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O que faz com que a cópia complementar de uma molécula de RNA se separe?

O que faz com que a cópia complementar de uma molécula de RNA se separe?



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Li recentemente um artigo que explica que, na hipótese do mundo do RNA, uma molécula de RNA é "digitalizada" pelo ácido nucleico, catalisada por uma outra molécula de RNA especificamente dobrada, para se organizar complementarmente à molécula original. No entanto, o que faz com que a nova molécula complementar se desprenda da molécula original? Sempre ouço dizer que esse par de bases complementares permite que a molécula de RNA se reproduza, mas nunca entendi direito: como? Se as bases complementares tendem a se ligar, a estrutura recém-formada não deveria ser estável? O que causa a reprodução real?


Em primeiro lugar, quero salientar que a hipótese do mundo do RNA é apenas isso - uma hipótese. Embora tenha sido demonstrado que é possível que certas moléculas de RNA façam cópias de si mesmas, essa não é uma função "normal" de nenhum RNA.

Editar - para dar uma resposta mais clara à própria pergunta:

Após a replicação de uma molécula de RNA, ela pode formar uma estrutura estável junto com seu molde ou pode se dissociar. Devido às várias possibilidades e complexidade das estruturas de RNA, é quase impossível prever isso, uma vez que tanto a sequência (exata) em si e as condições ambientais, especialmente a temperatura, são muito importantes.

Mais antecedentes da resposta não editada:

Se duas fitas complementares ou RNA (ou DNA) se ligam, não é algo que sempre pode ser respondido facilmente. Para o DNA de um determinado comprimento (em um determinado ambiente / tampão), pode-se mais ou menos prever a temperatura na qual as fitas complementares se separarão (geralmente chamada de temperatura de fusão), porque o DNA forma hélices relativamente estáveis. O RNA, entretanto, freqüentemente forma complicadas estruturas tridimensionais, freqüentemente envolvendo a autocomplementação e não se restringe às hélices típicas vistas no DNA. Tentar prever a estrutura 3D resultante das moléculas de RNA ainda é um campo de pesquisa em andamento. Algumas dessas estruturas são bastante estáveis ​​(por exemplo, em tRNA), mas em outros casos, elas também podem ser muito dinâmicas e mudar rapidamente. No final, sempre depende da sequência do RNA, da temperatura e de muitos outros fatores ambientais.


Introdução à RNA Biology: Cartoon Edition

O DNA contém as instruções de como construir tudo em nossos corpos. Cada uma de suas células contém uma cópia de seu DNA - como um conjunto de plantas. Partes dessas instruções são executadas conforme necessário em células diferentes.

Normalmente, as instruções nos projetos de DNA são seguidas para construir proteínas diferentes. As proteínas fazem muito do trabalho necessário para manter o funcionamento do corpo. A qualquer momento, uma célula pode estar seguindo as instruções de como fazer uma proteína imunológica para defender o corpo de invasores como vírus, enquanto outra está produzindo uma proteína que ajuda o estômago a digerir os alimentos.

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

Geralmente, o DNA é mantido dentro do núcleo, onde existe uma biblioteca central de plantas para a célula inteira. No entanto, as proteínas são construídas em uma parte diferente da célula. Como as instruções para as proteínas são transmitidas dos projetos de DNA para onde as proteínas são realmente construídas? Eles são transportados na forma de RNA mensageiro, ou mRNA. Cada mRNA contém uma cópia de um projeto específico da biblioteca maior de DNA. Ele carrega esse projeto para a célula, onde as proteínas são produzidas. (mRNAs não são o único tipo de RNA. Existem muitos outros tipos que fazem outras coisas, e falaremos mais sobre eles mais tarde!)

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

O mRNA é criado em um processo denominado transcrição. Uma enzima chamada RNA polimerase viaja ao longo da fita de DNA, trazendo blocos de construção de RNA complementares para criar uma “transcrição” das informações contidas no DNA. A molécula resultante é uma fita de RNA com uma missão: transmitir sua mensagem à parte da célula que cria as proteínas.

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

Uma vez que a transcrição é criada, ela deve passar por algumas modificações para estar pronta para a tradução (o processo pelo qual o conteúdo do mRNA é lido por uma máquina molecular chamada ribossomo e traduzido em uma sequência de blocos de construção de proteínas chamados aminoácidos).

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

Jennifer Cook-Chrysos / Instituto Whitehead

Como o mRNA é regulado?

As células desenvolveram várias maneiras de regular quais proteínas são feitas e quando. Os mRNAs se degradam naturalmente com o tempo, com a maioria tendo uma vida útil relativamente curta: as moléculas de mRNA em células de mamíferos podem permanecer por qualquer lugar de alguns minutos a alguns dias antes de serem degradadas. Uma maneira que as células regulam quanto de uma determinada proteína é produzida em um determinado momento é controlando por quanto tempo um mRNA permanece intacto. Desde que um mRNA esteja intacto, ele pode ser traduzido continuamente para produzir mais proteínas.

Alguns mRNAs duram até mil vezes mais do que outros. Um dos principais reguladores de quanto tempo os mRNAs permanecem intactos é um tipo diferente de RNA, chamado miroRNA (miRNA).

Pequeno mas poderoso

MicroRNAs são um dos muitos tipos de RNAs que não codificam para proteínas. Esses minúsculos RNAs, que têm apenas 22 blocos de construção, não são traduzidos no ribossomo como os RNAs mensageiros. Em vez disso, eles têm como alvo e se ligam a sequências em mRNAs específicos e podem bloquear a tradução do mRNA.


Estrutura e mecanismo da RNase Cas13a dependente de RNA de Rhodobacter capsulatus

Cas13a são efetores de molécula única da classe II, família Tipo VI de sistemas CRISPR-Cas que fazem parte dos sistemas de defesa bacteriana e arquea. Essas endonucleases de RNA guiadas por RNA e ativadas por RNA são caracterizadas por sua capacidade de clivar RNAs alvo complementares à sequência espaçadora de crRNA, bem como RNAs espectadores de uma maneira inespecífica para a sequência. Devido à clivagem dos transcritos celulares, eles induzem dormência na célula hospedeira e, assim, protegem a população bacteriana ao abortar o ciclo infeccioso dos fagos de RNA. Aqui nós relatamos a caracterização estrutural e funcional de uma enzima Cas13a da bactéria roxa foto-auxotrófica Rhodobacter capsulatus. A estrutura cristalina de raios-X do complexo RcCas13a-crRNA revela seu modo distinto de reconhecimento de crRNA, bem como a enzima em sua conformação de pré-ativação contraída. Usando mutagênese dirigida em combinação com espectrometria de massa, identificamos resíduos-chave responsáveis ​​pelo processamento de pré-crRNA por RcCas13a em seu sítio catalítico distinto, e elucidamos o mecanismo de reação de clivagem mediada por ácido-base. Além disso, RcCas13a cliva RNA-alvo, bem como RNAs observadores em Escherichia coli que requer sua atividade de nuclease de domínio ativo catalítico HEPN (ligação de nucleotídeos de eucariotos superiores e procariotos). Nossos dados fornecem informações adicionais sobre os mecanismos moleculares e a função desta família intrigante de endonucleases de RNA dependentes de RNA que já são empregadas como ferramentas eficientes para detecção de RNA e regulação da expressão gênica.


Passando pelo revisor

No início dos anos 2000, quando especialistas acreditavam que a infecção por coronavírus humano não causava nada pior do que o resfriado comum, Mark Denison lutou para conseguir verbas federais adequadas para sustentar seu laboratório no Centro Médico da Universidade de Vanderbilt.

Virologista e clínico, Denison vinha estudando coronavírus desde 1984, quando apenas dois dos sete coronavírus atualmente conhecidos por causar doenças em humanos eram conhecidos. Esses dois, junto com vários outros coronavírus, causam resfriados.

Denison inicialmente encontrou o vírus que estudou, que afeta apenas camundongos, o que é interessante porque leva a uma versão em camundongo da esclerose múltipla. Ao longo do caminho, ele ficou interessado em como o vírus se replicou & mdash, mas persuadir os financiadores a apoiar seu trabalho foi um verdadeiro desafio.

No início de 2003, ele e sua esposa, Laura, estavam de férias na Flórida, tendo uma conversa difícil. & ldquoAcho que o trabalho é importante. Acho que os modelos são importantes & rdquo, ele se lembra de ter dito. & ldquo (Mas) não sei se posso manter uma carreira. & rdquo

Esse foi o dia em que ele aprendeu sobre o patógeno por trás da doença respiratória mortal SARS, que vinha ganhando as manchetes.

"Literalmente na praia com minha esposa, alguém desceu do hotel e me disse que eu tinha um telefonema", disse ele. A ligação era de um colega, informando que o patógeno responsável pela doença havia sido identificado, que era um coronavírus.

A síndrome respiratória aguda grave varreu do sul da China para 26 países em 2002 e 2003, matando cerca de 10% das cerca de 8.000 pessoas infectadas. Embora o surto tenha sido contido, os coronavírus foram repentinamente reconhecidos como um problema sério de proporção potencialmente pandêmica.

Quase duas décadas depois, o trabalho feito no laboratório Denison & rsquos revelou-se fundamental no desenvolvimento de uma molécula, chamada remdesivir, que entrou em ensaios clínicos em grande escala apenas algumas semanas após a SARS-CoV-2, o coronavírus que causa COVID-19, foi identificado.

A molécula, ao que parece, pode superar os coronavírus e a superpotência: sua capacidade de revisar o genoma. Essa capacidade não é encontrada em outros vírus de RNA e torna os coronavírus resistentes à maioria dos medicamentos usados ​​contra outros vírus de RNA.

Os pesquisadores esperam saber nas próximas semanas se o remdesivir é um tratamento eficaz para pacientes com COVID-19. Nesse ínterim, o laboratório Denison & rsquos continuou a trabalhar para identificar outras moléculas que pudessem contornar a resistência viral.

& ldquoEsta é uma questão realmente importante para nós: esta é uma nova classe de medicamento que pode nos permitir projetar melhor mais medicamentos que podem contornar a função de revisão e inibir o vírus? & rdquo disse Denison, que agora dirige a divisão de doenças infecciosas pediátricas em Vanderbilt .

Não é o seu vírus de RNA comum

Como muitos vírus que causam doenças humanas, os coronavírus possuem um genoma composto de RNA.

Quando o vírus por trás da SARS foi identificado, um dos muitos tratamentos experimentais que os médicos tentaram usar foi uma molécula chamada ribavirina. Na época, a ribavirina era o medicamento de primeira linha para muitos vírus de RNA.

A ribavirina tem como alvo uma proteína viral chamada RNA polimerase dependente de RNA, ou RdRp, que é responsável pela replicação do genoma do coronavírus.

Craig Cameron é um virologista da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill que estuda os mecanismos moleculares de RdRp em picornavírus. & ldquo (RdRp) é um alvo de droga muito bem validado & rdquo Cameron disse. & ldquoE é um daqueles alvos que realmente têm o potencial de ter atividade antiviral pan-viral. & rdquo

A ribavirina pertence a uma classe de medicamentos antivirais denominados nucleotídeos ou análogos de nucleosídeos.

Exatamente como a ribavirina funciona parece variar de um vírus para outro, tornando-se uma boa ilustração dos vários modos de ação possíveis dos análogos de nucleotídeos. Alguns funcionam bloqueando a polimerase viral, encerrando uma fita crescente de RNA. Alguns são mutagênicos, que penetram no genoma viral em crescimento, permitindo que a polimerase continue, mas introduzem alguma ambigüidade molecular na próxima rodada de replicação que causa uma cascata de erros nas gerações posteriores. Alguns bloqueiam enzimas metabólicas, impedindo a síntese ou processamento de ribonucleotídeos reais e, assim, retardando a replicação.

Uma revisão sistemática de dados de 30 ensaios clínicos, conduzidos após a epidemia de SARS, não mostrou nenhum benefício conclusivo da ribavirina & mdash ou de qualquer outro tratamento testado & mdash e alguma evidência de que a ribavirina fez mal aos pacientes.

Ribavirin foi o primeiro exemplo. Desde então, a maioria dos análogos de nucleotídeos experimentados contra os coronavírus que causam a SARS e a síndrome respiratória do Oriente Médio, ou MERS, não têm sido tratamentos eficazes. Referindo-se à ribavirina e ao clássico análogo de nucleosídeo 5-fluorouracil, que funciona como um mutagênico, Denison disse: “Os coronavírus são completamente, inteiramente resistentes a essas drogas. Você pode mergulhá-los nele, e eles não têm efeito. & Rdquo

Revisão viral vigorosa

Bruno Canard é o principal investigador de um grupo de replicação viral no Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica. Antes do surto de SARS, Canard havia se concentrado na estrutura e nas relações de hactividade dos análogos de nucleotídeos usados ​​para tratar o HIV e outros vírus. Como muitos virologistas, ele foi inspirado pelo quase acidente com a SARS para iniciar novos programas de pesquisa.

"Ficamos surpresos que a ribavirina era muito tóxica e não muito eficaz (contra) os coronavírus", disse Canard.

Tanto a equipe do CNRS em Marseille quanto o grupo Denison & rsquos no Tennessee decidiram entender mais sobre o vírus que causou a SARS, e uma de suas principais questões era por que a ribavirina, amplamente eficaz contra outros vírus de RNA, falhou contra este.

A resposta está no grande genoma da família do vírus e em como ele evoluiu para se proteger.

"Acredita-se que os vírus de RNA tenham tanto sucesso porque suas polimerases cometem erros", disse Denison. & ldquoEles não têm a capacidade de corrigir erros, por isso geram enxames mutantes de vírus que estão prontos para serem adaptados em diferentes ambientes. & rdquo

Biólogos estruturais descrevem RNA polimerases dependentes de RNA como semelhantes a uma mão em concha, com os dedos e o polegar protegendo o sítio ativo da enzima e rsquos. À medida que cada nova nucleobase na fita modelo entra no sítio ativo, a polimerase coordena um novo ribonucleotídeo de entrada combinando-o com sua contraparte na fita existente. Se o ajuste estiver correto, a enzima catalisa a formação de uma ligação na estrutura do RNA. Se o ajuste for próximo o suficiente, muitas RNA polimerases virais irão catalisar uma ligação de qualquer maneira. Uma taxa de erro que pode chegar a um erro por 10.000 bases permite que surjam esses enxames mutantes. Mas para coronavírus, a taxa de erro de replicação é menor.

Os coronavírus possuem alguns dos genomas mais longos do mundo viral de RNA. Enquanto seus primos mais próximos têm genomas com média de 10 quilobases, os genomas do coronavírus são três vezes mais longos. Com tanto material genético para copiar, se os coronavírus sofressem mutação na mesma taxa que outros vírus de RNA, eles acumulariam tantas mutações que mal produziriam qualquer progênie viável.

Conforme os pesquisadores da área passaram a compreender melhor o coronavírus RdRp, eles descobriram que a polimerase por si só não poderia explicar a desconexão. O virologista François Ferron, cientista da equipe do CNRS, tem trabalhado na replicação do coronavírus desde o surto de SARS. "A RNA polimerase viral é bastante frouxa, o que significa que tende a cometer muitos erros", disse ele. & ldquoTalvez um pouco mais do que a RNA polimerase regular (celular). & rdquo

Isso levou os pesquisadores a suspeitar que os coronavírus podem ter alguma maneira de reconhecer e corrigir erros.

Uma equipe internacional conduzindo um estudo do genoma viral da SARS identificou uma série de enzimas de processamento de RNA potenciais com base em sua homologia com outras enzimas conhecidas. Em 2006, o grupo Canard & rsquos trabalhou com membros dessa equipe internacional de bioinformática para mostrar que uma dessas enzimas, como seus homólogos, podia clivar o RNA de fita dupla e era necessária para a replicação viral bem-sucedida.

“Houve uma especulação de que (coronavírus) poderiam codificar uma função de revisão que lhes permitiria estabilizar um grande genoma, e havia um lugar previsto no genoma onde isso poderia ocorrer,” explicou Denison. & ldquoIsso realmente nos levou a tentar os experimentos genéticos. & rdquo

Em 2007, seu grupo descobriu que em vírus sem a proteína codificada no mesmo local, uma proteína chamada nsp14, os coronavírus de um vírus modelo de camundongo acumulavam mutações a uma taxa semelhante a outros vírus de RNA. E cepas do vírus sem nsp14, eles descobriram, eram sensíveis à ribavirina.

Dando continuidade a esse trabalho, o grupo francês se concentrou em como o nsp14 funcionava em um tubo de ensaio. "Não trabalhamos no vírus, como Mark Denison estava fazendo muito bem", disse Canard. & ldquoNós apenas nos concentramos nessa enzima & hellip e descobrimos que ela pode realmente extirpar a ribavirina. & rdquo

A equipe do CNRS publicou um estudo de enzimologia que confirmou que o nsp14 pode identificar e remover incompatibilidades entre as bases no final de uma cópia crescente do RNA viral em 2018, eles seguiram com a confirmação de que quando a ribavirina é incorporada em uma fita de RNA em crescimento, a proteína nsp14 pode colher para fora da fita paralisada, permitindo que a replicação seja retomada.

Enquanto os pesquisadores elaboravam a enzimologia, surgiu uma questão urgente: suas descobertas significavam que todos os análogos de nucleotídeos seriam inúteis contra os coronavírus?

"Esta questão é realmente a chave agora no desenvolvimento de inibidores de análogos de nucleosídeo", disse Canard.

Anatomia de uma molécula: o que torna o remdesivir único?

Fugindo da revisão viral

É aqui que entra o remdesivir.

& ldquoDa minha perspectiva, a história (remdesivir) começou em 2013 & rdquo Denison disse. & ldquoNós descobrimos que os coronavírus codificam o único sistema de revisão de RNA conhecido & hellip (e) eu queria testar se havia algum nucleosídeo que pudesse estar ativo no ambiente de revisão de coronavírus. & rdquo

Denison ouviu de Cameron sobre uma colaboração de pesquisa com Gilead Sciences. Cameron estava trabalhando para entender o mecanismo preciso de ação de um grupo de análogos de nucleotídeos que a empresa estava usando para tratar a hepatite C, um vírus de RNA que infecta dezenas de milhares de pessoas a cada ano.

Antes da corrida para a hepatite C, de acordo com Adrian Ray, um químico medicinal que trabalhava na Gilead, “o espaço nuc para polimerases de RNA e para vírus de RNA realmente não era muito explorado”.

Enquanto tentava vencer os concorrentes no lucrativo mercado da hepatite C, a Gilead desenvolveu uma grande biblioteca de inibidores da RNA polimerase dependentes de RNA, incluindo a molécula que viria a ser conhecida como remdesivir. Um composto intimamente relacionado ao remdesivir chegou aos primeiros testes clínicos para hepatite C, mas vacilou, em parte porque, como o remdesivir, precisava ser administrado por injeção. A Gilead mudou de estratégia, comprando uma startup de biotecnologia para obter acesso ao análogo de nucleotídeo disponível por via oral da startup & rsquos, que se tornou um componente-chave do coquetel de hepatite C da Gilead & rsquos.

Trabalhando com a RNA polimerase dependente de RNA do poliovírus, Cameron havia começado um trabalho que mostraria que a molécula era um terminador de cadeia não obrigatório, um tipo de análogo de nucleotídeo que a polimerase deveria ser capaz de incorporar em uma fita em crescimento e continuar & mdash, mas não conseguiu.

Intrigado, Denison contatou a Gilead para pedir permissão para experimentar aquele medicamento aprovado, chamado sofosbuvir, contra coronavírus de camundongo.

"Essa foi a droga que mudou o mundo e curou a hepatite C", disse Denison. "Eles não iam deixar um virologista pouco conhecido trabalhando em um coronavírus usar seus medicamentos." desenvolvido internamente e arquivado para hepatite C. Eles haviam mostrado resultados promissores em estudos iniciais como um tratamento candidato para outras infecções virais, incluindo contra o vírus Ebola.

As moléculas candidatas chegaram. Denison e seus estagiários não tinham ideia do que eles eram. Mas eles foram em frente e os testaram. O que eles descobriram foi empolgante: em cultura de células de camundongos, os medicamentos podem bloquear a replicação do coronavírus.

& ldquoAssim, perguntamos aos nossos colaboradores da Gilead: & lsquoO que é isso (composto)? & rsquo Eles disseram: & lsquo & rsquore não vamos dizer a você, mas nós & rsquore vamos enviar a você 60 pró-drogas, modificações químicas do mesmo composto, & rdquo Denison disse.

Um desse segundo lote de moléculas provou ser remdesivir. A pós-graduanda Maria Agostini, que ingressou recentemente no laboratório Denison & rsquos, foi uma das pesquisadoras que trabalharam na compreensão de sua forte atividade.

"Nós trabalhamos com alguns compostos potentes, mas remdesivir foi realmente um dos primeiros com os quais trabalhei", disse Agostini. & ldquoQuando você estava olhando para as células, podia ver visualmente menos evidências de replicação viral em andamento. & rdquo

Enquanto as células em seus pratos de controle estavam visivelmente infectadas, sofrendo efeitos citopáticos ruins, as células tratadas com remdesivir após a infecção sobreviveram bem. Ao cultivar muitas gerações do vírus em células tratadas com concentrações subterapêuticas de remdesivir, selecionando mutações que deixariam o vírus escapar da droga, Agostini e seus colegas Erica Andres e Clint Smith demonstraram que seriam necessárias mutações na polimerase viral para conferir resistência a remdesivir & mdash e que esses vírus mutantes eram menos capazes de infectar os hospedeiros do que o tipo selvagem.

A Gilead forneceu o medicamento gratuitamente, e o National Institutes of Health financiou os pesquisadores por meio de um programa que visa desenvolver tratamentos para doenças infecciosas emergentes. & Lt / p & gt

"Isso mostra o valor da ciência colaborativa", disse Denison. & ldquoEsta foi uma empresa que se comprometeu a nos ajudar a fazer isso quando ninguém estava interessado em coronavírus e um mecanismo de concessão que permite alguma flexibilidade em termos de expansão. & rdquo

Recentemente, o laboratório de enzimologia Mathias Götte & rsquos, no Canadá, examinou como o remdesivir atua nas enzimas polimerase do coronavírus que causa a MERS. Pesquisadores do grupo Götte & rsquos determinaram que o composto interrompe a polimerase, agindo como um terminador de cadeia & mdash, mas não imediatamente.

Andrea Pruijssers, virologista que dirige o programa de pesquisa de antivirais no grupo Denison & rsquos, disse: & ldquo (Remdesivir) de alguma forma foge do reconhecimento pela enzima de revisão. & Rdquo

Em vez de interromper a polimerase assim que é incorporada, o remdesivir parece permitir que a enzima continue funcionando por mais alguns ciclos, mas depois faz com que ela pare. Os pesquisadores suspeitam que o tropeço molecular pode ser causado por uma estrutura incomum no duplex do RNA da cópia do modelo.

“Eles pensam que, nesse ponto, o análogo de nucleosídeo que já foi incorporado está protegido da enzima de revisão”, disse Pruijssers.

No laboratório de Denison & rsquos, colaborador de longa data, Ralph Baric, da Universidade da Carolina do Norte, em Chapel Hill, os pesquisadores descobriram que o remdesivir foi um tratamento eficaz para camundongos infectados com a SARS. Esses resultados foram promissores o suficiente para levar o remdesivir a um estudo de MERS em macacos, publicado em fevereiro por pesquisadores do Laboratório das Montanhas Rochosas do NIH. A droga mostrou algum benefício na redução da gravidade da doença, desde que os macacos fossem tratados profilaticamente.

Em termos de desenvolvimento de medicamentos, o remdesivir "meio que alcançou todos os marcos ao longo do caminho, de nossa perspectiva", disse Denison.

Classe de droga semelhante, resultado diferente

Quando Pruijssers começou no laboratório Denison em 2017, eles tinham outra molécula para investigar, beta-D-N4-hidroxicitidina, ou NHC, que estava sendo testada no Emory Institute for Drug Development como um potencial medicamento antiviral de amplo espectro.

Agostini também liderou o primeiro estudo dessa droga, mostrando sua atividade em cultura de tecidos. Em março, pesquisadores dos laboratórios Baric e Denison publicaram um follow-up na Science Translational Medicine, mostrando que o NHC pode bloquear a replicação nos vírus que causam MERS e SARS & mdash e também no coronavírus que causa COVID-19.

& ldquoIt & rsquos interessante & rdquo Pruijssers disse. & ldquo (NHC) não atua como um terminador de cadeia. Ele se incorpora ao genoma e, em seguida, causa mutagênese letal. & Rdquo

Por meio de sua capacidade de emparelhar com mais de um nucleotídeo na fita complementar, o NHC introduz uma cascata de erros em rodadas sucessivas de replicação. Eventualmente, a progênie viral não tem as informações de que precisa para produzir um novo vírus.

Enquanto o remdesivir interrompe a polimerase em seu caminho, causando poucas novas mutações, experimentos de sequenciamento profundo nos poucos vírus que surgiram após o tratamento com NHC mostraram que a droga causa inúmeras mutações.

"Identificamos dois compostos que se enquadram estruturalmente na mesma classe de análogos de nucleosídeos, mas atuam de maneira muito diferente nos coronavírus", disse Agostini.

Eles ficaram particularmente encorajados porque o trabalho mostrou que o NHC tem alguma eficácia terapêutica no modelo de camundongo de MERS & mdash e que pode bloquear até mesmo cepas de coronavírus resistentes ao remdesivir.

Em uma entrevista no início de março, Pruijssers disse que o NHC ainda não foi testado como um agente terapêutico. & ldquoÉ difícil desenvolver um mutagênico, porque o FDA geralmente não gosta da ideia de mutação, a menos que seja para uma doença com risco de vida. & rdquo

Mas a pandemia mudou as coisas. A Emory fez parceria com a empresa de biotecnologia de Miami Ridgeback Biotherapeutics para desenvolver a molécula, e a Emory entrou com um pedido de permissão junto à Food and Drug Administration dos EUA para iniciar os primeiros testes em humanos para testar a segurança da molécula.

Denison descreveu o papel central que Agostini desempenhou: & ldquoEm cinco anos de pós-graduação, Maria testou e desenvolveu a análise in vitro detalhada de duas drogas potenciais para tratar este coronavírus pandêmico & mdash e as conduziu durante todo o desenvolvimento pré-clínico in vitro. & Rdquo

É um feito notável e altamente incomum. O desenvolvimento de medicamentos é conhecido por sua alta taxa de falha. É claro que muitos candidatos a medicamentos que parecem promissores em estudos pré-clínicos vacilam em grandes testes em humanos.

Enfrentando a pandemia

Depois de argumentar por uma década que o mundo deve estar pronto para uma pandemia, Denison disse no início de março que era estranho enfrentá-la.

& ldquoIt & rsquos realmente estranho que trabalhamos nisso nos últimos seis anos, e as drogas eram somente conseguindo passar, e eles estavam prontos para ir, ”ele disse. & ldquo & rsquoll ver qual é o resultado. & rdquo

Ele tem algumas preocupações sobre como interpretar os dados dos ensaios clínicos que testam o quão bem o remdesivir funciona para COVID-19 em humanos, o primeiro dos quais deverá ser lançado este mês como um ensaio no China & ndashJapan Friendship Hospital em Wuhan conclui. (Outros testes, patrocinados pela Gilead, o NIH e a Organização Mundial da Saúde, lançados posteriormente.)

Em primeiro lugar, os dados de animais de outros coronavírus sugerem que a droga é mais eficaz quando administrada profilaticamente, após os animais serem expostos, mas antes de começarem a desenvolver os sintomas. No contexto de uma pandemia global, isso seria difícil de conseguir em humanos. Em algum ponto do curso da infecção, uma resposta imune extremamente forte começa a causar mais danos do que o vírus. Nesse ponto, Denison disse, pode ser tarde demais para um antiviral ajudar.

Em segundo lugar, os dados dos primeiros ensaios provavelmente apresentam nuances e requerem uma interpretação cuidadosa - para a qual Denison se preocupa que o discurso público não esteja bem preparado. Os primeiros ensaios em humanos do composto irmão de remdesivir e rsquos em pacientes com hepatite mostraram diferenças dramáticas entre os indivíduos na resposta antiviral, e o próprio remdesivir mostrou benefício limitado em comparação com outras terapias candidatas em um ensaio clínico em pacientes com ebola. "As pessoas tendem a ter uma mentalidade de vencedor ou perdedor", disse ele. & ldquoEles pediram remdesivir & lsquote que falhou com o medicamento para o ebola & rsquo, certo? Ele não falhou no teste do Ebola, apenas não foi avançado porque não mostrou tantos benefícios quanto os outros dois compostos.

Qualquer que seja o resultado dos ensaios clínicos de remdesivir e NHC, Denison disse que espera que esta crise sublinhe a importância de financiar a investigação de vírus potencialmente pandémicos antes do início dos surtos.

& ldquoTentar manter investigações básicas e desenvolvimento de drogas contra algo que tem alto, alto, alto impacto, mas baixa, baixa, baixa probabilidade é realmente difícil em nosso mundo. Realmente difícil ”, disse ele. & ldquoNós simplesmente nunca desistimos da ideia de que precisávamos ter essas coisas prontas e guardá-las no balde. & rdquo


A ondulação da transcriptase reversa

Em 1970, dois laboratórios demonstraram bioquimicamente que o RNA poderia ser usado como molde para o DNA. Howard Temin argumentou que o RNA de alguns vírus deve ser copiado em DNA em certos tipos de células, a fim de explicar a "transformação" de células normais em células cancerosas por esses vírus. Detectar a enzima responsável por essa síntese de DNA dependente de RNA foi uma evidência importante que convenceu muitos ex-céticos de que sua teoria era válida. Para muitos, os novos resultados pareciam consistentes com as previsões do dogma central, mas para outros, essas descobertas foram vistas como um desafio a ele. Um escritor chegou a sugerir que a existência de "transcrição invertida" (cópia de RNA para fazer DNA) significava que todo o dogma central precisava ser reexaminado. Em retrospecto, parece um pouco estranho que este escritor (anônimo) não se preocupou em reler a formulação original antes de pedir que ela fosse descartada! Crick respondeu ao desafio e algumas semanas depois publicou uma visão ampliada do dogma central. Ele reiterou que a transferência de informações de RNA para RNA, de RNA para DNA, ou talvez até mesmo de DNA para proteína (diretamente, sem um intermediário de RNA) eram todas "transferências especiais" que podem ocorrer em certos tipos de células. Como tal, eram perfeitamente consistentes tanto com a hipótese da sequência quanto com o fluxo de informações entre os ácidos nucléicos ou dos ácidos nucléicos para as proteínas. Assim, as recém-descobertas ‘transcriptases reversas’, como as DNA polimerases dependentes de RNA são agora chamadas, não perturbaram o dogma central, apesar da ‘ondulação’ inicial. No entanto, Crick também apontou para três "transferências desconhecidas", de proteína para proteína, RNA ou DNA. Essas transferências, se comprovadas, exigiriam uma reformulação radical dos princípios moleculares. Se os produtos gênicos (proteínas) pudessem alterar genes (sequências de DNA), estaria aberto o caminho para a herança de características adquiridas. Em 1970, Crick sentiu que as evidências disponíveis ainda eram insuficientes para concluir que o dogma central estava certo de ser correto, embora sustentasse que provavelmente permaneceria útil. Mais recentemente, descobriu-se que, em certas circunstâncias, as sequências de DNA de um organismo foram alteradas no que parecia ser uma forma direcionada em resposta a estímulos ambientais. Além de expandir nossa compreensão da origem das mutações, os experimentos levantaram a possibilidade de que proteínas "vantajosas" podem causar mutações "vantajosas". Assim, a análise da origem das mutações "adaptativas" é crucial para avaliar a validade do dogma central, uma vez que levantou a possibilidade de que a informação pode fluir das proteínas para os ácidos nucleicos. Veja também Replicação Retroviral, Baltimore, David e Temin, Howard Martin


'RNA World'

A versatilidade do RNA em função e forma ajudou a inspirar a ideia conhecida como "RNA world" hypothesis.

Organisms rely on an astoundingly complicated system of DNA, RNA and protein to transmit hereditary information, and scientists have long wondered how this system could have arisen in early life-forms. RNA offers a logical answer, He said: This molecule can both store genetic information and catalyze reactions, suggesting that early, simple organisms could have relied solely on RNA.

"It's a hybrid," He said. "So it makes perfect sense as a start."

Additionally, He said, RNA's sugar base, ribose, always appears first in organisms, as it's easier to make. Deoxyribose then gets created from ribose. "So that implies in life, you have the ribose, the RNA first, and then the DNA comes later," He said.

From that simpler RNA start, more-complex life could arise, evolving the stabler DNA to serve as a long-term library and developing protein as a more efficient catalyst.


Functions of RNA Polymerase

Traditionally, the central dogma of molecular biology has looked at RNA as a messenger molecule, that exports the information coded into DNA out of the nucleus in order to drive the synthesis of proteins in the cytoplasm: DNA → RNA → Protein. The other well known RNAs are transfer RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA) which are also intimately connected with the protein synthetic machinery. However, over the past two decades, it has become increasingly clear that RNA serves a range of functions, of which protein coding is only one part. Some regulate gene expression, others act as enzymes, some are even crucial in the formation of gametes. These are called non-coding or ncRNA.

Since RNAP is involved in the production of molecules that have such a wide range of roles, one of its main functions is to regulate the number and kind of RNA transcripts formed in response to the cell’s requirements. A number of different proteins, transcription factors and signaling molecules interact with the enzyme, especially the carboxy-terminal end of one subunit, to regulate its activity. It is believed that this regulation was crucial for the development of eukaryotic plants and animals, where genetically identical cells show differential gene expression and specialization in multicellular organisms.

In addition, the optimal functioning of these RNA molecules depends on the fidelity of transcription – the sequence in the DNA template strand must be represented accurately in the RNA. Even a single base change in some regions can lead to a completely non-functional product. Therefore, while the enzyme needs to work quickly and complete the polymerization reaction in a short span of time, it needs robust mechanisms to ensure extremely low error rates. The nucleotide substrate is screened at multiple steps for complementarity to the template DNA strand. When the correct nucleotide is present, it creates an environment conducive to catalysis and the elongation of the RNA strand. Additionally, a proofreading step allows incorrect bases to be excised.

There is remarkable similarity in the RNA polymerases found in prokaryotes, eukaryotes, archea and even some viruses. This points to the possibility that they evolved from a common ancestor. Prokaryotic RNAP is made of four subunits, including a sigma-factor that dissociates from the enzyme complex after transcription initiation. While prokaryotes use the same RNAP to catalyze the polymerization of coding as well as non-coding RNA, eukaryotes have five distinct RNA polymerases.

Eukaryotic RNAP I is a workhorse, producing nearly fifty percent of the RNA transcribed in the cell. It exclusively polymerizes ribosomal RNA, which forms a large component of ribosomes, the molecular machines that synthesize proteins. RNA Polymerase II is extensively studied because it is involved in the transcription of mRNA precursors. It also catalyzes the formation of small nuclear RNAs and micro RNAs. RNAP III transcribes transfer RNA, some ribosomal RNA and a few other small RNAs and is important since many of its targets are necessary for normal functioning of the cell. RNA polymerases IV and V are found exclusively in plants, and together are crucial for the formation of small interfering RNA and heterochromatin in the nucleus.


Basics of DNA Replication

Figure 4. The three suggested models of DNA replication. Grey indicates the original DNA strands, and blue indicates newly synthesized DNA.

The elucidation of the structure of the double helix provided a hint as to how DNA divides and makes copies of itself. This model suggests that the two strands of the double helix separate during replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied. What was not clear was how the replication took place. There were three models suggested: conservative, semi-conservative, and dispersive (see Figure 4).

Na replicação conservadora, o DNA parental permanece junto e as fitas filhas recém-formadas ficam juntas. The semi-conservative method suggests that each of the two parental DNA strands act as a template for new DNA to be synthesized after replication, each double-stranded DNA includes one parental or “old” strand and one “new” strand. In the dispersive model, both copies of DNA have double-stranded segments of parental DNA and newly synthesized DNA interspersed.

Meselson and Stahl were interested in understanding how DNA replicates. They grew E. coli for several generations in a medium containing a “heavy” isotope of nitrogen ( 15 N) that gets incorporated into nitrogenous bases, and eventually into the DNA (Figure 5).

Figure 5. Meselson and Stahl experimented with E. coli grown first in heavy nitrogen ( 15 N) then in 14 N. DNA grown in 15 N (red band) is heavier than DNA grown in 14 N (orange band), and sediments to a lower level in cesium chloride solution in an ultracentrifuge. When DNA grown in 15 N is switched to media containing 14 N, after one round of cell division the DNA sediments halfway between the 15 N and 14 N levels, indicating that it now contains fifty percent 14 N. In subsequent cell divisions, an increasing amount of DNA contains 14 N only. This data supports the semi-conservative replication model. (crédito: modificação da obra de Mariana Ruiz Villareal)

o E. coli culture was then shifted into medium containing 14 N and allowed to grow for one generation. The cells were harvested and the DNA was isolated. The DNA was centrifuged at high speeds in an ultracentrifuge. Some cells were allowed to grow for one more life cycle in 14 N and spun again. During the density gradient centrifugation, the DNA is loaded into a gradient (typically a salt such as cesium chloride or sucrose) and spun at high speeds of 50,000 to 60,000 rpm. Under these circumstances, the DNA will form a band according to its density in the gradient. DNA grown in 15 N will band at a higher density position than that grown in 14 N. Meselson and Stahl noted that after one generation of growth in 14 N after they had been shifted from 15 N, the single band observed was intermediate in position in between DNA of cells grown exclusively in 15 N and 14 N. This suggested either a semi-conservative or dispersive mode of replication. The DNA harvested from cells grown for two generations in 14 N formed two bands: one DNA band was at the intermediate position between 15 N and 14 N, and the other corresponded to the band of 14 N DNA. These results could only be explained if DNA replicates in a semi-conservative manner. Therefore, the other two modes were ruled out.

During DNA replication, each of the two strands that make up the double helix serves as a template from which new strands are copied. A nova vertente será complementar à vertente parental ou “antiga”. When two daughter DNA copies are formed, they have the same sequence and are divided equally into the two daughter cells.


Art Connections

Figure Errors in splicing are implicated in cancers and other human diseases. What kinds of mutations might lead to splicing errors? Think of different possible outcomes if splicing errors occur.

Figure Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of the intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may impair splicing. Mutations may also add new spliceosome recognition sites. Splicing errors could lead to introns being retained in spliced RNA, exons being excised, or changes in the location of the splice site.


Assista o vídeo: Practice writing the complementary strand of DNA and mRNA during transcription (Agosto 2022).