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Onde está o DNA durante o processo de extração de RNA usando Trisure?

Onde está o DNA durante o processo de extração de RNA usando Trisure?



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Onde está o DNA durante o processo de extração de RNA usando Trisure descrito aqui? Dado que o DNA também é um ácido nucléico, devo esperar que o RNA isolado também contenha DNA? No entanto, a Bioline reivindica RNA "virtualmente sem contaminação por DNA genômico".


Como era de se esperar, eles não querem realmente dizer o que é TRIsure. O que eles dizem é que o DNA é encontrado na fase orgânica ou interfase após a extração, enquanto o RNA se divide na fase aquosa. É quase certo que essa seja uma variante da extração de fenol ácido. Como confirmação, a MSDS lista fenol, tiocianato de amônio, tiocianato de guanidínio, glicerol e ácido cítrico como seus componentes.


Purificação de DNA e RNA

A extração de DNA e RNA é um método básico usado em biologia molecular. A necessidade de ácido nucléico de alta qualidade e pureza é importante para uma ampla gama de aplicações clínicas e de pesquisa. A purificação do ácido nucleico é uma etapa inicial em muitos fluxos de trabalho genômicos e de biologia molecular.

Amostras de DNA e RNA são freqüentemente obtidas de preparações brutas. O DNA genômico, o DNA de plasmídeo e o RNA total podem ser extraídos e purificados de uma variedade de fontes, incluindo células bacterianas e de mamíferos, tecidos de plantas, tecidos de fungos, tecidos de mamíferos, sangue, plasma, soro, vírus, esfregaços bucais e nasais, matrizes de gel, PCRs e outras reações enzimáticas. O isolamento do ácido nucléico dessas amostras frequentemente envolve a lise das membranas celulares ou homogeneização da amostra, seguida pela remoção de proteínas, enzimas, detergentes, sais e lipídios.

As abordagens comuns incluem:

  • Extração alcalina
  • Extração de fenol-clorofórmio
  • Centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl)
  • Cromatografia de oligo (dT) -celulose
  • Matriz de sílica
  • Contas de vidro
  • Terra de diatomáceas
  • Cromatografia de troca aniônica
  • Cromatografia de exclusão de tamanho


A aplicação final determinará o melhor método de purificação. As aplicações downstream incluem PCR, qPCR, digestão de restrição, ligação, clonagem, genotipagem, análise de expressão gênica, sequenciamento de última geração (NGS) e Northern e Southern blotting.


Conteúdo

Este método se baseia na separação de fases por centrifugação de uma mistura da amostra aquosa e uma solução contendo fenol saturado com água e clorofórmio, resultando em uma fase aquosa superior e uma fase orgânica inferior (principalmente fenol). O tiocianato de guanidínio, um agente caotrópico, é adicionado à fase orgânica para auxiliar na desnaturação de proteínas (como aquelas que se ligam fortemente aos ácidos nucléicos ou aquelas que degradam o RNA). Os ácidos nucléicos (RNA e / ou DNA) se dividem na fase aquosa, enquanto a proteína se divide na fase orgânica. O pH da mistura determina quais ácidos nucléicos são purificados. [4] Em condições ácidas (pH 4-6), o DNA se divide na fase orgânica, enquanto o RNA permanece na fase aquosa. Em condições neutras (pH 7-8), tanto o DNA quanto o RNA se dividem na fase aquosa. Em uma última etapa, os ácidos nucléicos são recuperados da fase aquosa por precipitação com 2-propanol. O 2-propanol é então lavado com etanol e o pellet é brevemente seco ao ar e dissolvido em tampão TE ou água livre de RNAse.

O tiocianato de guanidínio desnatura as proteínas, incluindo RNases, e separa o rRNA das proteínas ribossomais, enquanto o fenol, o isopropanol e a água são solventes com baixa solubilidade. Na presença de clorofórmio ou BCP (bromocloropropano), esses solventes se separam inteiramente em duas fases que são reconhecidas por sua cor: uma fase aquosa superior transparente (contendo os ácidos nucléicos) e uma fase inferior (contendo as proteínas dissolvidas em fenol e a lípidos dissolvidos em clorofórmio). Outros produtos químicos desnaturantes, como 2-mercaptoetanol e sarcosina, também podem ser usados. A principal desvantagem é que o fenol e o clorofórmio são materiais perigosos e inconvenientes, e a extração costuma ser trabalhosa; portanto, nos últimos anos, muitas empresas agora oferecem maneiras alternativas de isolar o RNA.


3 principais etapas envolvidas na extração de DNA

Inicialmente, o isolamento do DNA foi um processo longo e difícil, com grandes quantidades de DNA coletado e filtrado. A extração de DNA de plantas, animais e bactérias exige que os componentes celulares sejam liberados em uma solução. Como as bactérias são unicelulares e não contêm osso, gordura, cartilagem, etc., o DNA é relativamente fácil de ser extraído.

Em contraste, as amostras de animais e plantas muitas vezes devem ser moídas em pequenos fragmentos antes de prosseguir. Como as células vegetais têm paredes celulares muito rígidas, o pesquisador deve quebrá-las mecanicamente em um liquidificador ou adicionar enzimas degradativas especiais para digerir os componentes da parede celular.

Da mesma forma, para extrair DNA da cauda de um camundongo, enzimas são adicionadas para degradar o tecido conjuntivo e dispersar as células. De longe, a maneira mais fácil de obter DNA é extraí-lo das bactérias. Algumas gotas de uma cultura bacteriana fornecerão bastante DNA para a maioria dos propósitos. Primeiro, a parede celular bacteriana é facilmente digerida pela lisozima, uma enzima que degrada a camada de peptidoglicano da parede celular.

Um tratamento bem-sucedido e tímido com detergente dissolve os lipídios da membrana celular. Agentes quelantes, como EDTA (Etileno diaminina tetraacetato), também são usados, especialmente com bactérias gram-negativas, para remover os íons metálicos que ligam componentes da membrana externa e tetra-brana. Em todas essas amostras, o conteúdo cel & shylular, incluindo o DNA, é então liberado em solução e purificado por uma série de etapas mais tímidas.

Extração de DNA: Passo 2.

Purificação de DNA:

Dois tipos gerais de procedimento são usados ​​para purificação de DNA:

O princípio da centrifugação é o seguinte:

A amostra é girada em alta velocidade e a força centrífuga faz com que os componentes maiores ou mais pesados ​​sedimentem no fundo do tubo. Por exemplo, destruir a parede celular de bacte e shyria pela lisozima e detergentes deixa uma solução contendo fragmentos da parede celular, que são pequenos, e do DNA. Quando a amostra é centrifugada, o DNA e alguns outros componentes grandes são sedimentados no fundo do tubo.

Os fragmentos da parede celular, juntamente com muitos outros componentes solúveis, permanecem em solução e são descartados. O DNA sedimentado é então redissolvido em uma solução tampão apropriada. Ainda assim, tem muita proteína e RNA misturados a ele.

Geralmente são removidos por meios químicos. Uma etapa usada em muitas purificações de DNA é a extração de phe e shynol. O fenol, também conhecido como carro e ácido tímido, é muito corrosivo e extremamente danoso e tímido porque dissolve e desnatura as proteínas que constituem de 60 a 70 por cento de todos os seres vivos. Consequentemente, o fenol pode ser usado para dissolver e remover todas as proteínas de uma amostra de DNA.

Quando o fenol é adicionado à água, os dois líquidos não se misturam para formar uma única solução, o fenol mais denso forma uma camada separada abaixo da água. Quando agitadas, as duas camadas se misturam temporariamente e as proteínas se dissolvem em fenol.

Quando o tremor pára, a solução de DNA e as proteínas de retenção de fenol se separam em duas camadas (Fig. 3.1). Para garantir que nenhum fenol seja preso com o DNA, a amostra é centrifugada brevemente. Em seguida, a água contendo DNA e RNA é sugada e mantida. Geralmente, várias extrações sucessivas de fenol são realizadas para purificar proteínas do DNA.

Uma variedade de técnicas mais recentes foi desenvolvida para evitar a extração de fenol. A maioria deles envolve a purificação do DNA, passando-o por uma coluna contendo uma resina que se liga ao DNA, mas não a outros componentes celulares.

As técnicas e técnicas a esse respeito são dos seguintes tipos

1. Cromatografia de afinidade:

Isso usa resinas de sílica. As resinas de sílica ligam ácidos nucléicos e tímidos rapidamente e especificamente em pH baixo e altas concentrações de sal. Os ácidos nucléicos são liberados em pH mais alto e baixa concentração de sal.

2. Cromatografia de troca iônica:

As resinas de troca an & shyion, como dietilaminoetilcelulose, são carregadas positivamente e se ligam ao DNA por meio de seus grupos fos & tímidos carregados negativamente. Neste caso, a ligação ocorre em baixas concentrações de sal e os ácidos nucléicos são eluídos por altas concentrações de sal, que interrompem a ligação iônica.

Extração de DNA: Etapa 3.

Remoção de RNA indesejado:

Enzimas especiais removem o RNA contaminante de uma amostra de DNA. A clease da fita enzimática degrada o RNA em oligonucleotídeos curtos, mas deixa a macromolécula gigante de DNA inalterada. Uma mistura de DNA e RNA é primeiro incubada com a ribonuclease na temperatura ideal para a atividade enzimática.

Em seguida, um volume igual de álcool é adicionado. O álcool precipita macromoléculas grandes, incluindo longas cadeias de DNA, fora da solução. No entanto, os pequenos fragmentos de RNA permanecem dissolvidos.

Deve-se notar que o tratamento com álcool não é muito específico e precipitará a maioria dos grandes carboidratos e muitas proteínas, bem como macromoléculas intactas de DNA e RNA. Assim, a precipitação com álcool só pode ser usada após esses componentes terem sido removidos do DNA por centrifugação e extração com fenol.

Em seguida, o DNA é sedimentado no fundo do tubo por centrifugação, e a solução sobrenadante contendo os fragmentos e fragmentos de RNA é descartada (Fig. 3.2). A minúscula pelota de DNA deixada no fundo do tubo quase sempre é quase invisível. No entanto, ele contém bilhões de moléculas de DNA, suficientes para a maioria das investigações.


Purificação de RNA usando TRIzol (reagente TRI)

A solubilização e extração de TRIzol é um método geral desenvolvido relativamente recentemente para desproteinizar RNA. Este método é particularmente vantajoso em situações em que células ou tecidos são enriquecidos em RNases endógenas ou quando a separação de RNA citoplasmático de RNA nuclear é impraticável. TRIzol (ou TRI Reagent) é uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidínio que simultaneamente solubiliza material biológico e desnatura proteínas. Após a solubilização, a adição de clorofórmio causa separação de fases (semelhante à extração com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico), onde a proteína é extraída para a fase orgânica, o DNA se resolve na interface e o RNA permanece na fase aquosa. Portanto, o RNA, o DNA e a proteína podem ser purificados de uma única amostra (daí o nome TRIzol). A extração de TRIzol também é um método eficaz para isolar pequenos RNAs, como microRNAs, RNAs associados a piwi ou pequenos RNAs de interferência endógenos. No entanto, o TRIzol é caro e os pellets de RNA podem ser difíceis de ressuspender. Assim, o uso de TRIzol não é recomendado quando a extração regular de fenol é prática.


Etapas do fluxo de trabalho NGS

O fluxo de trabalho de sequenciamento de última geração contém três etapas básicas: preparação da biblioteca, sequenciamento e análise de dados. Aprenda o básico de cada etapa e descubra como planejar seu fluxo de trabalho NGS.

Preparação para o fluxo de trabalho NGS

Antes de iniciar o fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração, isole e purifique seu ácido nucléico. Alguns métodos de extração de DNA podem introduzir inibidores, que podem afetar negativamente as reações enzimáticas que ocorrem no fluxo de trabalho de NGS. Para obter os melhores resultados, use um protocolo de extração otimizado para o seu tipo de amostra. Para experimentos de sequenciamento de RNA, converta RNA em cDNA por transcrição reversa.

Após a extração, a maioria dos fluxos de trabalho NGS requer uma etapa de CQ. Recomendamos o uso de espectrofotometria UV para avaliação de pureza e métodos fluorométricos para quantificação de ácido nucleico.

Etapa 1 no fluxo de trabalho NGS: preparação para a biblioteca

A preparação da biblioteca é crucial para o sucesso do seu fluxo de trabalho NGS. Esta etapa prepara as amostras de DNA ou RNA para serem compatíveis com um sequenciador. As bibliotecas de sequenciamento são normalmente criadas fragmentando o DNA e adicionando adaptadores especializados em ambas as extremidades. No fluxo de trabalho de sequenciamento da Illumina, esses adaptadores contêm sequências complementares que permitem que os fragmentos de DNA se liguem à célula de fluxo. Os fragmentos podem então ser amplificados e purificados.

Para economizar recursos, várias bibliotecas podem ser agrupadas e sequenciadas na mesma execução - um processo conhecido como multiplexação. Durante a ligação do adaptador, sequências de índice exclusivas ou “códigos de barras” são adicionadas a cada biblioteca. Esses códigos de barras são usados ​​para distinguir entre as bibliotecas durante a análise de dados.

Recursos de preparação de biblioteca

Encontre orientação para quantificação de biblioteca e controle de qualidade.

Aprenda como evitar a contaminação ao purificar DNA / RNA.

Etapa 2 no fluxo de trabalho NGS: sequenciamento

Durante a etapa de sequenciamento do fluxo de trabalho NGS, as bibliotecas são carregadas em uma célula de fluxo e colocadas no sequenciador. Os aglomerados de fragmentos de DNA são amplificados em um processo chamado geração de cluster, resultando em milhões de cópias de DNA de fita simples. Na maioria dos instrumentos de sequenciamento Illumina, o agrupamento ocorre automaticamente.

Em um processo denominado sequenciamento por síntese (SBS), os nucleotídeos modificados quimicamente se ligam à fita modelo de DNA por meio da complementaridade natural. Cada nucleotídeo contém uma etiqueta fluorescente e um terminador reversível que bloqueia a incorporação da próxima base. O sinal fluorescente indica qual nucleotídeo foi adicionado e o terminador é clivado para que a próxima base possa se ligar.

Depois de ler a fita direta de DNA, as leituras são lavadas e o processo se repete para a fita reversa. Esse método é chamado de sequenciamento de extremidades emparelhadas.

Sequenciamento por tecnologia de síntese

Etapa 3 no fluxo de trabalho NGS: análise de dados

Após o sequenciamento, o software do instrumento identifica os nucleotídeos (um processo denominado chamada de base) e a precisão prevista dessas chamadas de base. Durante a análise de dados, você pode importar seus dados de sequenciamento para uma ferramenta de análise padrão ou configurar seu próprio pipeline.

Hoje, você pode usar aplicativos de análise de dados intuitivos para analisar dados NGS sem treinamento de bioinformática ou equipe de laboratório adicional. Essas ferramentas fornecem alinhamento de sequência, chamada de variantes, visualização de dados ou interpretação.

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Sequenciamento do genoma completo microbiano

O sequenciamento do genoma total microbiano pode ser usado para identificar patógenos, comparar genomas e analisar a resistência antimicrobiana. Nosso fluxo de trabalho NGS para este aplicativo descreve as etapas recomendadas. Todo o fluxo de trabalho vai do DNA aos dados em menos de 24 horas.

Isolamento de DNA

Use um kit de extração para isolar o DNA de colônias microbianas sem a introdução de inibidores. Recomendamos o uso de contas de vidro. Avalie a pureza usando espectrofotometria UV e quantifique o DNA usando métodos fluorométricos.

Preparação para biblioteca

Prepare e quantifique as bibliotecas de acordo com o protocolo listado no Guia Illumina DNA Prep. Você também pode realizar uma verificação de qualidade da biblioteca opcional usando o Agilent 2100 Bioanalyzer ou Advanced Analytical Fragment Analyzer. Você precisará:

2,5 horas
Estimativa de entrada de DNA: 1–500 ng

Sequenciamento

Bibliotecas de sequência em uma execução de 2 × 150 bp seguindo o protocolo listado no iSeq 100 System Guide. Você precisará:

19,5 horas
Produção estimada: 1,2 Gb por corrida de 2 × 150 bp
Amostras por execução: 4-5 amostras assumindo 5 Mb a 50 × de cobertura

Análise de dados

Analise dados usando o aplicativo BWA Aligner e visualize os dados usando o aplicativo Integrative Genomics Viewer no BaseSpace Sequence Hub. Você precisará:


Resumo

O material de ácido nucléico de qualidade adequada é crucial para uma análise de sequenciamento de alto rendimento (HTS) bem-sucedida. O DNA e o RNA isolados de material FFPE de arquivo são frequentemente degradados e não podem ser amplificados imediatamente devido a danos químicos introduzidos durante a fixação. Para identificar os kits de extração de ácido nucleico ideais, a quantidade, a qualidade e o desempenho de DNA e RNA em aplicações de HTS foram avaliados. O DNA e o RNA foram isolados de cinco blocos FFPE de arquivo de sarcoma, usando oito protocolos de extração de sete kits de três fornecedores comerciais diferentes. Para extração de DNA, o kit truXTRAC FFPE DNA da Covaris proporcionou rendimentos mais altos e DNA amplificável melhor, mas todos os protocolos deram rendimentos de biblioteca HTS comparáveis ​​usando Agilent SureSelect XT e tiveram um bom desempenho na chamada de variantes downstream. Para extração de RNA, todos os protocolos deram rendimentos comparáveis ​​e RNA amplificável. No entanto, para a detecção do gene de fusão usando o Archer FusionPlex Sarcoma Assay, o kit truXTRAC FFPE RNA da Covaris e o kit Agencourt FormaPure da Beckman Coulter mostraram a maior porcentagem de pares de leitura exclusivos, proporcionando maior complexidade de dados HTS e detecção mais frequente de fusão recorrente genes. A extração simultânea de DNA e RNA truXTRAC gerou resultados semelhantes como protocolos individuais. Essas descobertas mostram que, embora as bibliotecas de HTS pudessem ser geradas na maioria dos casos, os diferentes protocolos deram quantidade e qualidade variáveis ​​para a extração de ácido nucleico FFPE. Selecionar o procedimento ideal é altamente valioso e pode gerar resultados em amostras de qualidade limítrofe.

Citação: Kresse SH, Namløs HM, Lorenz S, Berner J-M, Myklebost O, Bjerkehagen B, et al. (2018) Avaliação de métodos comerciais de extração de DNA e RNA para sequenciamento de alto rendimento de amostras FFPE. PLoS ONE 13 (5): e0197456. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197456

Editor: Ruslan Kalendar, Universidade de Helsinque, FINLÂNDIA

Recebido: 2 de agosto de 2017 Aceitaram: 2 de maio de 2018 Publicados: 17 de maio de 2018

Direito autoral: © 2018 Kresse et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.

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Financiamento: Este projeto foi apoiado por doações da Norwegian Cancer Society (PR-2007-0163) para Leonardo A. Meza-Zepeda, Norges Forskningsråd (221580) para Ola Myklebost e o programa de Terapia Genética no Hospital Universitário de Oslo para Leonardo A. Meza-Zepeda . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.


Aplicação prática de extração de fenol / clorofórmio

Embora existam muitos mais métodos para escolher para limpar seu RNA ou DNA do que costumava ser, às vezes a extração de fenol / clorofórmio ainda é o melhor caminho a percorrer. Aqui, vou discutir alguns dos aspectos práticos do uso desta técnica.

Nick introduziu o tópico da extração de fenol / clorofórmio em um artigo anterior, abordando algumas das ideias sobre como a extração orgânica removerá proteínas de uma solução aquosa. Em resumo, as proteínas consistem em resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos e, por meio do enovelamento de proteínas, alcançam um compromisso com a água para permanecerem solúveis. No entanto, quando eles têm a oportunidade de fazer a transição para um ambiente que pode acomodar resíduos polares e não polares (ou seja - fenol ou fenol / clorofórmio) sem compromisso necessário (ou seja, & # 8211 dobramento), eles se movem alegremente para esse Estágio. As moléculas mais altamente polares, como carboidratos e ácidos nucléicos, são “mais felizes” na fase aquosa (com algumas exceções observadas abaixo) e permanecem lá. Agora, para o essencial.

Fenol versus Fenol / Clorofórmio versus Clorofórmio
Uma das perguntas mais frequentes que me fazem ao treinar alguém é quais são as diferenças entre as diferentes fases orgânicas usadas na extração. Aqui está o detalhamento, da melhor maneira que eu os entendo.

Fenol - Na verdade, estamos falando aqui é o fenol saturado com tampão, que consiste em uma solução que é na verdade cerca de 72% de fenol, 28% de água. Uma vez que o fenol é um ácido fraco, as soluções que usamos foram equilibradas com tampão para trazer o pH a um alvo específico - ácido para purificação de RNA ou ligeiramente alcalino para purificação de DNA. Além de uma certa quantidade de água se dissolvendo no fenol, há uma certa quantidade de fenol que se dissolve em água - no equilíbrio, a fase aquosa conterá cerca de 7% de fenol. Acredita-se que isso ajude na extração, já que esse fenol dissolvido ajuda a desnaturar as proteínas enquanto elas ainda estão na solução aquosa. O fenol saturado com tampão tem uma densidade apenas ligeiramente superior à da água.

Fenol / clorofórmio - Esta é uma mistura de fenol saturado com tampão e clorofórmio, geralmente perto de 1: 1 para purificação de DNA com outras proporções às vezes usadas para purificação de RNA. O álcool isoamílico é algumas vezes incluído como um agente antiespuma, mas geralmente é considerado uma adição inerte e opcional. Esta solução é comumente usada no lugar do fenol saturado com tampão por algumas razões. Como mencionei acima, a densidade do fenol saturado com tampão é apenas um pouco maior do que a da água. Portanto, se sua fase aquosa contém sal suficiente ou qualquer outro soluto que aumentaria sua densidade, você poderia acabar com a inversão de fase durante a extração, onde sua fase aquosa está sob o fenol, em vez de sobre ele. O clorofórmio é significativamente mais denso do que a água, portanto, adicioná-lo à fase orgânica aumenta a densidade geral dessa fase, ajudando a prevenir a inversão de fase.

Além disso, o clorofórmio (e alguns dizem que o álcool isoamílico) ajuda a reduzir a interfase - a fronteira difusa entre as duas fases povoadas por moléculas que não conseguem decidir para onde querem ir. Estas podem ser proteínas parcialmente desnaturadas, DNA (dependendo do pH) e / ou proteínas de ligação ao DNA parcialmente desnaturadas que ainda estão aderidas ao DNA, e é uma verdadeira dor no traseiro. Se você pipetar parte desse material ao remover a fase aquosa, você diminuirá a pureza de sua amostra. Se você for muito tímido durante a pipetagem, você prejudicará o seu rendimento. Se você tiver a minha sorte, então o que quer que você mais queria manter está nele. Adicionar clorofórmio à mistura ajuda a reduzir isso. (Mas eu tenho uma solução ainda melhor para este problema, sobre a qual falarei a seguir.)

Clorofórmio - normalmente usado após extrações de fenol ou fenol / clorofórmio. Embora o clorofórmio puro não funcione tão bem quanto as soluções orgânicas mencionadas acima para extração de proteínas, ele funciona bem para extrair fenol de soluções aquosas. Lembra quando eu disse que a fase aquosa continha

7% de fenol após o equilíbrio? Você também se lembra quando eu disse que o fenol gosta de desnaturar as proteínas? Se você não se livrar (ou pelo menos reduzir severamente) o fenol em sua solução de ácido nucleico agora livre de proteína, ele pode voltar a assombrá-lo, inibindo parcial ou completamente as enzimas que você trata o DNA ou RNA com o linha. Apresentado com uma bela casa de clorofórmio, no entanto, o fenol se separa dos ácidos nucléicos. O clorofórmio em si é cerca de 10X menos solúvel em água do que o fenol (

0,8%) e é menos desnaturante para proteínas. Também me disseram há muito tempo que é menos provável que o fenol se aglomere com o DNA durante a precipitação do etanol uma vez, mas não consigo encontrar uma referência para comprovar esse ponto.

Éter - também pode ser usado para extrair o fenol de volta da fase aquosa. No entanto, por causa do potencial explosivo do éter e da tendência dos tipos de biologia de ter bicos de Bunsen e grevistas em seus laboratórios, ele foi amplamente substituído pelo clorofórmio.

Não tão bonito em rosa
Uma nota de cautela: não use seu fenol ou fenol / clorofórmio se a solução estiver ficando rosa. A oxidação do fenol produz um composto rosa / marrom, e esse composto causará cortes no DNA e degradação do RNA. A maioria das soluções comerciais de fenol contém um antioxidante para inibir essa oxidação, e o fenol tamponado em pH ácido parece ser resistente à oxidação, mas não é uma má ideia mover uma parte do fenol saturado do tampão (do frasco marrom que ele provavelmente entrou) em um frasco ou tubo transparente para inspecioná-lo antes de iniciar a extração.

pH é importante - muito
Ocasionalmente, alguém faz uma extração de fenol e não recupera nenhum DNA da amostra. Se isso acontecer com você ou com alguém em seu laboratório, sua primeira pergunta deve ser "Qual fenol você usou?" Os laboratórios que trabalham com DNA e RNA provavelmente terão soluções de fenol tamponadas com ácido e básico, ou alguém comprará um novo frasco de fenol sem prestar atenção ao pH. A extração de amostras contendo DNA com fenol ácido resulta na desnaturação do DNA e, uma vez desnaturado, o DNA se divide na fase orgânica. Esta é uma característica chave de muitos protocolos de purificação de RNA, que é uma das razões pelas quais o fenol saturado com tampão ácido é usado.

Agora, às vezes as extrações de fenol de DNA de um laboratório começam a falhar (nenhuma recuperação do DNA depois) e o pH do fenol é questionado. Se você se encontrar neste local, você não pode simplesmente mergulhar seu medidor de pH nele, e você não pode usar papel de pH, uma vez que o indicador de pH no papel foi caracterizado em soluções aquosas. O método que usei é diluir 1 ml de fenol saturado com tampão com 9 ml de metanol a 45%, misturar e medir o pH com um medidor de pH padrão. A maneira mais segura de ajustar o pH é substituindo a fase aquosa no topo da solução de fenol por uma nova alíquota de

100 mM de água tamponada (geralmente Tris pH 7,9 para o trabalho de DNA), misture bem as fases e, em seguida, deixe a garrafa assentar até que as fases estejam bem separadas novamente. Em seguida, pH novamente.

Misturando suas fases
As extrações de fenol / clorofórmio são incrivelmente eficientes - menos de 1% da proteína média permanece na fase aquosa após a primeira extração ter chegado ao equilíbrio. O truque é obter o equilíbrio da extração, é claro. Quanto mais área de superfície houver entre as duas fases, mais rápido isso acontecerá, e essa área de superfície será maior, pois será a emulsão mais fina que você criou. Isso pode ser obtido agitando as fases por alguns minutos, como muitos protocolos exigem, mas nem todas as amostras podem ser agitadas. Se você estiver purificando DNA muito grande, como o DNA genômico, talvez precise misturar sua amostra com muito mais cuidado e, portanto, realizar cada extração por muito mais tempo. Portanto, neste ponto, siga seu protocolo e seja muito cauteloso ao tentar economizar tempo nesta etapa.

Efeitos da desnaturação e digestão
Alguns protocolos exigem desnaturação de proteínas e possivelmente digestão com Protinase K antes da extração. Ambas as etapas são tentativas de reduzir a quantidade de material que fica preso na interfase e, portanto, melhorar o rendimento do DNA ou RNA recuperado. Eu nunca vi qualquer efeito negativo de desnaturar as proteínas com SDS antes da extração. Por outro lado, a digestão da proteína pode reduzir a pureza do ácido nucléico que você recupera. Enquanto as proteínas inteiras quase garantem a partição para a fase orgânica, uma vez que a proteína é digerida em pequenos peptídeos, nem todos esses peptídeos terão o mesmo "caráter" químico da proteína inteira, e cada um terá seu próprio número de partição. Pode não importar muito se você tem alguns peptídeos em seu ácido nucleico, dependendo de sua aplicação downstream, mas é formalmente possível que esses contaminantes possam afetar sua futura quantificação da amostra. No entanto, descobri uma maneira melhor de eliminar a temida interfase ...

Gel de bloqueio de fase®
Esta é uma daquelas coisas que parece estar em 50% dos laboratórios, mas menos de 10% das pessoas com quem conversei sabem o que é ou como funciona. Descobri isso em um ponto crítico de minha pesquisa e salvou minha tese. Resumindo, o Phase-lock gel é um gel pegajoso, semelhante à vasolina, que tem uma densidade ligeiramente maior do que a da água. Se você adicionar sua extração em cima dele em um tubo de centrífuga e, em seguida, centrifugar, o gel Phase Lock se acumula entre as fases aquosa e orgânica, separando as duas e evitando a formação da interface faminta DNA / RNA.

Uma pesquisa na internet não encontrou nenhuma imagem desse processo que eu achasse boa o suficiente, então tirei algumas fotos minhas. Nesta pequena demonstração, o corante vermelho está tomando o lugar de nosso precioso ácido nucléico, e o corante azul está substituindo a proteína.

A) O Phase Lock gel® sedimentado no fundo de um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
B) Depois de adicionar fenol / clorofórmio e a fase aquosa, complete com DNA falso (vermelho) e proteína falsa (azul) na fase aquosa.
C) Após agitação suave durante 5 minutos.
D) Após centrifugação. Observe que o gel agora separa a fase orgânica da fase aquosa.
E) Após uma segunda adição de fenol / clorofórmio e agitação suave durante 5 minutos.
F) Após a segunda centrifugação. O DNA falso agora pode ser extraído com clorofórmio (no mesmo tubo, se o espaço permitir) para remover o fenol residual.

Como você pode ver, o gel forma uma partição estável entre as duas fases, e se você quiser extrair a amostra uma segunda vez e ainda houver espaço no tubo, você pode fazê-lo, usando o mesmo tubo dois ou mais vezes sem comprometer a pureza da amostra. Você não pode misturar as duas fases em um tubo contendo este reagente, mas você pode misturar em um tubo separado e, em seguida, adicionar a amostra ao tubo com o gel e centrifugar. Eles possuem este gel em dois sabores diferentes - um para amostras regulares (light) e outro para amostras de alta densidade, como soluções com alta concentração de sal ou proteína (pesado).

Usar SDS para desnaturar as proteínas na minha amostra antes da extração e, em seguida, empregar Phase Lock gel® para separar as fases tem me dado consistentemente amostras de DNA com razões 260/280 de 1,8 e mais de 98% de recuperação. Coisas realmente boas.

Ao preparar este artigo, encontrei este site, que contém muitas informações úteis. Visite-o se quiser saber mais sobre o fenol.

Agora, para ouvir de você: quais são seus truques e dicas para extrações de proteínas perfeitas?


Tecnologia Lab-on-a-Chip e suas aplicações

Burak Yılmaz, Fazilet Yılmaz, em Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018

8.1.1.2 PCR, qPCR e detecção molecular em dispositivos LOC

Após a extração do DNA, a análise mais comum é a PCR (Polymerase Chain Reaction). O PCR tem muitas aplicações que são direta e indiretamente semelhantes às técnicas de sequenciamento. Uma das aplicações diretas de PCR é obviamente a amplificação de sequências de DNA que ajuda a tornar detectáveis ​​pequenas quantidades de DNA (por exemplo, para detecção de patógenos, como bactérias ou vírus).

A importância da PCR na análise genômica afeta o desenvolvimento de vários dispositivos LOC para PCR. A miniaturização do volume e a alta proporção entre superfície e volume levam à rápida transferência térmica para PCR rápida e integrada. PCR also requires a post-analysis so that amplicons’ size detection carried out by electrophoresis have been made to integrate PCR and electrophoresis on-chip ( Timothée, 2015a ).

Originally electrophoresis is done by using gels, mainly made using agarose (for longer DNA) and polyacrylamide (for shorter DNA). With the advent of LOCs, DNA electrophoresis was one the first molecular processes that could be integrated on a chip ( Curtis Saunders et al., 2013 ). This miniaturization enabled to increase even more the process time to realize electrophoresis, reduce reagent consumption, and assemble on a chip other DNA process steps as mentioned before ( Fig. 8.1 ).

Figure 8.1 . PCR microfluidic system.

qPCR is another technique that was adapted to LOC devices that present the advantage to be faster (automated detection during PCR), more sensitive, and sustainable.

As an example, using ultra-fast pressure controller and fluorescence reader and based on the ultra-fast temperature control, ultra-fast qPCR microfluidic system had been developed by Elvesys system for the molecular detection of diseases like Anthrax and Ebola in less than 8 minutes with a detection efficiency identical to commercial systems that are 7–15 times slower ( Ramalingam et al., 2010 ).

Another emerged field is digital microfluidics that deals with emulsion and droplets within LOC devices.

Ultra-low amount of DNA can be captured within gotas, and limits can be increased with one copy number detection within LOC droplet qPCR ( Beer et al., 2007 ) ( Fig. 8.2 ).

Figure 8.2 . LOC droplet qPCR.


Método¶

  • Com Bleach, esterilize uma espátula de reagente seca e um pequeno agitador magnético.
  • Prepare uma pasta de 5-10% em peso de resina Chelex100 (Biorad parte 143-3832,100-200 mesh Chelex, forma de sódio) e água esterilizada por UV para HPLC. A maneira mais eficaz de fazer isso é pegar um tubo falcão estéril de 50 ml, colocá-lo em uma escala dentro de um pequeno copo e zerar a escala. Em seguida, adicione 5 gramas de Chelex e encha até a marca de 50ml com água.

A precisão não é crítica. A técnica estéril é.

  • Coloque a barra de agitação estéril no tubo e coloque no agitador magnético. Chelex sedimenta rapidamente, portanto, se a pasta não estiver bem misturada, suas concentrações e resultados serão variáveis. Mantendo a lama bem misturada, alíquota de 300-500 microlitros em tubos eppendorf de 0,6 ou 1,6 ml (novamente, estéril) e tampe imediatamente. Se você tiver acesso a uma capela de fluxo laminar, esse é um bom lugar para fazer tudo isso. Você pode limpar a escala e o agitador com uma solução de alvejante a 10% e / ou esterilizar por UV antes de usar.
  • Ligue o bloco de aquecimento. Ajuste para 95 ° C. Encha os buracos com água.

  • Usando uma pinça estéril (chama sobre o queimador de álcool várias vezes para esterilizar), remova um pequeno pedaço de tecido da amostra. Este pedaço de tecido deve ser grande o suficiente para ser visível, mas não tão grande a ponto de ser facilmente visível. Imagine cortar uma seção de 0,2 mm de um grampo padrão. Isso é muito grande. Tecido demais pode inibir suas reações.

Esterilize a pinça entre as amostras.

  • Quando terminar, faça um controle negativo Chelex mergulhando sua pinça esterilizada em um tubo de pasta Chelex.
  • Amostra de vórtice e pasta de chelex por 10-15 segundos.

Certifique-se de que as tampas estejam bem fechadas antes de começar.

* A temperatura do bloco pode cair ligeiramente ao executar esta etapa. Essa queda é normal. Verifique os tubos durante a incubação para garantir que as tampas não saíram. *

Tenha cuidado, pois o vapor pode estourar a tampa do tubo de centrífuga. Segure as pálpebras.

Use sobrenadante apenas para reações de PCR. O talão de Chlex inativará o Taq!

Este método é baseado, com permissão, em um protocolo original disponível aqui.


Assista o vídeo: Como é feito um TESTE DE DNA? #Boravê no laboratório DE VERDADE! (Agosto 2022).