significativamente maiores do que aquelas tratadas com o parasita de jardim de fungos (Escovopsis weberi) e os controles. Dentro de cada bioensaio, grupos de tratamentos marcados com a mesma letra não diferiram significativamente no tamanho do halo (teste post hoc de Tukey usando correção de Bonferroni para múltiplos bioensaios). À direita, um exemplo de bioensaio de PDA é mostrado, com o raio do halo para B. bassiana marcado.

Não houve diferenças significativas na eficiência inibitória entre secreções de MG fervidas e secreções de MG não aquecidas (t = 0,94, d.f. = 1, p = 0,350 para controle fervido versus controle t = −0,77, d.f. = 1, p = 0,443 para secreções fervidas tratadas com M. brunneum inoculações versus secreções não aquecidas tratadas com M. brunneum inoculações), indicando que os ingredientes antifúngicos não eram enzimáticos. Este resultado está de acordo com um estudo anterior das propriedades antibióticas de secreção de MG em Myrmecia gulosa formigas [30].

4. Discussão

(a) Plasticidade funcional nas respostas da glândula metapleural

Infecções virulentas M. brunneum e B. bassiana entomopatógenos desencadearam tanto mais secreção de MG quanto inibição mais eficiente por unidade de secreção de MG. Esses resultados são consistentes com os do Bot et al. [5], que mostrou que tanto os conídios quanto as hifas desses patógenos são inibidos de forma semelhante por sete classes diferentes de compostos químicos das secreções de MG de A. octospinosus. O patógeno leve A. niger tem uma posição intermediária interessante, pois as infecções resultaram em secreções de MG mais potentes (figura 3), mas sem aumentar o volume da secreção (figura 2). Isso pode estar relacionado à germinação de conídios, mas não ao crescimento de hifas, de ambos A. niger e G. virens sendo menos eficientemente inibido por vários compostos na secreção de MG do que conídios dos dois entomopatógenos virulentos [5].

Enquanto autores anteriores [28,31] concluíram que formigas MGs pareciam ser um tanto desapontadoramente simples, porque nenhum músculo estava presente para regular diretamente o surgimento da secreção na superfície cuticular, nossos dados atuais sugerem que a produção de secreção de MG é notavelmente plástica e parece ser ajustado quantitativamente (figura 2) e qualitativamente (figura 3) para ameaças específicas de infecção fúngica. Dadas essas respostas condicionais, a questão agora parece quase o reverso: por que os mecanismos de liberação muscular controlados pelo comportamento para a secreção de MG não foram favorecidos pela seleção?

Nossos resultados sugerem que os MGs de formigas cortadeiras podem funcionar como análogos de um sistema imunológico profilático simples que atua na superfície cuticular de formigas operárias. Essa hipótese é baseada na evidência fornecida aqui de que as secreções de MG têm funções gerais e específicas e que sua produção é em parte constitutiva e em parte induzida. Discutiremos essa hipótese a seguir, usando uma versão modificada de um diagrama de estrutura de Schmid-Hempel & amp Ebert [32] que mapeia as defesas imunológicas ao longo dos eixos de especificidade e indutibilidade perpendiculares (figura 4). Também incluímos nosso conhecimento atual da química e função de MG em Atta formigas cortadeiras, que são o gênero irmão de Acromyrmex, mas diferente em vários traços importantes da história de vida. Usamos essa analogia com o sistema imunológico adequado porque ajuda a interpretar nossas descobertas em uma estrutura conceitual coerente enfatizando a adaptação evolutiva, não porque afirmaríamos que os mecanismos e as vias metabólicas envolvidas são semelhantes ou mesmo relacionadas aos do sistema imunológico normal de esses insetos.

Figura 4. Representação esquemática das analogias entre as funções do sistema imunológico geralmente estabelecidas e as defesas da glândula metapleural em Acromyrmex e Atta formigas cortadeiras, com referências a estudos publicados onde estavam disponíveis.O quadrante superior esquerdo refere-se a inferências hipotéticas de substâncias químicas específicas com funções higiênicas constitutivas em formigas cortadeiras que ainda precisam ser testadas quanto à sua eficácia específica.

(b) Componentes de defesa não específicos constitutivos das glândulas metapleurais da formiga cortadeira

O quadrante inferior esquerdo da figura 4 resume as funções MG antimicrobianas mais basais, que foram as primeiras a serem descobertas [3]. A atividade antimicrobiana geral provavelmente decorre da alta acidez (pH 2,5–4) das secreções de MG [3,9,30]. Essa acidez e seus efeitos na redução do pH em jardins de fungos estão bem documentados em uma série de estudos em formigas cortadeiras [5,33], e provavelmente se devem à presença abundante de ácidos orgânicos nas secreções de MG [19].

O segundo componente nesta quadratura é que pelo menos alguma secreção está normalmente presente nos MGs de todas as formigas, embora a quantidade nos reservatórios de formigas não desafiadas varie, provavelmente em função da nutrição e da idade [19], de modo que algumas formigas ( 3% em nosso estudo) acabam tendo reservatórios classificados como vazios [3,17]. Assim, quase sempre há secreção presente para as formigas trabalharem, mesmo em circunstâncias benignas, e essa defesa constitutiva equivale a cerca de um terço da capacidade máxima de retenção dos reservatórios de MG, em média [17] (figura 2).

O terceiro componente é o fornecimento direto de secreção de MG para o ambiente externo por meio da grande abertura do reservatório [6]. A falta de músculos autônomos ou comportamentais controlados para controlar a liberação da secreção [28] indica um componente de defesa constitutivo e inespecífico dos MGs.

(c) Componentes de defesa induzidos e não específicos

O quadrante inferior direito da figura 4 resume os dois mecanismos conhecidos pelos quais a aplicação da secreção de MG para defesa não específica pode ser induzida. O primeiro é a preparação ativa. A localização das aberturas MG logo acima das patas traseiras permite que as secreções sejam captadas pelos movimentos das pernas assim que emergem. Esta forma de dispersão da secreção de MG [22] é particularmente empregada quando formigas cortadeiras são desafiadas com conídios de fungos [21,23].

A frequência do MG aliciamento e o alvo da aplicação são conhecidos por variar entre Acromyrmex e Atta, com Atta aumentando substancialmente sua taxa de tratamento de MG e expandindo suas metas de tratamento para o jardim, e Acromyrmex mantendo taxas de preparação de MG muito mais baixas e visando principalmente a ninhada [21]. Isso é consistente com Atta trabalhadores confiando mais na preparação de MG e menos na produção de antibióticos por bactérias actinomicetas mutualísticas, enquanto a combinação oposta parece se aplicar em Acromyrmex [21] (ver §4d para mais detalhes).

(d) Componentes de defesa específicos induzidos

O quadrante superior direito da figura 4 resume dois mecanismos conhecidos em Acromyrmex e Atta formigas cortadeiras pelas quais a secreção de MG parece ser induzida diferencialmente, dependendo do tipo de desafio. O fato de que A. octospinosus trabalhadores aumentam significativamente a quantidade de secreção de MG somente após serem desafiados com patógenos de insetos diretamente letais, como B. bassiana e M. brunneum indica que as formigas são capazes de classificar os patógenos de acordo com o grau de ameaça a si mesmas e a seus companheiros de ninho. Os mesmos resultados (figura 2) sugerem que este processo de reconhecimento é um continuum, ao invés de uma resposta tudo ou nada, já que a quantidade de secreção de MG também foi elevada um pouco após desafios com G. virens e A. niger.

Curiosamente, a especificidade de indução também incluiu aumentos na potência da secreção de MG, e aqui as respostas foram geralmente semelhantes para todas as infecções fúngicas, exceto Escovopsis, apesar da variação na ameaça entre esses desafios (figura 3). Isso sublinha que as respostas de secreção de MG são análogas ao funcionamento do sistema imunológico, porque os desafios aumentam o investimento geral na defesa (cf. linfócitos) e induzem a produção de agentes de defesa específicos (cf. anticorpos) após o tipo de desafio ter sido identificado [34 ] Houve diferença em como as espécies de fungos responderam às secreções de MG que foram induzidas por conídios de fungos específicos (tabela 1), o que sugere que há potencial para alterar as secreções de MG para atingir ameaças específicas. No entanto, não encontramos correspondência entre as espécies de fungos que induziram uma secreção de MG em particular e a suscetibilidade dessa espécie à secreção (figura 3). A partir de nossos testes de desnaturação por calor e de um estudo anterior [30], inferimos que os compostos proteicos / enzimáticos provavelmente não serão importantes como ingredientes antifúngicos. Portanto, as identidades dos compostos que tornam a secreção de MG mais potente após as infecções permanecem desconhecidas, mas serão alvos interessantes para pesquisas futuras.

As respostas de defesa específicas obtidas em nosso presente estudo são semelhantes às obtidas por Fernández-Marín et al. [21,23], que mostrou que as taxas de aliciamento de MG em Atta colombica foram elevados quando inoculados com conídios de Metarhizium e Escovopsis mas não por controles de pó de talco inerte. Não se sabe se essa resposta é mediada por mudança quantitativa e / ou qualitativa na secreção de MG, mas parece razoável inferir que um aumento na taxa de catação só faria sentido se pelo menos a quantidade de secreção de MG disponível também aumentasse proporcionalmente. Há uma diferença significativa entre Atta e Acromyrmex nesse MG, o aliciamento no primeiro também tem uma função importante para o controle de infecção no jardim de fungos, ao passo que não é assim no último [21]. Isso é consistente com Acromyrmex manter culturas de bactérias actinomicetas em seu exoesqueleto para controlar Escovopsis infecções, enquanto Atta abandonou esta forma de controle biológico (possuída pela maioria das formigas attine basais [35]) em troca do controle químico via MG aliciamento [21]. Portanto, não é surpreendente que Atta tem defesas MG específicas induzíveis contra Escovopsis e Acromyrmex não tem.

(e) Componentes constitutivos de defesa específicos

O quadrante superior esquerdo na figura 4 representa amplamente uma 'caixa preta', mas há evidências suficientes para este componente de defesa para hipotetizar que este aspecto da analogia do sistema imunológico também é provável que seja importante em formigas que crescem em fungos [5,19 ] Existem compostos principais de secreções de MG que provavelmente se qualificam como defesas constitutivas específicas, que são diferentes em Atta e Acromyrmex apesar de outros compostos estarem presentes nas secreções de MG de ambos os gêneros [6]. O principal composto candidato em Atta é o ácido fenilacético, que constitui 72 a 80 por cento da secreção total de MG, mas está ausente na secreção de MG. Acromyrmex. Contudo, Acromyrmex A secreção de MG tem ácido indolacético (IAA) como componente principal (24-25% da secreção total), enquanto este composto é encontrado apenas em pequenas quantidades na secreção de MG de Atta. Mais trabalho será necessário para desvendar os alvos específicos desses componentes principais. O papel do IAA parece particularmente intrigante, pois este composto é um hormônio de crescimento vegetal bem conhecido [36], mas testes iniciais mostraram que ele não inibe conídios ou hifas fúngicos [5].

Foi constatado repetidamente que, além dos compostos químicos que tornam a secreção de MG ácida, há uma fração significativa de compostos proteicos de identidade desconhecida nas secreções de MG de formigas cortadeiras [3,18]. No entanto, os resultados do nosso ensaio de ebulição indicam que tais proteínas não parecem ter as funções específicas encontradas em outros insetos [37-39]. Isso sublinha que as secreções de MGs de formigas cortadeiras podem ter uma combinação de características adaptativas específicas apenas para esse clado de formigas.


Métodos

Locais de estudo e espécies

No Peru, coletamos formigas em vários habitats no Centro de Investigación y Capacitación Rio Los Amigos (“CICRA,” 12 ° 34′S, elevação 70 ° 05′W

270 m), que é uma estação biológica localizada na confluência dos rios Madre de Dios e Los Amigos. Ao redor da estação está a concessão de conservação Los Amigos, que compreende 146.000 ha de floresta tropical primária em uma mistura de terraços de terras altas e várzeas. A precipitação anual em Los Amigos é entre 2700 e 3000 mm, com mais de 80% da precipitação caindo durante a estação chuvosa de outubro a abril (Pitman 2008). As temperaturas médias mensais variam de 21 a 26 ° C e a umidade média é de 87% (Pitman 2008). No Canadá, coletamos formigas da Reserva Científica Koffler em Jokers Hill ("KSR," 44 ° 02′N, elevação 79 ° 32′W

300 m) e em outras partes da área da grande Toronto. A precipitação anual no sul de Ontário é em média de 790 mm e as temperaturas médias mensais variam de -6 ° C em janeiro a 21 ° C em julho (Environment Canada, Canadian Climate Normals 1971-2000).

Excluindo as imaturas, coletamos operárias vivas (menores apenas em espécies polimórficas), ginos e machos virgens de nove espécies de formigas (Tabela 1) para uso em ensaios de sobrevivência. As formigas foram trazidas de volta ao laboratório e mantidas em recipientes de plástico, alimentadas com dieta artificial padrão (Bhatkar e Whitcomb 1970) e com água por meio de um pedaço de algodão úmido. Todas as formigas foram testadas dentro de 24 horas após a coleta. No Peru, coletamos manualmente formigas arbóreas de colmos de bambu (Camponotus mirabilis e C. longipilis) e das hastes ocas de mirmecofítico Cordia nodosa árvores (Allomerus octoarticulatus e uma espécie não identificada e possivelmente não descrita de Azteca) Também coletamos colônias de Odontomachus Bauri de madeira ou solo em decomposição. No Canadá, coletamos colônias de quatro espécies de formigas terrestres: Aphaenogaster cf. Rudis e Lasius cf. nearcticus de madeira em decomposição e Myrmica rubra e Brachymyrmex depilis do solo. Escolhemos essas espécies de formigas porque elas tinham várias colônias produzindo alados no momento de nosso estudo. Elas não são uma amostra aleatória de toda a filogenia de formigas, mas não temos razão para pensar que diferem sistematicamente de outras formigas no que diz respeito a características relacionadas à imunidade . Todas as colônias continham operárias e pelo menos um dos sexos alternativos (às vezes ambos). Como a proporção de sexo dividido ocorre em muitas espécies de formigas, algumas colônias podem conter apenas ginos ou machos em um determinado momento (Meunier et al. 2008).

Subfamília Espécies Tipo de ninho Colônias Formigas em fungos, tratamentos de controle Comprimento médio do corpo, mm (repetições)
Trabalhadores Gynes Machos Trabalhadores Gynes Machos
Peru
Myrmicinae Allomerus octoarticulatus Arbóreo 6 36, 35 10, 10 22, 22 1.72 (12) 5.46 (7) 4.79 (6)
Dolichoderinae Azteca sp. Arbóreo 2 11, 12 0, 0 9, 9 2.42 (15) 1.9 (16)
Formicinae Camponotus mirabilis Arbóreo 6 27, 27 9, 7 23, 23 5.92 (12) 12.25 (8) 5.99 (4)
Formicinae Camponotus longipilis Arbóreo 4 14, 13 8, 8 10, 10 7.42 (7) 10.54 (1) 6.76 (3)
Ponerinae Odontomachus Bauri Solo 4 26, 26 13, 12 4, 4 5.53 (17) 6.37 (4) 4.16 (6)
Canadá
Myrmicinae Aphaenogaster cf. Rudis Solo 7 43, 39 37, 37 18, 16 3.29 (15) 5.17 (5) 3.54 (12)
Formicinae Brachymyrmex depilis Solo 2 12, 12 11, 9 6, 6 1.05 (5) 2.99 (5) 1.47 (5)
Formicinae Lasius cf. nearcticus Solo 2 12, 12 10, 10 12, 12 2.61 (12) 4.95 (5) 2.88 (21)
Myrmicinae Myrmica rubra uma uma Espécies exóticas.
Solo 2 30, 30 0, 0 26, 27 3.36 (15) 3.52 (17)

Ensaios de sobrevivência

Nós expusemos formigas ao fungo entomopatogênico generalista, Beauveria bassiana, que infecta mais de 200 espécies de artrópodes e tem sido usada em outros estudos de imunidade às formigas (Feng et al. 1994 Diehl e Junqueira 2001 Schmidt et al. 2011). Beauveria bassiana não é usado ativamente como inseticida em nossos locais de campo (CICRA: M. Frederickson, pers. obs. KSR: A. Weis, com. pess.). Extraímos conídios do inseticida comercial Botanigard ES (cepa GHA) cultivando primeiro uma suspensão em placas de ágar sabouraud dextrose 6,5% em um ambiente escuro. Para evitar a contaminação por outros produtos químicos no Botanigard ES, os conídios dessas placas iniciais não foram usados ​​diretamente. Em vez disso, coletamos esses conídios e os cultivamos em novas placas. Os conídios originados dessas placas secundárias foram usados ​​para ensaios de sobrevivência. Suspendemos os conídios em uma solução a 0,05% do surfactante Triton X-100 [Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada]. Contamos as densidades de conídios usando um hemocitômetro e diluímos a suspensão para uma concentração de 1 × 10 7 conídios / mL. Esse procedimento foi realizado diariamente para garantir um novo suprimento de conídios. As suspensões de conídios foram verificadas quanto à viabilidade, plaqueando-as em placas de ágar sabouraud dextrose a 6,5%. Nos tratamentos fúngico e controle, respectivamente, colocamos 0,5 µL da suspensão de conídios ou a mesma quantidade de solução 0,05% do surfactante somente em formigas torácicas.

O número de operárias e alados coletados em cada colônia variou de acordo com a quantidade disponível. Usamos números aproximadamente iguais de cada casta (isto é, trabalhadores, machos, ginecos) para os tratamentos com fungos e controle (Tabela 1). Para duas espécies, Azteca sp. e M. rubra, não conseguimos coletar ginecos (Tabela 1). Todos os indivíduos dentro de uma colônia foram expostos à mesma suspensão fúngica e a mesma suspensão foi usada para colônias e espécies coletadas na mesma data. Colocamos cada formiga tratada com fungo ou de controle em um tubo falcon de 50 mL e mantivemos os tubos em temperatura ambiente (no Peru,

18–33 ° C) ou em câmaras ambientais (no Canadá, L14: ciclo de luz D10, 15–25 ° C). As formigas foram alimentadas com uma dieta artificial padrão (Bhatkar e Whitcomb 1970) e fornecida com água por meio de um pedaço de algodão úmido. Monitoramos as formigas todos os dias durante 14 dias, registrando o dia da morte, caso ocorresse nesse período. Depois que uma formiga morreu, ela foi removida de seu tubo falcon e colocada em um tubo de microcentrífuga de 2 mL com um pequeno pedaço de algodão úmido para manter o ambiente úmido. Em seguida, monitoramos as formigas mortas para o crescimento do fungo diariamente por 7 dias. Mais de 95% das formigas que morreram no tratamento com fungos e apenas 1% das formigas que morreram no tratamento de controle B. bassiana hifas crescendo de seus cadáveres em 7 dias. Isso sugere que as diferenças na sobrevivência entre os tratamentos foram devido a B. bassiana exposição. No total, monitoramos a sobrevivência de 445 formigas tratadas com fungo e 434 formigas controle.

Tamanho do corpo

Medimos o tamanho do corpo das formigas em um conjunto diferente de indivíduos das formigas usadas nos ensaios de sobrevivência, mas todas foram coletadas ao mesmo tempo e nos mesmos locais. Sob um microscópio de dissecação Leica M205 com um micrômetro digital, medimos o comprimento máximo da cabeça, mesossoma, pecíolo e gaster de cada formiga e, em seguida, somamos para obter uma medida do comprimento do corpo. O número de indivíduos por casta por espécie variou de 1 a 20 (Tabela 1). Embora essas medidas não sejam dos indivíduos usados ​​nos testes de sobrevivência, não temos razão para esperar vieses no tamanho do corpo entre as formigas usadas nos testes e as formigas usadas para as medições de tamanho.

Análise estatística

Avaliamos a variação entre trabalhadores, ginetes e homens na suscetibilidade a B. bassiana apenas para espécies nas quais o tratamento com fungos afetou significativamente a mortalidade de formigas. Testamos se o tratamento com fungos afetou significativamente a mortalidade de todas as nove espécies de forma independente usando um modelo de risco proporcional de Cox, com casta, tratamento e colônia como efeitos principais. Descobrimos que o tratamento com fungos não teve efeito significativo sobre Azteca sp. e L. nearcticus mortalidade. Nós verificamos isso realizando um teste de razão de verossimilhança entre o modelo completo e um modelo com apenas casta e colônia (tratamento fúngico removido) para essas duas espécies. O modelo completo não forneceu um melhor ajuste para os dados em Azteca sp. (P = 0,1564) ou L. nearcticus (P = 0,4039). Esta falta de resposta é largamente atribuída à alta mortalidade de linha de base de machos em ambas as espécies (3,33 dias em Azteca sp. e 4 dias em L. nearcticus, respectivamente), o que restringe grandemente o tamanho do efeito potencial do tratamento fúngico. Nosso estudo não seria capaz de avaliar adequadamente a variação na suscetibilidade entre as castas para qualquer uma das espécies e, portanto, elas foram removidas de análises posteriores.

Para as sete espécies restantes (C. mirabilis, C. longipilis, A. octoarticulatus, O. bauri, M. rubra, A. rudis, e B. depilis), usamos a análise de sobrevivência para analisar nossos dados, com o modelo de riscos proporcionais de Cox censurado em 14 dias. O tratamento, a casta e as espécies foram incluídos como principais locais de efeitos de origem (Peru ou Canadá), colônia de origem e tipo de ninho (arbóreo ou terrestre) foram incluídos como fatores aleatórios, mas não foram preditores significativos de sobrevivência e foram removidos do modelo final. Os coeficientes de regressão para todas as interações de três vias (tratamento × casta × espécies) não foram significativos no modelo completo, portanto, incluímos apenas as interações de duas vias no modelo final (ou seja, tratamento × casta, tratamento × espécies e casta × espécies). Um teste de razão de probabilidade de log indicou que o modelo completo, incluindo interações de três vias, não melhorou o ajuste do modelo, em comparação com um modelo com apenas termos de interação de duas vias (P = 0,122). Também criamos curvas de Kaplan-Meier para cada casta com o tratamento como o fator principal. Ao contrário do nosso modelo estatístico principal, ele agrupa todas as espécies, mas mesmo assim fornece uma visualização útil dos resultados.

Calculamos taxas de risco (HR) a partir dos coeficientes na regressão de Cox. A taxa de risco representa a probabilidade de um grupo morrer em relação a outro grupo em qualquer momento. Valores acima de um indicam risco elevado de morrer, enquanto valores abaixo de um indicam o contrário. Usamos apenas coeficientes de regressão significativos no nível ≤0,05. Ao calcular o HR de ginetes ou homens em relação aos trabalhadores no tratamento de controle, podemos determinar se a mortalidade basal diferiu entre as castas. No entanto, estamos mais interessados ​​em saber se a mortalidade devido ao tratamento fúngico diferiu entre as castas. Para examinar isso, calculamos o tratamento-HR (HRtrt), que é o HR do grupo tratado com fungo em relação ao grupo de controle para cada casta e espécie individualmente. Isso leva em consideração quaisquer diferenças na mortalidade de linha de base entre castas e espécies. Podemos então fazer uma comparação entre o RHtrt valores para determinar se eles diferiram entre as castas dentro de uma espécie (Altman e Bland 2003). Diferenças significativas em RHtrt indicam que o tratamento com fungo teve efeitos diferentes nas castas, sugerindo diferenças na imunidade das castas.

Por fim, investigamos a relação entre tamanho corporal e imunidade. Como mencionado anteriormente, o tamanho do corpo foi medido a partir de um conjunto diferente de formigas coletadas das mesmas colônias usadas para os ensaios de sobrevivência e, portanto, não pode ser incorporado diretamente na análise de sobrevivência. Para investigar se o tamanho corporal é um preditor de imunidade, usamos Ln (HRtrt) como um proxy para imunocompetência. Ajustamos uma ANCOVA com tamanho médio do corpo, casta e espécie como efeitos principais para determinar se estes são preditores significativos de Ln (HRtrt) Devido a limitações no poder estatístico, não foi possível criar um modelo completo que contabilizasse todas as interações bidirecionais e tridirecionais. Em vez disso, ajustamos os dados a dois modelos separados. Modelo 1: principais efeitos e efeitos de interação do tamanho do corpo e casta com a espécie como co-fator. Modelo 2: principais efeitos e efeitos de interação do tamanho do corpo e espécies com a casta como co-fator. No entanto, a eliminação reversa removeu os efeitos de interação de ambos Modelo 1 e Modelo 2. Os testes de razão de probabilidade logarítmica favoreceram um modelo reduzido sem efeitos de interação no tamanho do corpo x casta (Modelo 1 P = 0,475) e no tamanho do corpo x espécie (Modelo 2 P = 0,826). Nós relatamos os resultados deste modelo reduzido. Também relatamos correção de Bonferroni P-valores para contabilizar o uso de RHtrt em vários testes.

Para todas as análises, usamos os pacotes para download, Sobrevivência e ggplot2, no software estatístico R (R Development Core Team RFFSC 2013).


Por que as feridas infeccionam?

As feridas cicatrizam melhor quando estão limpas e livres de germes. Normalmente, muitos germes vivem inofensivamente em nossa pele e no ambiente ao nosso redor. Normalmente, os germes vivem em nossa pele ou em áreas como nosso nariz, sem causar problemas.

Normalmente, a pele atua como uma barreira. Se a pele estiver rachada, os germes podem se espalhar para os tecidos mais sensíveis abaixo. É assim que uma infecção pode começar. Isso torna os tecidos inflamados e inchados e menos propensos a cicatrizar. Feridas abertas têm maior probabilidade de desenvolver infecções do que feridas fechadas. Isso ocorre porque a fissura na pele fornece um caminho para os germes viajarem de fora para dentro.

Algumas circunstâncias tornam mais provável que as feridas infeccionem. Esses incluem:

  • Se você tem diabetes tipo 1 ou tipo 2.
  • Se o objeto que causou o ferimento estava sujo e continha germes.
  • Se o ferimento foi causado por uma mordida humana ou animal.
  • Se a ferida ainda contiver um 'corpo estranho', ou seja, pedaços do que quer que tenha causado a lesão. Por exemplo, pedaços de vidro, lascas de madeira, espinhos, etc.
  • O tamanho e a profundidade da ferida. Feridas maiores ou mais profundas têm maior chance de infectar.
  • Bordas recortadas da ferida.
  • Se as devidas precauções não foram tomadas antes de uma operação.
  • Se você for uma pessoa idosa. Sua pele cicatriza menos à medida que você envelhece.
  • Se você está muito acima do peso.
  • Se o seu sistema imunológico não funcionar tão bem como normal. Por exemplo, se você está tomando medicamentos como esteróides ou quimioterapia, ou se você tem HIV / AIDS.

Os usos medicinais de insetos e outros artrópodes em todo o mundo foram revisados ​​por Meyer-Rochow, [1] que fornece exemplos de todos os principais grupos de insetos, aranhas, vermes e moluscos e discute seu potencial como fornecedores de componentes bioativos. O uso de insetos (e aranhas) para tratar várias doenças e ferimentos tem uma longa tradição e, tendo resistido ao teste do tempo, pode ser eficaz e fornecer resultados. No entanto, às vezes a "lógica" folclórica-medicinal era baseada na Doutrina das Assinaturas = "deixe os gostos serem curados pelos gostos" e tinha, se algum, pouco mais do que um efeito psicológico. Por exemplo, para tratar casos de prisão de ventre, besouros de esterco foram prescritos para reduzir os insetos que ajudavam as tarântulas peludas. Parecia o tratamento certo para queda de cabelo e larvas gordas semelhantes ao membro inchado causado pelo parasita Wuchereria bancrofti deveriam ajudar na elefantíase sofredor. Um organismo com partes que se assemelham a partes do corpo humano, animais ou outros objetos era considerado como tendo uma relevância útil para essas partes, animais ou objetos. Assim, por exemplo, os fêmures de gafanhotos, que se dizia assemelhar-se ao fígado humano, eram usados ​​para tratar doenças hepáticas pelos povos indígenas do México. [2] Essa doutrina é comum em toda a medicina tradicional e alternativa, mas é mais proeminente onde as tradições médicas são amplamente aceitas, como na medicina tradicional chinesa e no Ayurveda, e menos pela medicina comunitária e familiar, como é mais comum em partes da África.

Medicina tradicional chinesa Editar

A medicina tradicional chinesa inclui o uso de fitoterápicos, acupuntura, massagem, exercícios e terapia dietética. É um componente típico da assistência médica moderna em todo o Leste Asiático e em algumas partes do Sudeste Asiático (como a Tailândia). Os insetos são comumente incorporados como parte do componente fitoterápico da medicina tradicional chinesa, e suas propriedades médicas e aplicações são amplamente aceitas e acordadas. Seguem alguns exemplos breves:

A Formiga-da-Montanha-Negra Chinesa, Polyrhachis vicina, supostamente age como uma cura para todos e é amplamente utilizado, especialmente por idosos. Diz-se que prolonga a vida, tem propriedades anti-envelhecimento, reabastece o Qi e aumenta a virilidade e a fertilidade. O interesse recente nas qualidades medicinais das formigas levou pesquisadores britânicos a estudar o potencial do extrato para servir como um agente de combate ao câncer. [3] [ citação médica necessária O extrato de formiga da montanha negra chinesa é normalmente consumido misturado com vinho.

Índia e Ayurveda Editar

Ayurveda é um antigo tratamento tradicional indiano quase universalmente incorporado ao lado da medicina ocidental como um componente típico do tratamento médico na Índia. Embora a medicina ayurvédica geralmente seja eficaz, as doses podem ser inconsistentes e, às vezes, estar contaminadas com metais pesados ​​tóxicos. [4] Alguns exemplos breves a seguir:

Diz-se que o cupim cura uma variedade de doenças, tanto específicas quanto vagas. Normalmente, o monte ou uma parte do monte é desenterrado e os cupins e os componentes arquitetônicos do monte são moídos em uma pasta que é então aplicada topicamente nas áreas afetadas ou, mais raramente, misturada com água e consumida. [5] Esse tratamento curava úlceras, doenças reumáticas e anemia. [4] Também foi sugerido ser um analgésico geral e melhorador de saúde. [4]

O Jatropha Leaf Miner, um lepidóptero que se alimenta preferencialmente de Jatropha, é um exemplo de uma importante praga agrícola de insetos que também é um remédio medicinal. [5] As larvas, que também são a forma do inseto com maior impacto econômico na agricultura, são colhidas, fervidas e amassadas em uma pasta que é administrada topicamente e que induz a lactação, reduz a febre e acalma o trato gastrointestinal . [5]

Africa Edit

Ao contrário da China e da Índia, a medicina tradicional para insetos na África é extremamente variável. É amplamente regional, com poucos, se houver, acordos importantes sobre quais insetos são úteis como tratamento para essas doenças. [5] A maioria dos tratamentos medicinais para insetos são passados ​​através das comunidades e famílias, ao invés de serem ensinados em ambientes universitários, como a Medicina Tradicional Chinesa e o Ayurveda às vezes são, além disso, a maioria das práticas da medicina tradicional necessita de uma pessoa no papel de "curador". [5] Alguns exemplos breves a seguir:

O gafanhoto é comumente consumido como iguaria e uma excelente fonte de proteína e é consumido para fins medicinais. [5] Esses insetos são normalmente coletados, secos ao sol e, em seguida, transformados em pó. [5] O pó pode então ser transformado em uma pasta quando misturado com água e cinzas e aplicado na testa para aliviar a dor de fortes dores de cabeça. [5] Além disso, as próprias dores de cabeça podem ser evitadas por um "curador" inserindo a pasta sob a pele na nuca da pessoa afetada. [5]

Os cupins também são usados ​​em partes da África, assim como na Índia. [4] Partes do monte são desenterradas, fervidas e transformadas em uma pasta, que pode então ser aplicada em feridas externas para prevenir infecções ou consumida para tratar hemorragias internas. [5] cupins são usados ​​não apenas como uma forma de medicamento, mas também como um dispositivo médico. Se um "curandeiro" quiser inserir um medicamento por via subcutânea, ele frequentemente espalhará esse medicamento na pele do paciente e, em seguida, agitará um cupim e colocará o inseto na pele do paciente. [5] Quando o cupim morde, suas mandíbulas funcionam efetivamente como um dispositivo de injeção. [5]

Edição das Américas

As Américas foram mais influenciadas pela Doutrina das Assinaturas do que a China, Índia ou África, muito provavelmente por causa de sua história colonial com a Europa. A maior parte do uso de insetos na medicina está associado à América Central e partes da América do Sul, ao invés da América do Norte, e a maior parte é baseada nas técnicas médicas dos povos indígenas. [2] Atualmente, a medicina contra insetos é praticada muito mais raramente do que na China, Índia ou África, embora ainda seja relativamente comum em áreas rurais com grandes populações indígenas. [2] Alguns exemplos a seguir:

Chapulines, ou gafanhotos, são comumente consumidos como um prato regional torrado em algumas partes do México, mas também são usados ​​medicinalmente. [2] Eles servem como diuréticos para tratar doenças renais, reduzir o inchaço e aliviar a dor de distúrbios intestinais quando são consumidos. [2] No entanto, existem alguns riscos associados ao consumo de chapulinas, já que são conhecidos por abrigar nematóides que podem ser transmitidos aos humanos após o consumo.

Assim como os cupins da África, as formigas às vezes eram usadas como dispositivos medicinais pelos povos indígenas da América Central. [2] O molde do soldado da formiga do exército seria coletado e usado como suturas vivas pelos maias. [2] Isso envolvia agitar uma formiga e segurar suas mandíbulas até as bordas da ferida quando ela mordia, o tórax e o abdômen eram removidos, deixando a cabeça segurando a ferida. [2] As secreções das glândulas salivares da formiga tinham a reputação de ter propriedades antibióticas. [2] O veneno da formiga colhedora vermelha foi usado para tratar reumatismo, artrite e poliomielite por meio da reação imunológica produzida por sua picada. Essa técnica, na qual as formigas podem picar as áreas afetadas de maneira controlada, ainda é usada em algumas áreas rurais áridas do México. [2]

O bicho-da-seda, Bombyx mori, também foi comumente consumido como alimento regional e para fins medicinais na América Central, depois que foi trazido para o Novo Mundo pelos espanhóis e portugueses. [2] Apenas os imaturos são consumidos. As pupas fervidas eram comidas para tratar apoplexia, afasia, bronquite, pneumonia, convulsões, hemorragias e micção frequente. [2] O excremento produzido pelas larvas também é comido para melhorar a circulação e aliviar os sintomas da cólera (vômitos intensos e diarreia). [2]

Produtos para abelhas Editar

Os produtos da abelha melífera são usados ​​medicinalmente na Ásia, Europa, África, Austrália e nas Américas, apesar do fato de que a abelha melífera não foi introduzida nas Américas até a colonização pela Espanha e Portugal. Eles são, de longe, o produto medicinal de insetos mais comum, tanto histórica quanto atualmente. [5]

O mel é o material médico para abelhas mais frequentemente referido. Pode ser aplicado na pele para tratar cicatrizes excessivas, erupções cutâneas e queimaduras, [6] e pode ser aplicado como cataplasma nos olhos para tratar infecções. [4] Também é consumido para problemas digestivos e como restaurador geral da saúde, e pode ser aquecido e consumido para tratar resfriados, tosse, infecções de garganta, laringite, tuberculose e doenças pulmonares. [2]

Além disso, a apitoxina, ou veneno de abelha melífera, pode ser aplicada por meio de picadas diretas para aliviar a artrite, reumatismo, polineurite e asma. [2] Própolis, uma mistura resinosa e cerosa coletada por abelhas e usada como isolante e selante de colmeias, é frequentemente consumida por mulheres na menopausa por causa de seu alto teor de hormônios, e dizem ter propriedades antibióticas, anestésicas e antiinflamatórias . [2] A geléia real é usada para tratar anemia, úlceras gastrointestinais, arteriosclerose, hipo e hipertensão e inibição da libido sexual. [2] Por fim, o pão de abelha, ou pólen de abelha, é consumido geralmente como um restaurador para a saúde e, acredita-se, ajuda a tratar infecções internas e externas. [2] Todos esses produtos das abelhas são produzidos e vendidos regularmente, especialmente online e em lojas de alimentos saudáveis, embora nenhum ainda tenha sido aprovado pelo FDA.

Embora os insetos tenham sido amplamente usados ​​ao longo da história para tratamento médico em quase todos os continentes, relativamente pouca pesquisa médica entomológica foi conduzida desde o advento revolucionário dos antibióticos. A forte dependência de antibióticos, juntamente com o desconforto com insetos na cultura ocidental, limitou o campo da farmacologia de insetos até que o surgimento de infecções resistentes a antibióticos desencadeou pesquisas farmacêuticas para explorar novos recursos. Os artrópodes representam uma fonte rica e amplamente inexplorada de novos compostos medicinais. [7]

Terapia com larvas Editar

A terapia com larvas é a introdução intencional de larvas de mosca (larvas) vivas e desinfetadas em feridas de tecidos moles para limpar seletivamente o tecido necrótico. Isso ajuda a prevenir infecções e também acelera a cicatrização de feridas e úlceras cronicamente infectadas. [8] Cirurgiões militares desde a antiguidade clássica notaram que feridas que não foram tratadas por vários dias, e que foram infestadas com vermes, cicatrizaram melhor do que feridas não tão infestadas. [9] As larvas secretam vários produtos químicos que matam micróbios, incluindo alantoína, ureia, ácido fenilacético, fenilacetaldeído, carbonato de cálcio, enzimas proteolíticas e muitos outros. [10]

Larvas eram usadas para curar feridas pelos maias e pelos australianos indígenas. Mais recentemente, eles foram usados ​​na Renascença na Europa, nas Guerras Napoleônicas, na Guerra Civil Americana e na Primeira e Segunda Guerras Mundiais. [11] [12] Ele continua a ser usado na medicina militar. [13]

Edição de apiterapia

A apiterapia é o uso medicinal de produtos das abelhas, como mel, pólen, pão de abelha, própolis, geléia real e veneno de abelha. Um dos principais peptídeos do veneno de abelha, chamado Melitina, tem potencial para tratar a inflamação em pessoas que sofrem de artrite reumatóide e esclerose múltipla. A melitina bloqueia a expressão de genes inflamatórios, reduzindo o inchaço e a dor. É administrado por picada direta de inseto ou injeções intramusculares. Os produtos apícolas demonstram uma ampla gama de fatores antimicrobianos e em estudos de laboratório e demonstraram matar bactérias resistentes a antibióticos, células cancerosas pancreáticas e muitos outros micróbios infecciosos. [14]

Besouro-bolha e mosca espanhola Editar

A mosca espanhola é um besouro verde-esmeralda, Lytta vesicatoria, na família do besouro da bolha (Meloidae). Ele e outras espécies semelhantes eram usadas em preparações oferecidas por boticários tradicionais. O inseto é a fonte do terpenóide cantharidina, um agente de formação de bolhas tóxico que já foi usado como afrodisíaco. [15] [16]

Insetos que se alimentam de sangue Editar

Muitos insetos que se alimentam de sangue, como carrapatos, mutucas e mosquitos, injetam vários compostos bioativos em suas presas. Esses insetos têm sido usados ​​por praticantes da Medicina Oriental há centenas de anos para prevenir a formação de coágulos sanguíneos ou trombose. [17] No entanto, a pesquisa médica moderna só recentemente começou a investigar o potencial de desenvolvimento de drogas da saliva de insetos que se alimentam de sangue. Esses compostos na saliva de insetos que se alimentam de sangue são capazes de aumentar a facilidade de alimentação do sangue, evitando a coagulação das plaquetas ao redor da ferida, e fornecem proteção contra a resposta imune do hospedeiro. Atualmente, mais de 1280 famílias de proteínas diferentes foram associadas à saliva de organismos que se alimentam de sangue. [18] Esta gama diversificada de compostos pode incluir: [14] [19]

  • inibidores da agregação plaquetária, ADP, ácido araquidônico, trombina e PAF.
  • anticoagulantes
  • vasodilatadores
  • vasoconstritores
  • anti-histamínicos
  • bloqueadores do canal de sódio
  • inibidores de complemento
  • formadores de poros
  • inibidores da angiogênese
  • anestésicos
  • AMPs e moléculas de reconhecimento de padrões microbianos.
  • Potenciadores / ativadores de parasitas

Atualmente, algum progresso preliminar foi feito com a investigação das propriedades terapêuticas do peptídeo anticoagulante do carrapato (TAP) e Ixolaris, um novo inibidor da via do fator tecidual recombinante (TFPI) da glândula salivar do carrapato, Ixodes scapularis. [20] Além disso, o Ixolaris, um inibidor do fator tecidual, demonstrou bloquear o crescimento do tumor primário e a angiogênese em um modelo de glioblastoma. [21] Apesar do forte potencial desses compostos para uso como anticoagulantes ou drogas imunomoduladoras, nenhum medicamento moderno, desenvolvido a partir da saliva de insetos sugadores de sangue, está atualmente no mercado. [14]

Como as plantas e os insetos, os aracnídeos também são usados ​​há milhares de anos nas práticas médicas tradicionais. As pesquisas científicas recentes sobre fatores bioativos naturais aumentaram, levando a um interesse renovado nos componentes do veneno em muitos animais. Em 1993, a margatoxina foi sintetizada a partir do veneno do Centruroides margaritatus o escorpião da casca da América Central. É um peptídeo que inibe seletivamente os canais de potássio dependentes de voltagem. Patenteado pela Merck, tem o potencial de prevenir a hiperplasia neointimal, uma causa comum de falha do enxerto de bypass. [22]

Além dos usos médicos dos compostos de defesa dos aracnídeos, uma grande quantidade de pesquisas foi recentemente direcionada à síntese e ao uso da seda da aranha como um andaime para a geração de ligamentos. A seda da aranha é um material ideal para a síntese de enxertos de pele médica ou implantes de ligamentos porque é uma das fibras naturais mais fortes conhecidas e desencadeia pouca resposta imunológica em animais. Seda de aranha também pode ser usada para fazer suturas finas para costurar nervos ou olhos para cicatrizar com poucas cicatrizes. Os usos médicos da seda de aranha não são uma ideia nova. As sedas de aranha têm sido usadas há milhares de anos para combater infecções e curar feridas. Esforços para produzir quantidades e qualidades industriais de seda de aranha em leite de cabra transgênico estão em andamento. [23] [24]

Edição de escorpiões psicoativos

Notícias recentes [25] afirmam que o uso de escorpiões para fins psicoativos está ganhando popularidade na Ásia. Supõe-se que viciados em heroína no Afeganistão fumam escorpiões secos ou usam picadas de escorpião para ficarem chapados quando a heroína não está disponível. O uso de escorpiões como droga psicoativa supostamente dá uma alta instantânea tão forte ou mais forte que a heroína. No entanto, há poucas informações sobre os efeitos de longo prazo do uso de toxinas de escorpião. [26] A 'mania da picada de escorpião' também aumentou na Índia, com uma disponibilidade decrescente de outras drogas e álcool para os jovens. [27] Os jovens estão supostamente migrando para as margens das estradas, onde podem comprar picadas de escorpião que, após vários minutos de dor intensa, supostamente produzem uma sensação de bem-estar de seis a oito horas. [28]


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Resumo do capítulo

Os fungos são organismos eucarióticos que apareceram na terra há mais de 450 milhões de anos, mas claramente têm uma história evolutiva muito maior. Eles são heterótrofos e não contêm pigmentos fotossintéticos, como clorofila, nem organelas, como cloroplastos.Os fungos que se alimentam de matéria em decomposição e morta são denominados sapróbios. Os fungos são decompositores importantes que liberam elementos essenciais no meio ambiente. Enzimas externas chamadas exoenzimas digerem nutrientes que são absorvidos pelo corpo do fungo, o que é chamado de talo. Uma espessa parede celular feita de quitina envolve a célula. Os fungos podem ser unicelulares como leveduras ou desenvolver uma rede de filamentos chamada micélio, que geralmente é descrito como bolor. A maioria das espécies se multiplica por ciclos reprodutivos assexuados e sexuais. Em um grupo de fungos, nenhum ciclo sexual foi identificado. A reprodução sexual envolve plasmogamia (fusão do citoplasma), seguida de cariogamia (fusão de núcleos). Seguindo esses processos, a meiose gera esporos haplóides.

24.2 Classificações de Fungos

Chytridiomycota (quitrídeos) são considerados o grupo de fungos mais ancestral. Eles são principalmente aquáticos e seus gametas são as únicas células fúngicas conhecidas por terem flagelos. Eles se reproduzem sexualmente e assexuadamente, os esporos assexuados são chamados de zoósporos. Zygomycota (fungos conjugados) produzem hifas não septadas com muitos núcleos. Suas hifas se fundem durante a reprodução sexuada para produzir um zigosporo em um zigosporângio. Ascomycota (fungos do saco) formam esporos em sacos chamados asci durante a reprodução sexual. A reprodução assexuada é a forma mais comum de reprodução. Nos Basidiomycota (fungos club), a fase sexual predomina, produzindo corpos frutíferos vistosos que contêm basídios em forma de clube, dentro dos quais se formam esporos. A maioria dos cogumelos familiares pertence a esta divisão. Fungos que não têm ciclo sexual conhecido foram originalmente classificados na “forma filo” Deuteromycota, mas muitos foram classificados por análise molecular comparativa com Ascomycota e Basidiomycota. Os glomeromycota formam associações estreitas (chamadas de micorrizas) com as raízes das plantas.

24.3 Ecologia de Fungos

Os fungos colonizaram quase todos os ambientes da Terra, mas são freqüentemente encontrados em locais frios, escuros e úmidos com um suprimento de material em decomposição. Os fungos são sapróbios que decompõem matéria orgânica. Muitos relacionamentos mutualísticos bem-sucedidos envolvem um fungo e outro organismo. Muitos fungos estabelecem associações micorrízicas complexas com as raízes das plantas. Algumas formigas cultivam fungos como fonte de alimento. Os líquenes são uma relação simbiótica entre um fungo e um organismo fotossintético, geralmente uma alga ou cianobactéria. O organismo fotossintético fornece energia a partir de carboidratos armazenados, enquanto o fungo fornece minerais e proteção. Alguns animais que consomem fungos ajudam a disseminar esporos por longas distâncias.

24.4 Parasitas fúngicos e patógenos

Os fungos estabelecem relações parasitárias com plantas e animais. As doenças fúngicas podem dizimar plantações e estragar alimentos durante o armazenamento. Os compostos produzidos por fungos podem ser tóxicos para humanos e outros animais. As micoses são infecções causadas por fungos. As micoses superficiais afetam a pele, enquanto as micoses sistêmicas se espalham pelo corpo. As infecções fúngicas são difíceis de curar, uma vez que os fungos, como seus hospedeiros, são eucarióticos e cladisticamente aparentados de perto com o Reino Animalia.

24.5 Importância dos Fungos na Vida Humana

Os fungos são importantes para a vida humana cotidiana. Os fungos são decompositores importantes na maioria dos ecossistemas. Os fungos micorrízicos são essenciais para o crescimento da maioria das plantas. Os fungos, como alimentos, desempenham um papel na nutrição humana na forma de cogumelos e também como agentes de fermentação na produção de pão, queijos, bebidas alcoólicas e várias outras preparações alimentícias. Os metabólitos secundários dos fungos são usados ​​como medicamentos, como antibióticos e anticoagulantes. Os fungos são organismos modelo para o estudo da genética e do metabolismo dos eucariotos.


Doenças de contato

As doenças de contato são transmitidas quando uma pessoa infectada tem contato corporal direto com uma pessoa não infectada e o micróbio é transmitido de um para o outro. As doenças de contato também podem ser transmitidas por contato indireto com uma pessoa infectada e com o ambiente ou itens pessoais. A presença de drenagem da ferida ou outras descargas do corpo sugerem um potencial aumentado de risco de transmissão e contaminação ambiental. Precauções que criam uma barreira e procedimentos que diminuem ou eliminam o micróbio no meio ambiente ou nos pertences pessoais, formam a base para interromper a transmissão das doenças de contato direto.


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