Em formação

Como posso medir o crescimento bacteriano em placas de ágar (por massa celular ou contagem de células)?

Como posso medir o crescimento bacteriano em placas de ágar (por massa celular ou contagem de células)?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estou fazendo um experimento em que estou crescendo S. mutans em pratos de ágar, e não tenho certeza de como mediria o crescimento do S. mutans. Também não tenho certeza se faria isso medindo a massa celular ou pela contagem de células. Alguma ideia?


A maneira mais simples é semear as placas com uma suspensão de bactérias garantindo que você espalhe a solução corretamente. Então você pode contar o número de colônias, que seria igual ao número de células individuais.

Se quiser medir a velocidade de crescimento, geralmente é mais simples medir apenas o diâmetro das colônias, garantindo sempre que inocula as placas com a mesma quantidade de inóculo.

Por último, é ainda mais fácil estimar o crescimento se sua cultura não for um meio líquido e você medir a densidade óptica com um espectofotômetro.


você quase certamente desejará realizar diluições em série de sua suspensão e aplicar as diluições em série usando o método de espalhamento (ou espalhamento). As diluições tornarão muito mais fácil contar o número de bactérias.

Geralmente, não é recomendado contar mais de 250 colônias em uma placa por razões de precisão (mas eu nunca conto mais do que 50, porque essa é a razão para fazer diluições em série). Aqui está uma bela imagem do que estou falando. Inclui uma descrição de como calcular o número de organismos na solução original. Eles optaram por contar o número de bactérias na quarta placa (diluição 1: 10.000) para estimar o número de bactérias no inóculo original. Espero que isto ajude]1


11: Números Bacterianos

Muitos estudos requerem a determinação quantitativa de populações bacterianas. Os dois métodos mais amplamente usados ​​para determinar o número de bactérias são o padrão, ou viável, método de contagem de placa e espectrofotométrico (turbidimétrico) análise. Embora os dois métodos sejam um tanto semelhantes nos resultados que produzem, há diferenças distintas. Por exemplo, o método de contagem de placa padrão é uma medida indireta da densidade celular e revela informações relacionadas apenas a bactérias vivas. A análise espectrofotométrica é baseada na turbidez e mede indiretamente todas as bactérias (biomassa celular), mortas e vivo.

O método padrão de contagem em placa consiste em diluir uma amostra com solução salina estéril ou diluente de tampão fosfato até que as bactérias sejam diluídas o suficiente para contar com precisão. Ou seja, as placas finais da série devem ter entre 30 e 300 colônias. Menos de 30 colônias não são aceitáveis ​​por razões estatísticas (muito poucas podem não ser representativas da amostra), e mais de 300 colônias em uma placa podem produzir colônias muito próximas umas das outras para serem distinguidas como distintas Unidades formadoras de colônias (CFUs) O pressuposto é que cada célula bacteriana viável é separada de todas as outras e se desenvolverá em uma única colônia discreta (UFC). Assim, o número de colônias deve fornecer o número de bactérias que podem crescer nas condições de incubação empregadas. Uma ampla série de diluições (por exemplo, 10 -4 a 10 -10) é normalmente semeada porque o número exato de bactérias é geralmente desconhecido. Maior precisão é alcançada com o plaqueamento de duplicatas ou triplicatas de cada diluição, embora não faremos isso neste exercício.

O aumento da turbidez em uma cultura é outro índice de crescimento bacteriano e número de células (biomassa). Usando um espectrofotômetro, a quantidade de luz transmitida diminui à medida que a população de células aumenta. A luz transmitida é convertida em energia elétrica, e isso é indicado em um galvanômetro. A leitura, chamada absorbância ou densidade óptica, reflete indiretamente o número de bactérias. Este método é mais rápido do que a contagem de placa padrão, mas é limitado porque a sensibilidade é restrita a suspensões bacterianas de 10 7 células ou mais. O procedimento para o uso do espectrofotômetro está no final deste exercício.

Porque é E. coli usado neste exercício? Ao trabalhar com grandes números e um curto período de tempo, um dos microrganismos mais confiáveis ​​é aquele que tem sido usado em experimentos anteriores, a saber, Escherichia coli. E. coli tem um tempo de geração a 37 & ordmC de 20 minutos. Assim, ele se reproduz muito rapidamente e é fácil de quantificar (ou seja, o número (biomassa) de E. coli células em uma cultura bacteriana podem ser facilmente determinadas por espectrofotometria).


Introdução

Os microrganismos anaeróbios são comuns em quase todos os ambientes da Terra. Eles são habitantes naturais de nichos ecológicos anaeróbicos, como sedimentos aquosos de rios, lagos e oceanos, sedimentos de solos e o trato gastrointestinal de animais. Seu metabolismo de energia é adaptado a um oxigênio molecular (O2) -ambiente livre. Em tais ambientes, condições limitantes de substrato são frequentemente encontradas (Lever et al. 2015). Para ganhar energia e / ou carbono, alguns anaeróbios degradam matéria orgânica, por exemplo, lignocelulose, polissacarídeos, proteínas ou lipídios. Outros anaeróbios metabolizam ácidos graxos de cadeia curta, ácidos graxos voláteis (AGV) e álcoois, enquanto alguns também possuem uma fisiologia simplificada e eficiente para realizar uma conversão biológica de gás em produto. Esses processos metabólicos são conhecidos por desempenhar um papel importante no ciclo global do carbono (Bond e Templeton 2011 Rumpel e Kögel-Knabner 2011 Schmidt et al. 2011 Hatti-Kaul e Mattiasson 2016).

Os substratos para processos de produção biotecnológicos estão disponíveis em uma ampla gama como sólidos (por exemplo, biomassa, minério), líquidos ou gases. Substratos sólidos são comumente usados ​​em usinas de biogás na forma de culturas energéticas (por exemplo, milho) ou como resíduos agrícolas (Amon et al. 2007 Bond e Templeton 2011). Esses substratos sólidos podem ser convertidos por um consórcio de diferentes micróbios em produtos líquidos ou gasosos, que podem ser posteriormente metabolizados em AGVs e gases (Bond e Templeton 2011).

A biomassa sólida é degradada por meio de uma cadeia de processo microbiana, conhecida como hidrólise, onde enzimas extracelulares quebram carboidratos, proteínas e lipídios complexos em seus constituintes básicos. Os constituintes gerados servem como produtos para acidogênese ou acetogênese, bem como para hidrogênio molecular (H2) e dióxido de carbono (CO2) Produção. Essas reações são apoiadas por bactérias anaeróbias facultativas, que metabolizam o O residual2 em digestores anaeróbios, estabelecendo assim condições adequadas para a etapa final na cadeia alimentar anaeróbia, que é referido como metano biológico (CH4) produção mediada por arquéias anaeróbias obrigatórias. Este processo, de matéria-prima biológica sólida ou processamento de resíduos, resulta em uma produção de biogás contendo aproximadamente 50-70% em volume de CH4, 30-50 vol.% CO2e pequenas quantidades de outros gases, por ex. sulfeto de hidrogênio (H2S) (Sasse 1988). A composição final dos gases de escape depende dos substratos aplicados. O principal produto gerado pela digestão anaeróbia é o CH4, enquanto CO2 é considerado um subproduto.

Os substratos líquidos usados ​​em microbiologia anaeróbia e biotecnologia são ácidos orgânicos, glicerol e açúcares. Um dos ácidos orgânicos altamente relevantes em biotecnologia é o formato (Kim et al. 2010 Rittmann et al. 2015a Kottenhahn et al. 2018 Ergal et al. 2018). O formato pode ser produzido a partir do monóxido de carbono (CO) que é gerado como um subproduto através do processo de manufatura Linz-Donawitz (Atwater 1942). O formato é um substrato altamente adequado para H2 produção por archaea (Bae et al. 2012, 2015). O glicerol é considerado um importante substrato biotecnologicamente relevante devido ao fato de ser produzido como subproduto do processo de fabricação do biodiesel. Atualmente, já existem muitos bioprocessos que utilizam glicerol para produção de ácido cítrico, ácido lático, 1,3-dihidroxiacetona (DHA), 1,3-propanodiol (1,3-PD), dicloro-2-propanol (DCP), acroleína, H2, etanol, etc. (Fan et al. 2010). Além disso, os açúcares podem ser utilizados como substrato para a produção microbiana de acetona-butanol-etanol (Friedl et al. 1991 Kujawska et al. 2015) ou H microbiano2 produção (Rittmann e Herwig 2012 Rittmann et al. 2015a Reischl et al. 2018a Ergal et al. 2018). Outro processo anaeróbico bem estabelecido que utiliza culturas puras é o processo de oxidação anaeróbia de amônio (ANAMOX) (Innerebner et al. 2007 Ali e Okabe 2015). No processo ANAMMOX, amônio e nitrito são divididos em nitrogênio molecular (N2) Esse processo já atingiu escala comercial.

CO, H2, CO2, e CH4 são substratos ou produtos gasosos que podem ser utilizados respectivamente em microbiologia anaeróbia e biotecnologia por microrganismos carboxidotróficos, hidrogenotróficos, autotróficos ou metanotróficos. No entanto, até agora nenhuma cultura pura de um microrganismo metanotrófico anaeróbio foi isolada. Crescimento microbiano anaeróbio em, por exemplo, CO ou H2/ CO2 o uso de uma cultura pura de microorganismos em um processo de conversão de gás em gás biológico é bem conhecido (Bae et al. 2012 Rittmann et al. 2015b). Esses processos são executados de forma eficiente com archaea e até mesmo altamente competitivos em comparação com os processos de conversão química de gás em gás (Bernacchi et al. 2014a, 2014b). Uma marca registrada de tais processos é que mesmo o subproduto CO2 do processo de digestão anaeróbica pode ser atualizado para CH4 através de um CO ex situ2com base na produção de metano biológico (CO2-BMP) processo que pode ser realizado com metanógenos (Seifert et al. 2013 Rittmann 2015 Rittmann et al. 2015a, b Rachbauer et al. 2016). Além disso, foi mostrado que o CO2 emissão de gases de combustão pode ser convertida em CH4 por Methanothermobacter marburgensis (Seifert et al. 2013). O CO2- A tecnologia BMP também pode ser integrada em vários outros CO2 cenários de utilização em que processos de conversão de gás em gás biológico podem ser utilizados (Martínez-Porqueras et al. 2012 Rachbauer et al. 2016 Abdel Azim et al. 2017). Os mencionados processos de conversão biológica de gás em gás já atingiram escala comercial de planta.

Para avaliar o papel dos microrganismos anaeróbios em condições de crescimento natural e poder investigar suas capacidades metabólicas e seu potencial fisiológico, o cultivo é inevitável. Entre outros, o cultivo de micróbios permite investigar as respostas fisiológicas (Valentine et al. 1994), o metabolismo (Ghose et al. 1978) e a interação com potenciais parceiros sintróficos (Shen et al. 2016). Dependendo do organismo de interesse, são necessários diferentes micronutrientes e macronutrientes para sustentar e melhorar o crescimento e / ou a formação do produto. Portanto, é de grande interesse aumentar a quantidade de células viáveis ​​em uma população e / ou otimizar as condições de cultivo para atingir altas produtividades e / ou rendimentos.

Esta revisão fornece uma visão geral dos métodos offline, at-line e online que são atualmente aplicados em microbiologia anaeróbica e biotecnologia para quantificação de produção de sólidos (por exemplo, biomassa), líquidos e gases. Na primeira parte da revisão, serão discutidas técnicas de cultivo anaeróbico para a criação de uma atmosfera anóxica para cultivo de anaeróbicos, bem como vasos de cultivo adequados e métodos de amostragem. A segunda parte da revisão apresentará técnicas que podem ser usadas para monitorar ou quantificar o crescimento microbiano, atividade populacional, absorção de substrato (s) e cinética de formação de produto (s) em sistemas microbianos anaeróbicos que consistem em co-culturas microbianas puras ou definidas. Finalmente, a aplicabilidade desses métodos é discutida de um ponto de vista ecológico para um bioprocesso tecnológico, com ênfase especial, mas não se limitando a, culturas anaeróbias e axênicas (Fig. 1).

Visão geral da seguinte revisão, resumindo tópicos importantes (cultivo anaeróbico, amostragem de biomassa, concentração e viabilidade de biomassa, identificação e quantificação de substratos e produtos líquidos e gasosos)


O que pode crescer em uma placa de ágar nutriente?

Bactérias

Cada colônia circular distinta deve representar uma célula bacteriana individual ou grupo que se dividiu repetidamente. Mantidas em um lugar, as células resultantes se acumularam para formar uma mancha visível. A maioria das colônias bacterianas tem uma cor branca, creme ou amarela e uma forma bastante circular.

Bacillus subtilis (3)
Proteus vulgaris (4)
Staphylococcus aures (5)
Streptococcus pyogenes (6)

Fermento

A levedura, um tipo de fungo (plural para fungo), é encontrada em muitos lugares, desde a natureza, a laboratórios de pesquisa e até mesmo em cozinhas cotidianas para panificação. As colônias de leveduras geralmente parecem semelhantes às colônias de bactérias. Algumas espécies, como Candida, pode crescer como manchas brancas com uma superfície brilhante.

Candida Albicans) é um tipo de fermento que pode crescer na superfície da pele(7)
Colônias de fermento redondo(8)
Colônias de fermento rosa(9)

Bolores

Os bolores são, na verdade, fungos e costumam ter uma aparência cinza esbranquiçada, com bordas difusas. Eles geralmente se transformam em uma cor diferente, do centro para fora. Dois exemplos de moldes são mostrados abaixo:

Mofo Verde (Trichoderma harzianum)(10)
Mofo Preto (Aspergillus nidulaus)(11)

Outros Fungos

Colônias verdes de musgo, uma nuvem branca ou um anel de esporos podem ser atribuídos ao crescimento de Aspergillus, que é comum em infecções fúngicas, como pé de atleta. Aqui está um exemplo do que Aspergillus parece:


Como medir o crescimento bacteriano em placas de Petri

As bactérias são cultivadas em placas de Petri em um meio sólido conhecido como ágar bacteriano, onde colônias circulares elevadas se formam. Ao contrário de uma célula bacteriana individual, uma colônia é um grupo de bactérias grande o suficiente para ser visível a olho nu. O crescimento bacteriano pode ser medido pela simples observação de quantas colônias estão presentes, entretanto, métodos mais quantitativos incluem o uso de uma câmara de contagem ou, mais frequentemente, contagens de placas viáveis. Este último é usado com mais frequência, pois também fornece informações qualitativas, como o efeito de diferentes condições de crescimento. Como pode haver bilhões de bactérias em uma placa de Petri, a medição requer primeiro a diluição da amostra para que seja possível contar o número de colônias.

Em um tubo de ensaio, adicione 10 microlitros da cultura bacteriana inicial a 90 microlitros do meio de diluição. Feche bem a tampa do tubo e agite suavemente no vórtex para obter uma mistura homogênea. Agora, a amostra é um décimo de sua concentração original.

Transfira 10 microlitros desta nova amostra para um novo tubo de ensaio contendo 90 microlitros de meio de diluição e misture novamente. Mais uma vez, o resultado será a amostra ainda mais diluída - agora será um centésimo de sua concentração original. Repita várias vezes, até que a amostra original tenha sido diluída entre 10 4 e 10 10 vezes. Certifique-se de que cada tubo esteja rotulado com a diluição correta, por exemplo 10 -1, 10 -2 e assim por diante.

Dispense 10 microlitros da última diluição completa na placa de ágar. Usando a borda de espalhamento, distribua a solução bacteriana em toda a superfície da placa de ágar. Repita isso para mais dois pratos. Também é comum realizar essas etapas com outros níveis de diluição para comparação. Certifique-se de rotular o fundo das placas. Recoloque as tampas em cada placa e deixe as placas de ágar secarem por vários minutos em uma bancada de laboratório sob uma chama ou em uma incubadora. Coloque as placas na incubadora, que deve ser ajustada para a temperatura adequada para a cepa de bactérias. Deixe crescer por 12 a 16 horas.

As colônias devem ser visíveis após 16 horas, no entanto, algumas modificações genéticas podem exigir mais tempo (por exemplo, desenvolvimento de cor). Quando as colônias forem observáveis, retire as placas e encontre aquelas que tenham entre 30 e 300 colônias. Usando um marcador permanente, coloque um ponto no fundo da placa de Petri - o lado com o ágar, não a tampa - onde quer que uma colônia seja visível através do ágar. Conte cada ponto do marcador. Repita para cada prato.

Para medir a quantidade de bactérias na cultura inicial para este experimento, a diluição precisa ser invertida nos cálculos, em dois locais. Em primeiro lugar, quando você tirou um microlitro do tubo de ensaio para colocar na placa de Petri, você tirou um décimo da amostra diluída, então você precisa multiplicar tudo por 10 para reverter isso. Além disso, se o fator de diluição no tubo de ensaio era, por exemplo, 10 -7, então o número de colônias deve ser multiplicado por 10 7 para reverter o efeito de diluição. Simplesmente remova o sinal negativo do expoente nos cálculos. Use a fórmula:

[Número de colônias contadas] × 10 × [quantas vezes a amostra deve ser multiplicada para obter a concentração original: por exemplo, 10 5] = Número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mililitro de cultura inicial. Este é o crescimento bacteriano em suas placas de Petri.

Coisas que você precisa

  • Meio de diluição
  • Pipetas e pontas
  • Tubos
  • Meio de cultura bacteriana e placas de ágar
  • Vórtice
  • bico de Bunsen
  • Espalhadores de vidro
  • 70 por cento de etanol

Certifique-se de esterilizar o espalhador de vidro mergulhando a borda de espalhamento em etanol a 70 por cento e inserindo-o na chama de um bico de Bunsen. Deixe o etanol pegar fogo e queime lentamente o álcool, o que matará toda a contaminação bacteriana. Toque suavemente na parte seca (ou seja, sem bactérias) do ágar para resfriá-lo - o ágar não deve derreter com o contato.

Avisos

Trate qualquer bactéria como se fosse potencialmente patogênica e use os procedimentos de segurança de laboratório adequados.


Resumo

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente em pesquisar e desenvolver novos agentes antimicrobianos de várias fontes para combater a resistência microbiana. Portanto, uma maior atenção tem sido dada aos métodos de triagem e avaliação da atividade antimicrobiana. Vários bioensaios, como difusão em disco, difusão em poço e diluição em caldo ou ágar são bem conhecidos e comumente usados, mas outros, como citofluorometria de fluxo e métodos bioluminescentes, não são amplamente utilizados porque requerem equipamento especificado e avaliação adicional para reprodutibilidade e padronização, mesmo que eles podem fornecer resultados rápidos dos efeitos do agente antimicrobiano e # x27s e uma melhor compreensão de seu impacto na viabilidade e no dano celular infligido ao microrganismo testado. Neste artigo de revisão, uma lista exaustiva de em vitro Métodos de teste de susceptibilidade antimicrobiana e informações detalhadas sobre suas vantagens e limitações são relatados.


FUNDAMENTOS DA MICROBIOLOGIA

Na contagem microscópica direta, é utilizada uma câmara de contagem que consiste em uma lâmina regulada e uma lamela. É construído de tal maneira que a lamela, a lâmina e as linhas pautadas delimitam um volume conhecido. O número de bactérias em um pequeno volume conhecido é contado diretamente ao microscópio e o número de bactérias na amostra original maior é determinado por extrapolação.

A câmara de contagem Petroff-Hausser (comumente usada na indústria de laticínios), por exemplo, (Figura 16. 1) tem pequenos quadrados gravados 1/20 de um milímetro (mm) por 1/20 de um mm e é 1/50 de um mm profundo. O volume de um pequeno quadrado, portanto, é 1 / 20.000 de mm cúbico ou 1 / 20.000.000 de centímetro cúbico (cc). Existem 16 pequenos quadrados nos grandes quadrados de linha dupla que são realmente contados, tornando o volume de um grande quadrado de linha dupla 1 / 1.250.000 cc. O procedimento normal é contar o número de bactérias em cinco grandes quadrados de linha dupla e dividir por cinco para obter o número médio de bactérias por quadrado grande. Esse número é então multiplicado por 1.250.000, uma vez que o quadrado contém um volume de 1 / 1.250.000 cc, para encontrar o número total de organismos por cc na amostra original. Se as bactérias forem diluídas, por exemplo, misturando as bactérias com o corante antes de serem colocadas na câmara de contagem, essa diluição também deve ser considerada nos cálculos finais.

A fórmula usada para a contagem microscópica direta é

O número de bactérias por cc = O número médio de bactérias por grande quadrado de linha dupla X O fator de diluição do quadrado grande (1.250.000) X O fator de diluição de quaisquer diluições feitas antes de colocar a amostra na câmara de contagem, por exemplo, mistura


16.2.2 Enumeração eletrônica de células

Um contador Coulter (Fig.16.2) é um aparelho para contar e dimensionar partículas e células. É usado, por exemplo, para bactérias e distribuições de tamanho de partícula de qualidade do ar. O contador detecta a mudança na condutância elétrica de uma pequena abertura conforme o fluido que contém as células é puxado. As células, sendo partículas não condutoras, alteram a seção transversal efetiva do canal condutor.

Foi um inventor americano chamado Wallace H. Coulter o responsável pela teoria e design do Contador Coulter. Ele desenvolveu pela primeira vez a teoria por trás de sua operação em 1947, enquanto fazia experiências com a eletrônica. Coulter determinou que a carga elétrica poderia ser usada para determinar o tamanho e o número de partículas microscópicas em uma solução. Esse fenômeno agora é conhecido como Princípio de Coulter. Um contador Coulter típico tem um ou mais microcanais que separam duas câmaras contendo soluções eletrolíticas. Quando uma partícula flui através de um dos microcanais, isso resulta na alteração da resistência elétrica do microcanal cheio de líquido. Essa mudança de resistência pode ser registrada como pulsos de corrente elétrica ou tensão, que podem ser correlacionados ao tamanho, mobilidade, carga superficial e concentração das partículas.


Normalmente, a amostra bacteriana é diluída por fatores de 10 e semeada em ágar pela técnica de placa de vazamento ou placa de espalhamento. Após a incubação, o número de colônias em uma placa de diluição mostrando entre 30 e 300 colônias (Fig. 16.4 e Fig. 16.5) é determinado. Uma placa com 30-300 colônias é escolhida porque esta faixa é considerada estatisticamente significativa. Se houver menos de 30 colônias na placa, pequenos erros na técnica de diluição ou a presença de alguns contaminantes terão um efeito drástico na contagem final. Da mesma forma, se houver mais de 300 colônias na placa, haverá isolamento insuficiente e as colônias terão crescido juntas.


Fig 16.4 Técnicas de placa de despejo e placa de espalhamento


Fig.16.5 Métodos de placa de despejo e placa de espalhamento

  • Apenas células vivas desenvolvem colônias que são contadas
  • Grupos ou cadeias de células se desenvolvem em uma única colônia
  • As colônias se desenvolvem apenas a partir daqueles organismos para os quais as condições culturais são adequadas para o crescimento.

Tabela 16.1 Comparação de vários métodos de medição do crescimento bacteriano

16.2.4 Método de contagem de filtro de membrana


Fig. 16.6 Método de filtração por membrana


16.2.5 Métodos de medição de turbidez

Quando as bactérias que crescem em um meio líquido são misturadas, a cultura parece turva. Isso ocorre porque uma cultura bacteriana atua como uma suspensão coloidal que bloqueia e reflete a luz que passa pela cultura. Dentro dos limites, a luz absorvida pela suspensão bacteriana será diretamente proporcional à concentração de células na cultura. Ao medir a quantidade de luz absorvida por uma suspensão bacteriana, pode-se estimar e comparar o número de bactérias presentes. O instrumento usado para medir a turbidez é um espectrofotômetro (Fig. 16.8). Ele consiste em uma fonte de luz, um filtro que permite a passagem de apenas um único comprimento de onda de luz, o tubo de ensaio contendo a suspensão bacteriana e uma fotocélula que compara a quantidade de luz que passa pelo tubo com a luz total que entra no tubo. A capacidade da cultura de bloquear a luz pode ser expressa como porcentagem da luz transmitida pelo tubo ou quantidade de luz absorvida no tubo. A porcentagem de luz transmitida é inversamente proporcional à concentração bacteriana. A absorbância (ou densidade óptica) é diretamente proporcional à concentração da célula.


Fig. 16.8 Medição de turbidez usando espectrofotômetro

  • Várias diluições podem ser feitas de um estoque bacteriano.
  • Um contador Petroff-Hausser pode então ser usado para realizar uma contagem microscópica direta em cada diluição.
  • Em seguida, um espectrofotômetro pode ser usado para medir a absorbância de cada tubo de diluição.
  • Uma curva padrão comparando a absorbância com o número de bactérias pode ser feita traçando a absorbância versus o número de bactérias por cc.
  • Uma vez completada a curva padrão, qualquer tubo de diluição daquele organismo pode ser colocado em um espectrofotômetro e sua absorbância lida. Uma vez que a absorbância é determinada, a curva padrão pode ser usada para determinar o número correspondente de bactérias por cc.

16.2.6 Determinação do teor de nitrogênio

16.2.7 Determinação do peso seco

Também é possível acompanhar a mudança na quantidade de um componente celular em vez de toda a massa da célula. Este método pode ser escolhido porque a determinação de pesos secos é difícil ou quando o peso total da célula não fornece uma imagem precisa do número de indivíduos em uma população. Nesse caso, apenas um componente da célula é seguido, como proteína total ou DNA total. Isso tem algumas das mesmas vantagens e desvantagens listadas acima para peso seco. Além disso, a medição de um componente celular é mais trabalhosa do que os métodos mencionados anteriormente, uma vez que o componente de interesse deve ser parcialmente purificado e, em seguida, submetido a uma análise projetada para medir a molécula desejada. A suposição ao escolher um único componente, como o DNA, é que esse componente será relativamente constante por célula. Essa suposição tem um problema quando as taxas de crescimento são diferentes porque as células que crescem em altas taxas, na verdade, têm mais DNA por célula devido a múltiplas iniciações de replicação.

O crescimento bacteriano pode ser estimado indiretamente pela detecção de mudanças específicas causadas no meio de crescimento como resultado da atividade e multiplicação das células bacterianas. Inclui a detecção de produtos de células de atividade, como a produção de ácido e gás. Os testes de redução de corante, como o azul de metileno e os testes de redução de resazurina, baseiam-se no fato de que a cor conferida ao leite pela adição de um corante como o azul de metileno desaparecerá mais ou menos rapidamente. A remoção do oxigênio do leite e a formação de substâncias redutoras durante o metabolismo bacteriano fazem com que a cor desapareça. Os órgãos responsáveis ​​pelo consumo de oxigênio são as bactérias. Embora certas espécies de bactérias tenham consideravelmente mais influência do que outras, geralmente se presume que quanto maior o número de bactérias no leite, mais rápido o oxigênio será consumido e, por sua vez, mais cedo a cor desaparecerá. Assim, o tempo de redução é tomado como uma medida do número de organismos no leite, embora na verdade seja mais provável que seja mais uma medida do total de reações metabólicas que ocorrem na superfície celular da bactéria. A produção de gás por bactérias é outra atividade importante que pode ser considerada um índice de crescimento bacteriano. A detecção da produção de gás usando tubo de Durham e mudança na cor do meio de crescimento devido à redução dos ingredientes sensíveis ao pH presentes no meio são comumente usados ​​para a detecção de coliformes e leveduras produtores de ácido e gás. Um aparelho para medir CO2 a produção é representada na (Fig.16.9)


Reconhecimentos

H.T. e B.J.B. foram apoiados pelo Australian Research Council Discovery Project DP160102644 (concedido a B.J.B. e S.G.O.). V.J., J.M.G. e J.F.S. foram apoiados pelo Australian Research Council Discovery Project DP130103547 (concedido a V.J. e S.G.O.). NO. foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Pesquisa do Departamento de Educação e Treinamento e uma bolsa de estudos A. F. Pillow Applied Mathematics Top-up. J.E.F.G. foi apoiado pelo prêmio ARC Discovery Early Career Researcher DE130100031. E.L.T. foi apoiado por uma Adelaide Graduate Scholarship, bem como bolsa de estudos e financiamento de projetos da Wine Australia (GWR Ph1305). S.B. foi apoiado pelo Australian Research Council Future Fellowship Grant FT130100484. Este trabalho foi apoiado por recursos de supercomputação fornecidos pelo serviço Phoenix High Performance Computing da University of Adelaide.


Como posso medir o crescimento bacteriano em placas de ágar (por massa celular ou contagem de células)? - Biologia

Todos os métodos acima requerem a disponibilidade de equipamentos caros ou um investimento substancial de tempo. Na realidade, o método mais usado simplesmente monitora a densidade óptica da amostra. A absorbância da amostra medida em um espectrofotômetro é correlacionada ao peso seco ou ao número de células por volume.

A concentração de biomassa é uma das medições mais criticamente necessárias nos estudos de fermentação. É também um dos mais difíceis e não confiáveis. Por exemplo, todos os métodos de peso seco / úmido acima e todo o equipamento de contagem automática falham completamente se o caldo contiver outras partículas insolúveis, o que é frequentemente o caso em um fermentador prático. Da mesma forma, a medição da densidade óptica só tem utilidade limitada se o caldo de fermentação não estiver claro. Além disso, esses métodos não conseguem distinguir as células viáveis ​​das mortas. Por outro lado, a contagem de placas padrão pode detectar células viáveis ​​entre outras partículas. No entanto, o método requer preparações elaboradas e leva de 24 a 48 horas para as células serem incubadas e contadas. O custo das placas e meios de Petri também pode ser proibitivo. Consequentemente, a contagem direta de placas é inútil no controle de feedback de um processo de fermentação, ela é principalmente usada industrialmente para verificar outras medições, especialmente a densidade óptica.

Neste experimento, a densidade celular de uma determinada amostra será medida com os cinco métodos a seguir: peso úmido, peso seco, densidade óptica, contagem direta de células com uma câmara e diluições sucessivas seguidas de plaqueamento.


Esterilize usando um dos métodos descritos na página Esterilizando Líquidos.

Uma vantagem da mídia com alto teor de sal é que os micróbios contaminantes típicos não crescem nela, portanto, a mídia com uma concentração de sal de pelo menos 10% pode ser esterilizada por fervura.

Certifique-se de que o ágar se dissolva completamente. Em meios com 15% ou mais de sal, o ágar pode demorar para se dissolver. A mídia pode parecer turva ou você pode ver pequenos objetos translúcidos semelhantes a lentes flutuando nela. Continue fervendo até que a mídia esteja completamente limpa, o que pode levar mais de 15 minutos. O ágar dissolvido de maneira incompleta deixará a mídia mole ou frágil.


Assista o vídeo: MICROBIOLOGIA - CRESCIMENTO BACTERIANO - PROF. ALEXANDRE FUNCK (Agosto 2022).