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8.2: Isolando ou Detectando uma Sequência Específica por PCR - Biologia

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Componentes da reação de PCR

o Reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método de replicação de DNA que é realizado em um tubo de ensaio (ou seja, em vitro) Aqui, "polimerase" se refere a uma enzima DNA polimerase extraída e purificada de bactérias, e "reação em cadeia" se refere à capacidade desta técnica de produzir milhões de cópias de uma molécula de DNA, usando cada hélice dupla recém-replicada como um modelo para sintetizar dois novas duplas hélices de DNA. A PCR é, portanto, um método muito eficiente de amplificação do DNA.

Além de sua capacidade de produzir grandes quantidades de DNA, há uma segunda característica do PCR que o torna extremamente útil. Lembre-se de que a maioria das DNA polimerases pode apenas adicionar nucleotídeos ao final de uma fita existente de DNA e, portanto, requer um primer para iniciar o processo de replicação. Para PCR, são usados ​​primers sintetizados quimicamente de cerca de 20 nucleotídeos. Em um PCR ideal, os primers apenas hibridizam com sua sequência complementar exata na fita modelo (Figura ( PageIndex {3} )).

O experimentador pode, portanto, controlar exatamente qual região de um molde de DNA é amplificada, controlando a sequência dos primers usados ​​na reação.

Para conduzir uma amplificação por PCR, um experimentador combina em um pequeno tubo de parede fina (Figura ( PageIndex {4} )), todos os componentes necessários para a replicação do DNA, incluindo DNA polimerase e soluções contendo nucleotídeos (dATP, dCTP , dGTP, dTTP), um modelo de DNA, primers de DNA, um tampão de pH e íons (por exemplo, Mg2+) exigida pela polimerase. As reações de PCR bem-sucedidas foram conduzidas usando apenas uma única molécula de DNA como molde, mas, na prática, a maioria das reações de PCR contém muitos milhares de moléculas de molde. O DNA molde (por exemplo, DNA genômico total) geralmente já foi purificado a partir de células ou tecidos usando as técnicas descritas acima. No entanto, em algumas situações, é possível colocar células inteiras diretamente em uma reação de PCR para uso como modelo.

Um aspecto essencial do PCR é ciclagem térmica, significando a exposição da reação a uma série de temperaturas precisamente definidas (Figura ( PageIndex {5} )). A mistura reaccional é primeiro aquecida a 95 ° C. Isso faz com que as ligações de hidrogênio entre as fitas das moléculas de DNA modelo derretam, ou desnaturar. Isso produz duas moléculas de DNA de fita simples de cada hélice dupla (Figura ( PageIndex {6} )). Na próxima etapa (anelamento), a mistura é arrefecida a 45-65 ° C. A temperatura exata depende da sequência de primer usada e dos objetivos do experimento. Isso permite a formação de hélices de fita dupla entre as moléculas de DNA complementares, incluindo o anelamento de primers ao molde. Na etapa final (extensão) a mistura é aquecida a 72 ° C. Esta é a temperatura na qual a DNA polimerase específica usada na PCR é mais ativa. Durante a extensão, a nova fita de DNA é sintetizada, começando na extremidade 3 'do primer, ao longo do comprimento da fita molde. Todo o processo de PCR é muito rápido, com cada fase de temperatura geralmente durando 30 segundos ou menos. Cada ciclo de três temperaturas (desnaturação, recozimento, extensão) é geralmente repetido cerca de 30 vezes, amplificando a região alvo em aproximadamente 230-dobrar. Observe na figura que a maioria das fitas recentemente sintetizadas na PCR começam e terminam com sequências idênticas ou complementares às sequências do iniciador; embora alguns fios sejam mais longos do que isso, eles são uma pequena minoria que quase sempre podem ser ignorados.

Figura ( PageIndex {6} ): PCR com as três fases do ciclo térmico numeradas. A fita modelo (azul) é replicada a partir dos primers (vermelho), com fitas recém-sintetizadas em verde. As fitas verdes flanqueadas por dois locais de ligação do primer aumentarão em abundância exponencialmente por meio de sucessivos ciclos de PCR. (Wikipedia-madprime-GFDL)

As primeiras reações de PCR usaram uma polimerase de E. coli. Como a alta temperatura da etapa de desnaturação destruiu a enzima, uma nova polimerase teve que ser adicionada após cada ciclo. Para superar isso, os pesquisadores identificaram termoestável DNA polimerases, como Taq DNA pol, a partir de Thermus acquaticus, uma bactéria termofílica que vive em fontes termais. Taq, e polimerases termoestáveis ​​semelhantes de outros ambientes quentes, são capazes de permanecer funcionais nos ciclos repetidos de amplificação. A polimerase Taq geralmente não pode amplificar fragmentos por mais de cerca de 3 kbp, mas sob algumas condições especializadas, a PCR pode amplificar fragmentos de até aproximadamente 10 kbp. Outras polimerases, sozinhas ou em combinação com Taq, são usadas para aumentar o comprimento dos fragmentos amplificados ou para aumentar a fidelidade da replicação.

Após a conclusão da ciclagem térmica (amplificação), uma alíquota da reação de PCR é geralmente carregada em um gel eletroforético (descrito abaixo) para determinar se um fragmento de DNA do comprimento esperado foi amplificado com sucesso ou não. Normalmente, o DNA do molde original será tão diluído que não será visível no gel, apenas o produto de PCR amplificado. A presença de uma banda nítida do comprimento esperado indica que a PCR foi capaz de amplificar seu alvo. Se o objetivo do PCR era testar a presença de uma sequência modelo específica, esse é o fim do experimento. Caso contrário, o produto de PCR restante pode ser usado como material de partida para uma variedade de outras técnicas, como sequenciamento ou clonagem.

Uma aplicação de PCR: o caso StarLink

O PCR é muito sensível (o que significa que pode amplificar quantidades iniciais muito pequenas de DNA) e específico (o que significa que pode amplificar apenas a sequência alvo de uma mistura de muitas sequências de DNA). Isso fez do PCR a ferramenta perfeita para testar se o milho geneticamente modificado estava presente em produtos de consumo nas prateleiras dos supermercados. Embora atualmente (2013) 85% do milho nos Estados Unidos seja geneticamente modificado e contenha genes que reguladores governamentais aprovaram para consumo humano, em 2000, grupos ambientais mostraram que uma cepa de milho geneticamente modificado, que havia sido aprovada apenas para usado como ração animal, tinha sido misturado ao milho usado na produção de comida humana, como cascas de taco.

Para fazer isso, os grupos compraram conchas de taco de lojas na área de Washington DC, extraíram DNA das conchas de taco e usaram-no como um modelo em uma reação de PCR com primers específicos para o gene não autorizado (Cry9C) Suas suspeitas foram confirmadas quando eles executaram este produto de PCR em um gel de agarose e viram uma faixa do tamanho esperado. O teste de PCR foi capaz de detectar um kernel transgênico em um alqueire inteiro de milho (1 por 100.000). A empresa (Aventis) que vendeu a semente transgênica aos agricultores teve que pagar pela destruição de grandes quantidades de milho e foi alvo de uma ação coletiva movida por consumidores furiosos que afirmavam ter ficado doentes com as cascas de taco. Embora nenhum caso legítimo de dano tenha sido provado, os demandantes receberam US $ 9 milhões, dos quais US $ 3 milhões foram para as taxas legais, e o restante da sentença foi para os consumidores na forma de cupons de conchas de taco. O caso prejudicou a empresa e expôs uma fraqueza na maneira como as safras geneticamente modificadas eram tratadas nos Estados Unidos na época.


8.2: Isolando ou Detectando uma Sequência Específica por PCR - Biologia

O objetivo principal deste trabalho foi comparar os métodos de isolamento de DNA em moldes do gênero. Mucorales com atenção especial à quantidade e pureza do DNA adquirido. O DNA adquirido foi então amplificado por PCR em tempo real específico.

Projeto

Cinco procedimentos de extração de DNA foram realizados em uma cabine de Biossegurança Classe 2 em uma sala dedicada com precauções de biossegurança adequadas e métodos apropriados de descarte de resíduos biológicos. Um total de 6 Mucorales cepas clínicas foram utilizadas.

Resultados

Do ponto de vista de concentração e pureza, os métodos A mostraram uma quantidade abundante de DNA fúngico, enquanto os métodos E relatam um DNA fúngico puro com R260 / 280 de 1,7 próximo ao 1,8 ótimo. A quantidade de DNA atinge diferença estatística no teste ANOVA com valor de p 0,0005

Conclusão

De maneira geral, o método E foi o método mais eficiente na extração de DNA de culturas de fungos em comparação aos outros métodos considerando tempo, custo, conhecimento técnico e instrumentação. O uso deste ensaio permitirá aos pesquisadores obter DNA de fungos rapidamente para uso em ensaios moleculares.


Análise Molecular de DNA

Nesta subseção, descreveremos alguns dos métodos básicos usados ​​para separar e visualizar fragmentos específicos de DNA que são de interesse para um cientista. Alguns desses métodos não requerem o conhecimento da sequência completa da molécula de DNA. Antes do advento do sequenciamento rápido de DNA, esses métodos eram os únicos disponíveis para trabalhar com DNA, mas eles ainda formam o arsenal básico de ferramentas usadas por geneticistas moleculares para estudar as respostas do corpo a doenças microbianas e outras.

Sondagem de ácido nucléico

As moléculas de DNA são pequenas e as informações contidas em sua sequência são invisíveis. Como um pesquisador isola um determinado trecho de DNA ou, tendo-o isolado, determina de que organismo ele é, qual é sua sequência ou qual é sua função? Um método para identificar a presença de uma determinada sequência de DNA usa pedaços de DNA construídos artificialmente, chamados de sondas. As sondas podem ser usadas para identificar diferentes espécies de bactérias no ambiente e muitas sondas de DNA estão agora disponíveis para detectar patógenos clinicamente. Por exemplo, sondas de DNA são usadas para detectar os patógenos vaginais Candida albicans, Gardnerella vaginalis, e Trichomonas vaginalis.

Para rastrear uma biblioteca genômica para um determinado gene ou sequência de interesse, os pesquisadores devem saber algo sobre esse gene. Se os pesquisadores tiverem uma parte da sequência de DNA do gene de interesse, eles podem projetar um Sonda de DNA, um fragmento de DNA de fita simples que é complementar a parte do gene de interesse e diferente de outras sequências de DNA na amostra. A sonda de DNA pode ser sintetizada quimicamente por laboratórios comerciais ou pode ser criada por clonagem, isolamento e desnaturação de um fragmento de DNA de um organismo vivo. Em ambos os casos, a sonda de DNA deve ser marcada com uma etiqueta molecular ou farol, como um átomo de fósforo radioativo (como é usado para autoradiografia) ou um corante fluorescente (como é usado em fluorescente no local hibridização, ou FISH), de modo que a sonda e o DNA ao qual ela se liga possam ser vistos (Figura 1). A amostra de DNA que está sendo sondada também deve ser desnaturada para torná-la de fita simples, de modo que a sonda de DNA de fita simples possa se emparelhar com a amostra de DNA de fita simples em locais onde suas sequências são complementares. Embora essas técnicas sejam valiosas para o diagnóstico, seu uso direto no escarro e em outras amostras corporais pode ser problemático devido à natureza complexa dessas amostras. Freqüentemente, o DNA deve primeiro ser isolado de amostras corporais por meio de métodos de extração química antes que uma sonda de DNA possa ser usada para identificar patógenos.

Figura 1. Sondas de DNA podem ser usadas para confirmar a presença de um patógeno suspeito em amostras de pacientes. Este diagrama ilustra como uma sonda de DNA pode ser usada para pesquisar um gene de interesse associado ao patógeno suspeito.

Foco clínico: Karni, parte 2

Este exemplo continua a história de Karni que começou em Micróbios e as Ferramentas de Engenharia Genética.

Os sintomas leves de gripe que Karni está experimentando podem ser causados ​​por vários agentes infecciosos. Além disso, várias doenças autoimunes não infecciosas, como esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (LES) e esclerose lateral amiotrófica (ELA), também apresentam sintomas consistentes com os primeiros sintomas de Karni. No entanto, ao longo de várias semanas, os sintomas de Karni pioraram. Ela começou a sentir dores nas articulações dos joelhos, palpitações cardíacas e uma estranha fraqueza nos músculos faciais. Além disso, ela sofria de rigidez do pescoço e dores de cabeça dolorosas. Relutantemente, ela decidiu que era hora de procurar atendimento médico.

  • Os novos sintomas de Karni fornecem alguma pista sobre que tipo de infecção ou outra condição médica ela pode ter?
  • Quais testes ou ferramentas um profissional de saúde pode usar para identificar o patógeno que causa os sintomas de Karni?

Voltaremos ao exemplo de Karni posteriormente nesta página.

Eletroforese em gel de agarose

Existem várias situações em que um pesquisador pode querer separar fisicamente uma coleção de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes. Um pesquisador também pode digerir uma amostra de DNA com uma enzima de restrição para formar fragmentos. O tamanho resultante e o padrão de distribuição de fragmentos podem frequentemente render informações úteis sobre a sequência de bases de DNA que podem ser usadas, bem como uma varredura de código de barras, para identificar o indivíduo ou espécie à qual o DNA pertence.

A eletroforese em gel é uma técnica comumente usada para separar moléculas biológicas com base no tamanho e nas características bioquímicas, como carga e polaridade. Eletroforese em gel de agarose é amplamente utilizado para separar DNA (ou RNA) de tamanhos variados que podem ser gerados por digestão com enzimas de restrição ou por outros meios, como a PCR (Figura 2).

Devido ao seu esqueleto carregado negativamente, o DNA é fortemente atraído por um eletrodo positivo. Na eletroforese em gel de agarose, o gel é orientado horizontalmente em uma solução tampão. As amostras são carregadas em poços de amostra no lado do gel mais próximo ao eletrodo negativo e, em seguida, retiradas através da peneira molecular da matriz de agarose em direção ao eletrodo positivo. A matriz de agarose impede o movimento de moléculas maiores através do gel, enquanto as moléculas menores passam mais facilmente. Assim, a distância de migração é inversamente correlacionada ao tamanho do fragmento de DNA, com fragmentos menores viajando por uma distância maior através do gel. Tamanhos de fragmentos de DNA dentro de uma amostra podem ser estimados por comparação com fragmentos de tamanho conhecido em um Escada de DNA também executado no mesmo gel. Para separar fragmentos de DNA muito grandes, como cromossomos ou genomas virais, a eletroforese em gel de agarose pode ser modificada alternando periodicamente a orientação do campo elétrico durante eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). No PFGE, fragmentos menores podem se reorientar e migrar ligeiramente mais rápido do que fragmentos maiores e esta técnica pode, assim, servir para separar fragmentos muito grandes que, de outra forma, viajariam juntos durante a eletroforese em gel de agarose padrão. Em qualquer uma dessas técnicas de eletroforese, as localizações dos fragmentos de DNA ou RNA no gel podem ser detectadas por vários métodos. Um método comum é adicionar brometo de etídio, uma mancha que se insere nos ácidos nucleicos em locais não específicos e pode ser visualizada quando exposta à luz ultravioleta. Outras manchas que são mais seguras do que o brometo de etídio, um potencial cancerígeno, estão agora disponíveis.

Figura 2. Clique para ampliar a imagem. (a) O processo de eletroforese em gel de agarose. (b) Um pesquisador carregando amostras em um gel. (c) Esta fotografia mostra uma eletroforese completa executada em um gel de agarose. A escada de DNA está localizada nas pistas 1 e 9. Sete amostras estão localizadas nas pistas 2 a 8. O gel foi corado com brometo de etídio e fotografado sob luz ultravioleta. (crédito a: modificação da obra por Magnus Manske crédito b: modificação da obra pelo Departamento de Agricultura dos EUA crédito c: modificação da obra por James Jacob)

Análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP)

Os locais de reconhecimento da enzima de restrição são curtos (apenas alguns nucleotídeos de comprimento), palíndromos específicos para a sequência e podem ser encontrados em todo o genoma. Assim, as diferenças nas sequências de DNA nos genomas dos indivíduos levarão a diferenças na distribuição dos locais de reconhecimento de enzimas de restrição que podem ser visualizados como padrões de bandas distintos em um gel após a eletroforese em gel de agarose. Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) a análise compara os padrões de bandas de DNA de diferentes amostras de DNA após a digestão de restrição (Figura 3).

Figura 3. A análise RFLP pode ser usada para diferenciar as sequências de DNA. Neste exemplo, um cromossomo normal é digerido em dois fragmentos, enquanto a digestão de um cromossomo mutado produz apenas um fragmento. As pequenas setas vermelhas apontando para os dois segmentos cromossômicos diferentes mostram as localizações dos locais de reconhecimento das enzimas de restrição. Após a digestão e a eletroforese em gel de agarose, os padrões de bandas refletem a mudança, mostrando a perda de duas bandas mais curtas e o ganho de uma banda mais longa. (crédito: modificação do trabalho pelo National Center for Biotechnology Information)

Análise RFLP tem muitas aplicações práticas na medicina e Ciência forense. Por exemplo, os epidemiologistas usam a análise RFLP para rastrear e identificar a fonte de microorganismos específicos implicados em surtos de intoxicação alimentar ou certas doenças infecciosas. A análise de RFLP também pode ser usada no DNA humano para determinar padrões de herança de cromossomos com genes variantes, incluindo aqueles associados a doenças hereditárias ou para estabelecer paternidade.

Cientistas forenses usam a análise RFLP como uma forma de Impressão digital de DNA, que é útil para analisar DNA obtido de cenas de crime, suspeitos e vítimas. As amostras de DNA são coletadas, o número de cópias das moléculas de DNA da amostra é aumentado usando PCRe, em seguida, submetido a digestão com enzimas de restrição e eletroforese em gel de agarose para gerar padrões de bandas específicos. Ao comparar os padrões de bandas de amostras coletadas na cena do crime com aquelas coletadas de suspeitos ou vítimas, os investigadores podem determinar definitivamente se as evidências de DNA coletadas na cena foram deixadas para trás por suspeitos ou vítimas.

Southern Blots e modificações

Várias técnicas moleculares capitalizam na complementaridade e hibridização de sequências entre os ácidos nucleicos de uma amostra e as sondas de DNA. Normalmente, a sondagem de amostras de ácido nucleico dentro de um gel não tem sucesso porque, à medida que a sonda de DNA se embebe em um gel, os ácidos nucleicos da amostra dentro do gel se difundem. Assim, as técnicas de transferência são comumente usadas para transferir ácidos nucléicos para uma membrana fina carregada positivamente feita de nitrocelulose ou náilon. No Southern blot técnica, desenvolvida por Sir Edwin Sulista em 1975, fragmentos de DNA dentro de uma amostra são primeiro separados por eletroforese em gel de agarose e, em seguida, transferidos para uma membrana por meio de ação capilar (Figura 4). Os fragmentos de DNA que se ligam à superfície da membrana são então expostos a uma sonda de DNA de fita única específica marcada com um material radioativo ou fluorescente farol molecular para ajudar na detecção. Southern blots podem ser usados ​​para detectar a presença de certas sequências de DNA em uma determinada amostra de DNA. Uma vez que o DNA alvo dentro da membrana é visualizado, os pesquisadores podem cortar a porção da membrana que contém o fragmento para recuperar o fragmento de DNA de interesse.

Figura 4.Na técnica de Southern blot, os fragmentos de DNA são primeiro separados por eletroforese em gel de agarose, depois transferidos por ação capilar para uma membrana de náilon, que é então embebida com uma sonda de DNA marcada com um farol molecular para fácil visualização.

Variações do Southern blot - o dot blot, slot blot e o spot blot - não envolvem eletroforese, mas concentram o DNA de uma amostra em um pequeno local em uma membrana. Após a hibridização com uma sonda de DNA, a intensidade do sinal detectado é medida, permitindo ao pesquisador estimar a quantidade de DNA alvo presente na amostra.

UMA mancha de colônia é outra variação do Southern blot em que colônias representando diferentes clones em uma biblioteca genômica são transferidas para uma membrana pressionando a membrana na placa de cultura. As células na membrana são lisadas e a membrana pode então ser sondada para determinar quais colônias dentro de uma biblioteca genômica abrigam o gene alvo. Como as colônias na placa ainda estão crescendo, as células de interesse podem ser isoladas da placa.

No mancha do norte, outra variação do Southern blot, o RNA (não o DNA) é imobilizado na membrana e sondado. Northern blots são normalmente usados ​​para detectar a quantidade de mRNA feita através da expressão gênica em uma amostra de tecido ou organismo.

Análise de microarray

Outra técnica que capitaliza a hibridização entre sequências de ácidos nucleicos complementares é chamada análise de microarray. A análise de microarray é útil para a comparação de padrões de expressão gênica entre diferentes tipos de células - por exemplo, células infectadas com um vírus versus células não infectadas ou células cancerosas versus células saudáveis ​​(Figura 5).

Normalmente, o DNA ou cDNA de uma amostra experimental é depositado em uma lâmina de vidro ao lado de sequências de DNA conhecidas. Cada lâmina pode conter mais de 30.000 tipos diferentes de fragmentos de DNA. Fragmentos de DNA distintos (abrangendo toda a biblioteca genômica de um organismo) ou cDNA fragmentos (correspondendo ao complemento total de genes expressos de um organismo) podem ser individualmente manchados em uma lâmina de vidro.

Uma vez depositado na lâmina, o DNA genômico ou mRNA pode ser isolado das duas amostras para comparação. Se o mRNA for isolado, ele é transcrito reversamente para cDNA usando a transcriptase reversa. Em seguida, as duas amostras de DNA genômico ou cDNA são marcadas com diferentes corantes fluorescentes (normalmente vermelho e verde). As amostras de DNA genômico marcadas são então combinadas em quantidades iguais, adicionadas ao chip do microarray e permitem a hibridização em pontos complementares no microarray.

A hibridização das moléculas de DNA genômico da amostra pode ser monitorada medindo a intensidade da fluorescência em pontos específicos no microarray. Diferenças na quantidade de hibridização entre as amostras podem ser facilmente observados. Se apenas os ácidos nucleicos de uma amostra hibridizarem com um ponto específico no microarray, então esse ponto aparecerá verde ou vermelho. No entanto, se os ácidos nucleicos de ambas as amostras hibridizarem, a mancha aparecerá amarela devido à combinação dos corantes vermelho e verde.

Embora a tecnologia de microarray permita uma comparação holística entre duas amostras em um curto espaço de tempo, ela requer equipamento de detecção sofisticado (e caro) e software de análise. Por causa dos custos, essa tecnologia é normalmente limitada a ambientes de pesquisa. Os pesquisadores usaram a análise de microarray para estudar como a expressão gênica é afetada em organismos infectados por bactérias ou vírus ou submetidos a certos tratamentos químicos.

Figura 5. (a) As etapas da análise de microarranjos são ilustradas. Aqui, os padrões de expressão gênica são comparados entre células cancerosas e células saudáveis. (b) As informações do microarray podem ser expressas como um mapa de calor. Os genes são mostrados no lado esquerdo, diferentes amostras são mostradas na parte inferior. Genes expressos apenas em células cancerosas são mostrados em tons variados de genes vermelhos expressos apenas em células normais são mostrados em tons variados de verde. Os genes que são expressos em células cancerosas e normais são mostrados em amarelo.

Pense nisso

  • Em que consiste uma sonda de DNA?
  • Por que um Southern blot é usado após a eletroforese em gel de uma digestão de DNA?

8.2: Isolando ou Detectando uma Sequência Específica por PCR - Biologia

Sem dúvida, a reação em cadeia da polimerase (PCR) representa a técnica mais importante no campo da biologia molecular hoje. O que a PCR realiza em termos técnicos pode ser descrito de forma muito simples & # 151; ela permite a amplificação rápida e ilimitada de sequências de ácido nucleico específicas que podem estar presentes em concentrações muito baixas em misturas muito complexas. Em menos de uma década após seu desenvolvimento inicial, tornou-se uma ferramenta crítica para todos os biólogos moleculares em atividade e serviu para trazer a biologia molecular para a prática de muitos outros campos das ciências biomédicas e além. As razões são várias. Primeiro, a PCR fornece o máximo em sensibilidade & # 151 moléculas de DNA individuais podem ser detectadas e analisadas quanto ao conteúdo da sequência (Li et al., 1988 Arnheim et al., 1990). Em segundo lugar, ele fornece o máximo em resolução & # 151 todos os polimorfismos, de alterações de base única a grandes rearranjos, podem ser distinguidos por um ensaio baseado em PCR apropriado. Terceiro, é extremamente rápido & # 151 para muitas aplicações, é possível ir de amostras de tecido bruto a resultados dentro dos limites de um único dia de trabalho. Finalmente, a técnica é um agente da democracia & # 151, uma vez que as sequências do par de oligonucleotídeos que definem uma reação de PCR particular são publicadas, qualquer pessoa em qualquer lugar com os fundos para comprar os oligonucleotídeos pode reproduzir a mesma reação em amostras de sua escolha isso contrasta com as análises de RFLP nas quais os investigadores muitas vezes dependem da generosidade de outros para fornecer clones a serem usados ​​como sondas. Numerosos livros e milhares de artigos de periódicos foram publicados sobre os princípios e aplicações da técnica [Erlich (1989) e Innis et al. (1990) são dois exemplos iniciais].

Embora as aplicações da PCR sejam tão variadas quanto os laboratórios nos quais a técnica é praticada, esta seção se concentrará inteiramente em seis aplicações gerais que são relevantes para a detecção e tipagem da variação genética no camundongo. Quatro dessas aplicações são baseadas na amplificação por PCR de loci específicos que foram previamente caracterizados no nível da sequência. Nesses casos, os pares de primers devem ser escolhidos para serem o mais específicos possível para o locus em questão, a fim de evitar produtos de PCR artefatos. Programas de computador estão disponíveis para auxiliar no projeto de primer (Lowe et al., 1990 Dietrich et al., 1992), mas a inspeção manual geralmente é adequada. Deve-se ter cuidado para evitar a auto-complementaridade em qualquer um dos primers e a presença de sequências complementares entre os dois primers. Além disso, os iniciadores potenciais devem ser rastreados com o uso de um programa de comparação de sequência para evitar homologia com os elementos B1, B2 e L1 altamente repetidos (consulte a Seção 5.4). O comprimento do primer deve ser de pelo menos 20 bases, o conteúdo de G: C deve ser de pelo menos 50% e a temperatura de fusão deve ser de pelo menos 60 & # 176C.

Mesmo quando todas essas condições são cumpridas, ainda é possível descobrir que um par particular de iniciadores não funcionará adequadamente para amplificar um locus específico em um produto reproduzível que pode ser claramente distinguido de bandas de fundo artefatos. Há uma variedade de abordagens que podem ser adotadas para eliminar tais problemas (Erlich, 1989 Innis et al., 1990), mas se tudo mais falhar, deve-se substituir um ou ambos os primers por alternativas derivadas de outras sequências de flanqueamento próximas que também se encaixam as regras listadas acima.

8.3.1 Polimorfismos de local de restrição

8.3.1.1 Visão geral

Ensaios baseados em PCR rápidos e altamente eficientes podem ser projetados para detectar todos os RFLPs & # 151 previamente definidos pela análise de Southern blot & # 151, desde que a natureza do RFLP seja compreendida e as informações de sequência que flanqueiam o local polimórfico real estejam disponíveis. Um par de primers de PCR que flanqueiam este local pode então ser sintetizado de acordo com as regras recém-descritas e testado quanto à sua capacidade de amplificar um produto específico que pode ser facilmente identificado como uma banda corada com brometo de etídio por eletroforese em gel.

Com o tipo mais simples e comum de RFLP ilustrado na Figura 8.6, o polimorfismo resulta de uma única diferença de nucleotídeo que fornece um local de reconhecimento para uma enzima de restrição em uma forma alélica e não na outra. Um polimorfismo deste tipo pode ser rapidamente detectado (1) amplificando a região em torno do sítio polimórfico de cada amostra (2) submetendo o material amplificado à enzima de restrição apropriada por um breve período de digestão e (3) distinguindo o produto de PCR não digerido dos fragmentos menores digeridos por eletroforese em gel. Ao escolher primers que são relativamente equidistantes e suficientemente longe do sítio polimórfico, pode-se facilmente resolver as formas alélicas em géis de agarose ou poliacrilamida, conforme ilustrado na Figura 8.6.

Este protocolo baseado em PCR fornece resultados muito mais rapidamente e é muito mais fácil de realizar do que a alternativa de Southern blot que requer blotting, marcação de sonda, hibridização e autorradiografia. Uma vez que a maior despesa envolvida com a PCR está no sequenciamento inicial do locus e na síntese dos primers de PCR, também é menos dispendiosa em todos os casos em que se espera digitar um grande número de amostras para o locus específico em questão.

Mesmo RFLPs causados ​​por eventos mutacionais mais complexos podem ser analisados ​​por PCR. A Figura 8.7 ilustra a lógica por trás do desenvolvimento de estratégias de PCR para detectar deleções, inserções, inversões e translocações. O único requisito é o conhecimento das sequências que circundam os pontos de interrupção associados a cada evento genético específico.

8.3.1.2 & # 032 & # 0323'-regiões não traduzidas como um recurso de mapeamento

Um recurso importante para a identificação de novos polimorfismos de sítios de restrição que podem ser tipificados por PCR são as regiões 3'-não traduzidas (3'-UT) dos transcritos. Essas regiões não estão sob as mesmas restrições seletivas que as sequências de codificação e são frequentemente tão polimórficas quanto as regiões genômicas aleatórias não transcritas. No entanto, as regiões 3'-UT são marcadores diretos para as extremidades 3 'dos ​​genes. Eles geralmente não são interrompidos por íntrons e são frequentemente divergentes o suficiente entre os diferentes membros de uma família de genes para permitir a análise específica do locus.

Quase todas as bibliotecas de cDNA são construídas a partir de moléculas de cDNA que foram iniciadas pela cauda poli (A) presente na extremidade 3 'do mRNA. Para todos os clones obtidos a partir dessas bibliotecas, é simples obter informações de sequência para algumas centenas de pares de base da região 3'-UT diretamente adjacente à cauda poli (A). Esta informação de sequência pode ser usada para projetar um par de iniciadores de PCR que podem ser usados, por sua vez, para amplificar e sequenciar a mesma região de uma cepa ou espécie diferente de camundongos, como M. spretus ou Milímetros. Castaneus. Em uma comparação de 2.312 pb presentes nas regiões 3'-UT derivadas de 22 clones de cDNA de camundongo aleatórios, Takahashi e Ko (1993) encontraram uma taxa de polimorfismo geral de uma alteração em cada 92 pb. Estas mudanças de base única traduziram-se em polimorfismos de sítio de restrição em nove dos 22 clones analisados. Com os primers já em mãos, esses polimorfismos recém-identificados fornecem marcadores de PCR para o mapeamento direto dos genes correspondentes que são indistinguíveis em suas regiões codificantes.

8.3.2 Detecção de mudanças alélicas definidas por pares de base únicos

8.3.2.1 Hibridização e mudanças de pares de base únicos

Embora a detecção de RFLPs por PCR seja uma melhoria em relação à detecção de Southern blot, a vantagem real da PCR reside em sua capacidade quase universal de discriminar alelos que diferem por alterações de base única, mesmo quando eles não criam ou destroem qualquer sítio de restrição conhecido. Na verdade, a maioria das mudanças de pares de base aleatórias será do tipo não RFLP e, antes do advento da PCR, não havia meios eficientes pelos quais esses alelos pudessem ser facilmente seguidos em um grande número de amostras. Foi essa limitação que originou o desenvolvimento do protocolo de PCR (Saiki et al., 1986).

A incapacidade de detectar alterações de base única em Southern blots foi uma consequência de ambas as limitações teóricas inerentes ao processo de hibridização, bem como limitações práticas na sensibilidade das sondas de ácido nucleico e a eliminação do ruído de fundo. Com a análise de Southern blot, a sensibilidade na qual as sequências alvo podem ser detectadas em uma amostra definida é diretamente proporcional ao comprimento da sonda. Por exemplo, uma sonda de 1 kb hibridizará dez vezes a quantidade da sequência alvo que uma sonda de 100 bp (tendo a mesma atividade específica), e isso levará a um sinal que é dez vezes mais forte. É por esta razão que é sempre melhor usar as sondas mais longas possíveis para estudos tradicionais de Southern blot, bem como para outros protocolos, como no local hibridização. A intensidade do sinal é importante não apenas para reduzir a quantidade de tempo necessária para a exposição autorradiográfica, mas também para permitir a detecção sobre o ruído de fundo & # 034noise & # 034 inerente a qualquer experimento de hibridização. Se as condições forem menos do que ideais, a relação sinal-ruído cairá abaixo de 1,0 conforme o tamanho da sonda é reduzido abaixo de 100-200 bp.

As únicas forças que mantêm as duas fitas de uma dupla hélice de DNA juntas são as ligações duplas ou triplas de hidrogênio que existem dentro de cada par de base. As ligações de hidrogênio individuais são muito fracas, e somente quando são adicionadas em grandes números que a dupla hélice tem estabilidade suficiente para evitar ser dividida por flutuações térmicas normais. Assim, para moléculas de DNA com um tamanho na faixa de alguns pares de base até um valor crítico de & # 12650 bp, o próprio comprimento desempenha um papel crítico na determinação de se a hélice permanecerá intacta ou se desfará. No entanto, uma vez que este limite superior é cruzado, o comprimento não é mais um fator de estabilidade térmica. Com efeito, existe apenas uma pequena janela & # 151 & # 12610 a 40 bp & # 151 sobre a qual é possível obter a hibridização diferencial da sonda para o alvo com base nas diferenças no comprimento do híbrido.

Mas como o comprimento pode fazer diferença na detecção de alelos quando os comprimentos do alvo e da sonda são mantidos constantes? A resposta é que o eficaz comprimento de um híbrido é determinado pelo mais longo trecho de DNA que não contém incompatibilidades. Assim, quando uma sonda de 21 bases de comprimento hibridiza com um alvo que difere em uma única base diretamente no meio da sequência, o comprimento efetivo dos híbridos que são formados é de apenas 10 bp. Uma vez que um híbrido de 10 bp é significativamente menos estável do que um híbrido de 21 bp, torna-se fácil conceber as condições de hibridização (essencialmente escolhendo a temperatura certa) de modo que o híbrido perfeito permaneça intacto enquanto o híbrido imperfeito não. Em contraste, a estabilidade térmica de um híbrido de 50 bp não é suficientemente diferente da estabilidade térmica de um híbrido de 100 bp (de composição de sequência equivalente) para permitir a detecção por hibridização diferencial.

Assim, em 1985, a detecção de diferenças de base única por meio de hibridização diferencial Southern blot não foi possível devido a dois problemas de neutralização. Em primeiro lugar, foi apenas com sondas muito curtas & # 151 oligonucleotídeos de menos de 50 bases & # 151 que as alterações de base única forneceram uma diferença grande o suficiente para ser prontamente detectada. No entanto, foi apenas com sondas muito mais longas & # 151 de várias centenas de bases ou mais & # 151 que a intensidade do sinal e a relação sinal-ruído foram suficientes para permitir a detecção específica da sequência alvo em qualquer forma alélica dentro do genoma de camundongo de alta complexidade. Como quebrar esse impasse?

A resposta, é claro, era focar nas sequências alvo em vez da sonda ou nas condições de hibridização. O PCR forneceu um meio de aumentar a quantidade absoluta da sequência alvo, bem como a razão alvo para não alvo, em ordens de magnitude virtualmente ilimitadas. Isto, por sua vez, resulta em um aumento proporcional na força potencial do sinal que, por sua vez, permite o uso de oligonucleotídeos curtos para hibridização e que, por sua vez, permite a detecção de diferenças de base única em um ensaio simples de mais / menos.

8.3.2.2 Oligonucleotídeos específicos de alelo

Uma vez que os alelos alternativos foram sequenciados e uma única mudança de par de bases entre os dois foi identificada, torna-se possível projetar um protocolo de PCR que permite seguir sua segregação (Farr, 1991). Primeiro, os primers de PCR são identificados que permitem a amplificação específica de uma região que abrange o sítio de nucleotídeo variante (para esta aplicação, o comprimento do produto não é crítico e pode ter de 150 a 400 bp de comprimento). Em seguida, dois oligonucleotídeos específicos de alelo (ASOs) são produzidos nos quais o nucleotídeo variante está o mais próximo possível do centro, considerando outros fatores descritos no início da Seção 8.3. O comprimento ASO ideal é 19-21 bases & # 151 curto o suficiente para permitir a hibridização diferencial com base em uma única mudança de base e longo o suficiente para fornecer uma alta probabilidade de especificidade de locus. Os dois ASOs são usados ​​com amostras definidas para determinar uma temperatura na qual a hibridização positiva é obtida com o DNA alvo contendo o alelo correto, mas não com o DNA alvo contendo apenas o alelo alternativo.

Normalmente, uma amostra de DNA genômico é submetida a amplificação por PCR com os iniciadores específicos do locus, alíquotas do material amplificado são manchadas em dois & # 034dots, & # 034 e cada um é sondado com formas marcadas de cada um dos dois ASOs. A hibridização em um ponto, mas não no outro, é indicativa de um homozigoto para esse alelo, enquanto a hibridização em ambos os pontos é indicativa de um heterozigoto que carrega ambos os alelos.

O poder deste protocolo para detecção de alelos é sua simplicidade. A eliminação da execução do gel economiza tempo e permite uma fácil automação. Com grandes quantidades de sequência alvo, torna-se possível usar protocolos de marcação não radioativos que são mais seguros e permitem o armazenamento de longo prazo de sondas marcadas (Helmuth, 1990 Levenson e Chang, 1990). No entanto, existem armadilhas que é importante ter em mente. Em primeiro lugar, algumas variantes podem ser refratárias à análise de PCR reproduzível devido a problemas inerentes à sequência que circunda o local da mudança de base. Em segundo lugar, os ensaios mais / menos de qualquer tipo estão sujeitos ao problema de falsos negativos. (É sempre possível inserir uma etapa de execução de gel antes da hibridização para ter certeza de que o material amplificado está realmente presente na alíquota em análise.) Finalmente, na análise de camundongos derivados de qualquer coisa diferente de um cruzamento definido, há sempre o risco de que existirá um terceiro alelo novo que não pode ser detectado por nenhum dos dois ASOs desenvolvidos para a análise. Um animal heterozigoto para esse novo alelo (junto com um dos dois alelos conhecidos) poderia ser falsamente caracterizado como homozigoto para o alelo conhecido presente, uma vez que o protocolo não é quantitativo. No entanto, mesmo com essas armadilhas, o protocolo PCR / ASO continua sendo uma ferramenta útil para a análise genética.

8.3.2.3 O ensaio de ligação de oligonucleotídeo

Um protocolo alternativo para a detecção de alelos bem definidos que diferem por alterações de base única foi desenvolvido por Hood e seus colegas (Landegren et al., 1988 Landegren et al., 1990). Este método, chamado de ensaio de ligação de oligonucleotídeo (OLA) ou detecção de gene mediada por ligase, é baseado na necessidade de pareamento de bases adequado na extremidade 3 'de um oligonucleotídeo, bem como na extremidade 5' de um oligonucleotídeo adjacente antes da ligase pode funcionar para formar uma ligação fosfodiéster covalente. A estrutura conceitual por trás do protocolo é ilustrada na Figura 8.8. Primeiro, a sequência alvo potencial é amplificada por PCR. Em seguida, a hibridização é realizada simultaneamente com dois oligonucleotídeos complementares a sequências que são adjacentes uma à outra e flanqueiam diretamente o nucleotídeo variante. A própria base variante será complementar ou não complementar à base mais 3 'do primeiro oligonucleotídeo específico de alelo. Este ASO é modificado antecipadamente com uma porção de biotina ligada, mas não é rotulado de outra forma. O segundo oligonucleotídeo, que é marcado radioativamente ou não isotopicamente, se estende por uma sequência adjacente que é comum a ambos os alelos em análise. A ligase também está presente na reação e, se ambos os oligonucleotídeos corresponderem perfeitamente à sequência alvo, a ligase criará uma ligação covalente entre eles. Se ocorrer uma incompatibilidade no local de junção, os dois oligonucleotídeos irão não ficar ligado. O material biotinilado pode ser facilmente e absolutamente separado do material não biotinilado com o uso de uma matriz de estreptavidina e a amostra resultante pode então ser testada quanto à presença do marcador associado ao segundo oligonucleotídeo.

Existem duas vantagens principais em usar o protocolo de detecção mediada por ligase como um substituto para o protocolo de PCR / hibridização descrito na seção anterior. Primeiro, a chance de um falso positivo decorrente do protocolo OLA é essencialmente zero. Em segundo lugar, o protocolo OLA é altamente receptivo à automação. No entanto, como em todos os ensaios mais / menos, os controles adequados são essenciais para descartar a possibilidade de falsos negativos.

8.3.2.4 A reação em cadeia da ligase

Combinando OLA junto com a estratégia de amplificação exponencial de PCR, uma nova técnica foi desenvolvida que é conhecida como reação em cadeia da ligase ou LCR (Barany, 1991 Weiss, 1991). Como OLA, a detecção de diferenças de nucleotídeos com o protocolo LCR é baseada na necessidade de emparelhamento perfeito nos dois locais que flanqueiam a quebra entre dois oligonucleotídeos para que a ligase forme uma ligação fosfodiéster entre eles, conforme ilustrado na Figura 8.8. A diferença é que no protocolo LCR, quatro oligonucleotídeos são usados ​​correspondendo às regiões que flanqueiam o sítio polimórfico em Ambas filamentos da molécula de DNA alvo. É aí que reside o mecanismo de amplificação. Se a sequência alvo fornecer uma correspondência, ambos os conjuntos de oligonucleotídeos flanqueadores ficarão ligados. Após a desnaturação, cada um dos oligonucleotídeos de comprimento duplo recém-criados pode agora atuar como um modelo para um novo conjunto de oligonucleotídeos para pares de base e ligar. Assim, o LCR prossegue por rodadas de recozimento na presença de uma ligase estável ao calor, seguido por desnaturação e, em seguida, recozimento novamente. A única diferença no padrão do termociclador daquele usado para PCR é a eliminação da etapa de alongamento. No final do processo, os produtos de LCR podem ser detectados facilmente da mesma maneira usada para OLA como mostrado na Figura 8.8. Em contraste, a detecção de locais polimórficos com PCR requer um protocolo de acompanhamento & # 151 ou hibridização para um oligonucleotídeo específico de alelo ou digestão de restrição seguida por eletroforese em gel.

A diferença essencial entre o LCR e o protocolo OLA original é a sensibilidade: o LCR requer muito menos material inicial, pois o produto é amplificado durante o protocolo. As vantagens do protocolo LCR em relação ao PCR são várias. Primeiro, como o OLA, o LCR não produzirá falsos positivos. Em segundo lugar, como o produto de LCR pode ser analisado diretamente sem outros esquemas de detecção, o processo é muito mais passível de automação e é muito mais provável que seja quantitativo. A desvantagem do LCR é que ele só pode ser usado para detectar substituições de base única que foram previamente caracterizadas por análise de sequência.

8.3.3 Polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP)

8.3.3.1 Antecedentes históricos

Existem muitas circunstâncias em que é mais útil ser capaz de seguir genes & # 151 em contraste com sequências anônimas & # 151 diretamente em cruzamentos experimentais. Várias abordagens diferentes já foram descritas, mas todas têm limitações. RFLPs associados a genes são detectados entre diferentes espécies & # 151 M. spretus e consanguíneo tradicional M. musculus cepas, por exemplo & # 151 em uma frequência razoável, mas são muito mais difíceis de encontrar entre os consanguíneos M. musculus cepas próprios. Para usar qualquer uma das abordagens dependentes de oligonucleotídeos específicos de alelo, é primeiro necessário sequenciar o locus em questão de diferentes cepas de camundongos, identificar variantes de pares de base, sintetizar os ASOs, bem como outros iniciadores específicos de locus, testar seus especificidade e otimizar as condições de reação para cada locus. E neste ponto, ainda se tem apenas um protocolo para distinguir dois estados alélicos.

O protocolo perfeito de um geneticista para detecção e análise de polimorfismos em qualquer locus satisfaria os seguintes critérios. Primeiro, permitiria a detecção de qualquer e todas as variantes do par de base em uma região de DNA como alelos múltiplos. Em segundo lugar, não exigiria informações de sequência prévia de cada alelo. Terceiro, não exigiria a síntese de ASOs. Quarto, o protocolo do ensaio em si não exigiria nenhum equipamento especial ou habilidades especiais além daquelas encontradas em um laboratório de biologia molecular padrão. Finalmente, o ensaio seria rápido e os resultados prontamente reproduzíveis.

Todos esses critérios foram satisfeitos, em um bom grau, com um protocolo simples que aproveita o fato de que até mesmo alterações de nucleotídeo único podem alterar a conformação de equilíbrio tridimensional que fios simples assumirá em baixas temperaturas (Orita et al., 1989a). Se uma amostra de DNA é desnaturada em alta temperatura e então rapidamente colocada no gelo, a reforma de híbridos de DNA será inibida. Em vez disso, cada filamento colapsará sobre si mesmo no que costuma ser chamado de bobina aleatória. Na verdade, agora está claro que cada fita simples assumirá uma conformação mais favorecida com base no estado de energia livre mais baixo. Presumivelmente, o estado mais favorecido é aquele em que um grande número de bases pode formar ligações de hidrogênio entre si. Mesmo uma única mudança de nucleotídeo poderia concebivelmente perturbar o estado anterior mais favorecido e promover um diferente, que, se diferente o suficiente, funcionaria com uma mobilidade alterada em um gel. Os diferentes estados alélicos de um locus que são detectados com este protocolo são chamados polimorfismos de conformação de fita simples (SSCPs) (Beier et al., 1992 Beier, 1993).

8.3.3.2 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

O desenvolvimento do protocolo SSCP foi conseqüência de uma técnica anterior que permitia a detecção de alterações de base única no DNA genômico por eletroforese por meio de um gradiente crescente de desnaturante (Fischer e Lerman, 1983). Essa técnica é chamada de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). Pequenas mudanças na sequência têm efeitos dramáticos no ponto do gradiente de desnaturação em que fragmentos de restrição genômica de fita dupla particulares se dividem em fitas simples. Com a fixação de um & # 034GC-clamp & # 034 & # 151 composto por um trecho de pares de base fortemente ligados G: C & # 151, o fragmento de DNA pode ser mantido junto com uma dupla hélice na região presa anexada às fitas simples abertas presentes na região fundida. Esta molécula de duas fases seria muito resistente a novas migrações no gel e seria essencialmente pare em seu caminho. Duas formas alélicas de um fragmento genômico que diferem por até mesmo um único par de base passariam por essa transição em diferentes pontos desnaturantes e isso seria observado como diferentes distâncias de migração no gel de gradiente desnaturante. No protocolo original, diferentes formas alélicas foram detectadas diretamente no DNA genômico total após Southern blotting e hibridização para uma sonda específica de locus. Na época em que o DGGE foi desenvolvido, não havia nenhum outro meio disponível para detectar mudanças de pares de base que não alterassem os locais de restrição e, assim, o DGGE expandiu o horizonte de polimorfismo. Infelizmente, DGGE requer o uso de equipamentos feitos sob medida e é tedioso para executar em uma base rotineira.

Nos últimos anos, o protocolo DGGE foi modificado para uso em conjunto com PCR como um meio para a detecção inicial de variantes alélicas entre amostras recuperadas de diferentes indivíduos em uma população (Sheffield et al., 1989). A migração diferencial de produtos de PCR pode ser detectada diretamente em géis com coloração com brometo de etídio e alelos variantes podem ser excisados ​​do gel para análise de sequência. A principal vantagem do uso de DGGE é que quase todas as substituições de base única podem ser detectadas (Myers et al., 1985). Portanto, é ideal para a situação em que se deseja pesquisar alelos variantes raros entre os indivíduos de uma população sem a necessidade de sequenciamento de todos os alelos de tipo selvagem que estarão presentes na maioria das amostras. No entanto, DGGE não aumenta facilmente e, portanto, não é o método de escolha quando outro protocolo menos trabalhoso também pode ser usado para a detecção de variantes alélicas. Em muitos casos, o melhor protocolo será o SSCP.

8.3.3.2 O protocolo SSCP e sua sensibilidade

Uma das principais virtudes do novo protocolo de detecção de SSCP desenvolvido por Orita et al. (1989a 1989b) é sua simplicidade. Em sua forma básica, os produtos de PCR são simplesmente desnaturados a 94 & # 176, resfriados à temperatura do gelo para evitar a formação de híbridos e, em seguida, submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida não desnaturante padrão.

As duas fitas do produto de PCR geralmente funcionarão com mobilidades muito diferentes e as mudanças de base podem agir para alterar ainda mais a mobilidade de cada fita. Assim, o que parece ser um único produto de PCR por análise padrão, pode se dividir em quatro bandas diferentes em um gel de SSCP se a amostra de DNA original for heterozigótica para alterações de base que alteram a mobilidade de ambas as fitas.

Vários estudos analisaram pares de produtos de PCR conhecidos por diferirem por substituições de base única para obter uma estimativa da fração que pode ser distinguida pelo protocolo SSCP. Em um desses estudos, 80% dos 228 produtos de PCR variantes foram distinguíveis (Sheffield et al., 1993). Em outro estudo, a taxa de detecção foi de 80-90% (Michaud et al., 1992). No entanto, quando este último conjunto de amostras foi analisado sob três condições eletroforéticas diferentes, a taxa de detecção foi de surpreendentes 100%.

8.3.3.3 Uma ferramenta poderosa para a detecção de polimorfismos entre cepas consanguíneas clássicas

Quando a análise de SSCP foi realizada em um conjunto de produtos de PCR amplificados das regiões 3'-não traduzidas ou intrônicas de 30 genes de camundongos aleatórios, 43% mostraram polimorfismo em uma comparação das cepas consanguíneas clássicas B6 e DBA, e 86% mostraram polimorfismo entre B6 e M. spretus (Beier et al., 1992). A taxa na qual os polimorfismos SSCP são detectados entre B6 e DBA é muito maior do que aquela observada com a análise RFLP, e na mesma estimativa que as frequências de polimorfismo observadas para microssatélites descritos na Seção 8.3.6.

Há uma série de vantagens na abordagem de SSCP sobre outros sistemas para detectar polimorfismos: (1) SSCP tem aplicabilidade potencial a todas as sequências únicas, tanto dentro de genes quanto em regiões não gênicas (2) os primers de PCR podem ser projetados diretamente a partir de sequências de cDNA e (3) Se uma região amplificada não mostra polimorfismo, uma sempre pode mover-se a montante ou a jusante para outra. No entanto, ainda é provável que os microssatélites & # 151 descritos na Seção 8.3.6 & # 151 terão um número maior de alelos diferentes e isso os torna mais úteis em abordagens diretas de impressão digital. Juntos, SSCP e análise de microssatélites fornecem um poderoso par de ferramentas baseadas em PCR para análise de ligação clássica com painéis recombinantes derivados de cruzamentos intra e interespecíficos.

8.3.4 Amplificação aleatória de DNA polimórfico

Com todos os protocolos de PCR descritos até agora, há um requisito absoluto de informações de sequência pré-existentes para projetar os iniciadores dos quais depende a amplificação específica. Em 1990, dois grupos demonstraram que oligonucleotídeos aleatórios curtos únicos de sequência arbitrária poderiam ser usados ​​para iniciar a amplificação de sequências genômicas de forma reproduzível e polimórfica (Welsh e McClelland, 1990 Welsh et al., 1991 Williams et al., 1990). Este protocolo é denominado amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD). O princípio por trás do protocolo é o seguinte. Oligonucleotídeos curtos de sequência aleatória serão, apenas por acaso, complementares a numerosas sequências dentro do genoma. Se duas sequências complementares estiverem presentes em fitas opostas de uma região genômica na orientação correta e a uma distância suficientemente próxima uma da outra, o DNA entre elas pode ser amplificado por PCR. Cada fragmento amplificado será independente de todos os outros e, por acaso, provavelmente também terá comprimentos diferentes se poucas bandas suficientes forem amplificadas, todas serão resolvidas umas das outras por eletroforese em gel. Diferentes oligonucleotídeos amplificarão conjuntos completamente diferentes de loci.

Polimorfismos de RAPD resultam do fato de que um sítio de hibridização de primer em um genoma que é alterado em um solteiro nucleotídeo em um segundo genoma pode levar à eliminação de um produto de amplificação específico desse segundo genoma, conforme ilustrado na Figura 8.9. Se, por exemplo, o primer aleatório sendo usado tem um comprimento de 10 bases, então cada produto de PCR será definido por 20 bases (10 no alvo do primer em cada extremidade) que são todos suscetíveis a alterações polimórficas. 60 O polimorfismo resultante será detectado como um sistema di-alélico & # 043 / -.

Se alguém começa com a suposição de que a complementaridade completa entre o primer e o alvo é necessária para uma amplificação eficiente, torna-se possível derivar uma equação geral para prever o número aproximado, UMA, de bandas amplificadas esperadas como produtos de PCR de um genoma de complexidade C que é preparado com um único oligômero de comprimento N. 61 Para fragmentos amplificados de 2 kb ou menores em tamanho 62, a equação é:

Vamos usar 2x10 9 como uma estimativa para a complexidade da porção de cópia única do genoma do mouse (consulte a Seção 5.1.2) e resolver a Equação 8.1 para comprimentos de primer que variam de oito a 11. Com N & # 061 8, o número previsto de produtos de PCR é 18.626 & # 151 demais para ser resolvido por qualquer tipo de análise de gel. Com N & # 061 9, a equação prevê 116 produtos de PCR, que ainda é um número muito alto. Com N & # 061 10, a previsão é de 7,2 produtos, e com um 11-mer, a previsão é de 0,45 produtos. Assim, o uso de 10-meros aleatórios seria mais apropriado para obter um número máximo de bandas facilmente resolvíveis do genoma do camundongo.

Otimizações do protocolo RAPD completo, dos parâmetros sobre os quais as sequências de iniciador são escolhidas até as condições usadas para PCR, foram publicadas (Williams et al., 1990 Nadeau et al., 1992). Na verdade, é possível obter vários produtos de PCR com primers maiores que 10-meros quando as condições de reação relaxadas são usadas para permitir a amplificação de sequências alvo incompatíveis. Na verdade, um grupo sugeriu que os primers de 12-14 meros são ótimos (Nadeau et al., 1992). Também é possível aumentar o número previsto de produtos por um fator simples de três, incluindo dois primers aleatórios não relacionados do mesmo comprimento em cada reação de PCR. No entanto, em qualquer caso em que o número de produtos de PCR visíveis vá acima de 12-20, seria necessário usar géis de poliacrilamida, em vez de géis de agarose, a fim de resolver claramente cada banda, portanto, a troca para a detecção de mais loci é uma análise mais demorada. No final das contas, o protocolo que requer menos tempo para digitação por locus é aquele que deve ser escolhido. Uma vez que diferentes laboratórios freqüentemente se destacam em diferentes técnicas, as condições ideais para a análise de RAPD devem ser determinadas independentemente em cada laboratório.

Uma análise RAPD abrangente das duas cepas consanguíneas mais bem caracterizadas & # 151 B6 e DBA & # 151 foi realizada com 481 10-meros independentes usados ​​isoladamente em reações de PCR (Woodward et al., 1992). Foi observada uma média de 5,8 produtos de PCR por reação, o que não é muito diferente do previsto pela Equação 8.1. Em uma comparação direta de cepas, 95 diferenças reproduzíveis foram observadas entre B6 e DBA entre o conjunto completo de 2.900 bandas discretas detectadas. Assumindo que cada polimorfismo resulta de uma única alteração de nucleotídeo em um dos dois alvos de primer e todas essas alterações são detectáveis, torna-se possível calcular a diferença de sequência média entre essas duas cepas em 1,6 alterações por 1.000 nucleotídeos. Este baixo nível de polimorfismo não é inesperado, dado o alto grau de parentesco conhecido entre todas as linhagens puras clássicas (ver Seção 2.3.4).

Usando RAPD como um método para detectar polimorfismos entre B6 e DBA pareceria ser bastante ineficiente & # 151 em média, apenas um polimorfismo foi detectado entre cada cinco reações de primer que foram executadas. Um segundo fator negativo é que todos os polimorfismos RAPD são sistemas binários & # 043 / -. Assim, como discutido acima para RFLPs, um polimorfismo detectado entre um par de cepas pode não se traduzir em uso para outro par de cepas. Além disso, não é possível distinguir animais que são heterozigotos em qualquer locus daqueles que são homozigotos para o alelo & # 034 & # 043 & # 034. Assim, em média, apenas metade dos polimorfismos RAPD detectados entre duas cepas seriam mapeáveis ​​entre a prole de um retrocruzamento para um dos pais, e com um sistema de mapeamento intercruzamento, a abordagem RAPD é ainda mais limitada (ver Seção 9.4.3).

No entanto, existem muitos recursos que falam sobre a utilidade da abordagem RAPD. O primeiro deles é a velocidade relativa e facilidade com que os resultados podem ser obtidos & # 151 não há necessidade de blotting ou hibridização radioativa, e uma análise completa do início ao fim pode ser realizada em um único dia útil, ao contrário de estudos RFLP ou minissatélites . Ao contrário de todos os outros protocolos baseados em PCR, os primers RAPD não dependem dos resultados de estudos dispendiosos de clonagem e sequenciamento e, uma vez obtidos, o principal custo por amostra é a DNA polimerase usada para PCR. Assim, mesmo em comparações de cepas consanguíneas, o protocolo RAPD pode ser mais eficiente a longo prazo em relação a outras técnicas para gerar marcadores de DNA aleatórios. Além disso, a clonagem de fragmentos RAPD pode ser realizada rapidamente após a simples recuperação de bandas detectadas de brometo de etídio.Os loci RAPD clonados terão uma vantagem sobre os minissatélites e microssatélites, pois os loci RAPD não precisam, e a maioria não conterá, sequências repetitivas.

Como é o caso com os loci RFLP tradicionais, o nível interespécies de polimorfismo RAPD é muito maior do que o observado entre as linhagens puras tradicionais. Os dados de Serikawa et al. (1992) indicam um aumento de cinco vezes no número de bandas polimórficas observadas nas comparações entre M. spretus e cepas de laboratório tradicionais, este aumento é paralelo ao aumento conhecido na diversidade genética. Assim, a tecnologia RAPD será ainda mais eficiente para o desenvolvimento de marcadores em cruzamentos que incorporam um progenitor que não é derivado de uma das cepas consanguíneas tradicionais.

Como a análise de minissatélites, o protocolo RAPD pode fornecer impressões digitais genômicas que fazem a varredura simultânea de loci dispersos por todo o genoma. Em uma análise de 32 cepas consanguíneas representativas mantidas no Laboratório Jackson, Nadeau e colegas (1992) definiram 29 impressões digitais de cepas únicas com o uso de apenas seis primers. Assim, o RAPD parece fornecer um meio fácil e eficiente para monitorar continuamente a pureza genética de linhagens consanguíneas.

Por fim, deve-se mencionar que, embora o protocolo RAPD seja uma adição útil e importante ao arsenal de ferramentas disponíveis para a análise genética do camundongo, é muito mais importante para estudos genéticos de outras espécies, incluindo animais e plantas. , que não são bem caracterizados no nível do DNA. Para essas outras espécies, a tecnologia RAPD pode fornecer um método único para o rápido desenvolvimento de marcadores e mapas genéticos, mesmo antes que as bibliotecas e clones de DNA estejam disponíveis.

8.3.5 PCR de sequência repetitiva intercalada

O princípio por trás da abordagem RAPD é que os oligonucleotídeos tendo essencialmente uma sequência aleatória estarão presentes em posições aleatórias no genoma (do camundongo e de todas as outras espécies) em uma frequência que pode ser predeterminada matematicamente. Assim, escolhendo oligonucleotídeos de tamanho apropriado e executando reações de amplificação de PCR sob as condições apropriadas, pode-se controlar o número de fragmentos genômicos independentes que são amplificados de modo que possam ser resolvidos de forma otimizada por um sistema escolhido de eletroforese em gel. Embora útil para a análise de ligação, a abordagem RAPD não permite a discriminação de sequências de camundongos de outras espécies e, portanto, não pode ser usada como um meio para recuperar fragmentos genômicos de camundongos de células que contêm uma porção definida do genoma de camundongos dentro o contexto da formação genética heteróloga.

Uma abordagem alternativa que, como o RAPD, também permite a amplificação simultânea por PCR de múltiplos fragmentos genômicos é baseada na ocorrência natural de elementos de DNA altamente repetidos que estão dispersos por todo o genoma. Três famílias de elementos de repetição do mouse & # 151 B1, B2 e L1 & # 151 estão cada uma presentes em aproximadamente 100.000 cópias (consulte a Seção 5.4). A amplificação desses elementos por si só com primers específicos de repetição não seria útil, primeiro, porque seus números de cópias são muito grandes para serem resolvidos por qualquer sistema de gel disponível e, segundo, porque não haveria maneira de distinguir a maioria dos elementos individuais um do outro, uma vez que a maioria teria o mesmo tamanho de consenso. No entanto, se, em vez disso, fosse usado um primer específico de repetição que & # 034 fora do elemento & # 034, seria amplificado apenas regiões de DNA presentes entre dois elementos que estavam suficientemente perto de cada um e na orientação correta para permitir a reação de PCR para prosseguir. O número de casos em que dois elementos satisfariam essas condições será muito menor do que o número total de cópias, uma vez que, em média, esses elementos serão espaçados a distâncias de aproximadamente 30 kb 63 e, para todos os fins práticos, a amplificação por PCR não ocorrem em distâncias maiores que 1-2 quilobases. Ao trabalhar com (1) um ou uma combinação de dois ou mais primers juntos que (2) hibridizam para famílias inteiras ou subconjuntos de elementos dentro de uma família, de (3) duas extremidades do mesmo elemento ou de elementos diferentes, pode-se ajustar o número de produtos de PCR que serão gerados para obter o número máximo que pode ser resolvido por um sistema escolhido de eletroforese em gel (Herman et al., 1992).

Este protocolo geral é conhecido como PCR de sequência repetitiva intercalada (IRS) (IRS-PCR). Foi desenvolvido pela primeira vez para uso com os altamente repetidos Alu família de elementos no genoma humano (Nelson et al., 1989), e foi subsequentemente aplicada ao genoma do camundongo (Cox et al., 1991). Cox e colegas de trabalho usaram primers individuais representando cada uma das principais classes de elementos repetitivos altamente dispersos & # 151 B1, B2 e L1 & # 151 para amplificar fragmentos genômicos de camundongos B6 consanguíneos (M. musculus) e M. spretus. Embora os padrões de IRS-PCR obtidos na eletroforese em gel de agarose fossem extremamente complexos, foi possível ver evidências claras de especificidade de espécie. Para simplificar os padrões, esses trabalhadores blotted e hibridizados sequencialmente os produtos IRS-PCR para oligonucleotídeos de sequência simples (12-mers contendo três cópias em tandem de um tetrâmero) presentes frequentemente no genoma, mas apenas, por acaso, em um subconjunto do inter amplificado -repetir regiões. Os padrões simplificados obtidos permitiram a identificação e mapeamento de 13 novos locos polimórficos.

Claramente, a utilidade do IRS-PCR como uma ferramenta de mapeamento geral não é maior do que a da técnica RAPD ou qualquer outro protocolo que permite a amplificação aleatória de fragmentos de PCR ao redor do genoma. No entanto, o verdadeiro poder do IRS-PCR não está no mapeamento geral, mas na identificação e recuperação de sequências específicas de camundongos de híbridos de células, conforme discutido na Seção 8.4.

8.3.6 Microssatélites: Polimorfismos de comprimento de sequência simples

8.3.6.1 A bala mágica chegou

Embora a capacidade de identificar e digitar substituições de pares de base simples tenha mudado a cara da genética, não tem sido uma panacéia. Encontrar RFLPs dentro de uma região clonada muitas vezes não é fácil quando eles são encontrados, seu conteúdo polimórfico é frequentemente limitado e di-alélico, finalmente, digitar um grande número de loci RFLP por análise de Southern blot é relativamente trabalhoso. Mudanças de base não RFLP também podem ser difíceis de encontrar, embora essa tarefa tenha se tornado mais fácil com o desenvolvimento do protocolo SSCP. No entanto, a maioria dos SSCPs ainda mostra um conteúdo polimórfico limitado com apenas dois alelos distinguíveis. Os minissatélites são muito mais polimórficos do que os loci definidos por substituições de nucleotídeos e as sondas de minissatélites geralmente permitem digitar simultaneamente vários loci dispersos por todo o genoma. No entanto, os elementos de minissatélite como uma classe não têm características de sequência únicas e são reconhecidos apenas pelos padrões de Southern blot que produzem quando são usados ​​como sondas. O número de loci minissatélites descobertos até hoje é inferior a 1.000. Assim, em geral, os minissatélites não podem fornecer alças específicas para a digitação de genes recém-clonados ou regiões genômicas. Outros métodos de análise multi-locus descritos anteriormente sofrem das mesmas limitações.

No próximo capítulo, será visto que um uso muito importante dos marcadores de DNA não é seguir genes específicos de interesse em uma análise de segregação, mas sim fornecer & # 034 âncoras & # 034 que são espaçadas a distâncias uniformes ao longo de cada cromossomo no genoma. Juntos, esses loci âncora podem ser usados ​​para estabelecer & # 034 mapas de estrutura & # 034 para novos cruzamentos que, por sua vez, podem ser usados ​​para mapear rapidamente qualquer novo locus ou mutação que seja de real interesse. Se o número de âncoras for suficiente, será necessária apenas uma única cruz para fornecer uma posição no mapa para o novo local. Não há necessidade de loci âncora para representar genes reais. Seu único propósito é marcar pontos específicos ao longo da molécula de DNA em cada um dos cromossomos de um genoma.

Existem três critérios que definem locais de âncora perfeitos. Primeiro, eles devem ser extremamente polimórficos para que haja uma boa chance de que quaisquer dois cromossomos homólogos em uma espécie carreguem alelos diferentes. Em segundo lugar, eles devem ser fáceis de identificar para que se possa desenvolver um conjunto apropriado de âncoras para a análise de qualquer espécie complexa que um geneticista deseja estudar. Finalmente, eles devem ser fáceis de digitar rapidamente em um grande número de indivíduos.

Agora, com o alvorecer da década de 1990, veio o que pode realmente ser a solução mágica que os geneticistas (que estudam o camundongo, assim como todos os outros mamíferos) têm esperado por & # 151 um elemento genômico com conteúdo polimórfico incomumente alto, que está presente em alta densidade em todos os genomas de mamíferos examinados, é facilmente descoberta e tipificada rapidamente: o microssatélite. Um microssatélite & # 151, também conhecido como repetição de sequência simples (ou SSR) & # 151 é um elemento genômico que consiste em uma sequência mono-, di-, tri- ou tetramérica repetida várias vezes em uma matriz tandem.

Ao contrário de outras famílias de elementos dispersos de hibridização cruzada & # 151, como B1, B2 e L1 & # 151, nas quais os loci individuais são derivados por retrotransposição de sequências ancestrais comuns (consulte a Seção 5.4), os loci microssatélites individuais são quase certamente derivados de novo, por meio da ocorrência casual de repetições curtas de sequência simples que fornecem um modelo para eventos de crossover desiguais (conforme ilustrado na Figura 8.4) que podem levar a um aumento no número de repetições por meio de processos estocásticos. Em geral, os loci microssatélites não são conservados em linhas de espécies distantes, por exemplo, de camundongos a humanos, e parece improvável que esses elementos & # 151, que são praticamente desprovidos de conteúdo de informação & # 151, tenham qualquer funcionalidade para o benefício do hospedeiro genoma 64 ou em si. Os microssatélites não parecem ser elementos egoístas (discutidos na Seção 5.4). Em vez disso, microssatélites, como minissatélites, são simplesmente peculiaridades genômicas que resultam de erros na recombinação ou replicação.

Microssatélites contendo todas as combinações de nucleotídeos foram identificados. No entanto, a classe encontrada com mais frequência no genoma do camundongo contém um dímero (CA) n & # 149 (GT) n e é freqüentemente referida como uma repetição de CA. A existência de repetições de CA, sua presença em um alto número de cópias e sua dispersão ao longo dos genomas de uma variedade de espécies eucarióticas superiores foi demonstrada pela primeira vez há uma década por vários laboratórios diferentes (Miesfeld et al., 1981 Hamada et al., 1982 Jeang e Hayward, 1983). Embora exemplos independentes de polimorfismos de repetição de CA tenham surgido na década seguinte, não foi até 1989 que três grupos trabalhando independentemente descobriram evidências suficientes para sugerir que os microssatélites como uma classe eram intrinsecamente extremamente polimórficos (Pickford, 1989 Weber e maio de 1989 Pedersen et al ., 1993). Outros estudos sistemáticos confirmaram o alto nível de polimorfismo associado a muitos loci microssatélites em todos os eucariotos superiores que foram examinados.

8.3.6.2 Digitação por PCR

Sem PCR, a maioria dos microssatélites seriam inúteis como marcadores genéticos. A variação alélica 65 é baseada inteiramente nas diferenças no número de repetições presentes em uma matriz em tandem, em vez de em mudanças de pares de base específicas. Assim, a única maneira pela qual os alelos podem ser distinguidos é medindo o comprimento total do microssatélite. Isso é mais facilmente realizado por meio da amplificação por PCR do próprio microssatélite junto com uma pequena quantidade de sequência flanqueadora definida em cada lado, seguida por eletroforese em gel para determinar o tamanho relativo do produto, conforme ilustrado na Figura 8.10.

Os loci microssatélites podem ser identificados de duas maneiras & # 151, pesquisando em bancos de dados de sequências de DNA ou por hibridização em bibliotecas ou clones com um oligonucleotídeo apropriado, como (CA) 15. No primeiro caso, as informações da sequência de flanqueamento são obtidas diretamente do banco de dados. No último caso, é primeiro necessário sequenciar através da região de repetição para derivar informações de sequência de flanqueamento. Um oligonucleotídeo único em cada lado da repetição é escolhido para a produção de um iniciador de acordo com os critérios descritos no início da Seção 8.3. É melhor escolher dois primers que estejam o mais próximos possível da sequência de repetição & # 151 quanto menor for o produto de PCR, mais fácil será detectar qualquer diferença absoluta no tamanho. As variações no comprimento dos produtos de PCR podem ser detectadas por separação em géis de agarose NuSieve & # 153 (FMC Corp.) (Love et al., 1990 Cornall et al., 1991) ou géis de poliacrilamida (Weber e maio, 1989 Love et al. , 1990). Os géis de agarose são mais fáceis de manusear, mas os géis de poliacrilamida oferecem maior resolução. Quando os alelos são difíceis de resolver com géis nativos, geralmente é possível melhorar o nível de resolução executando géis desnaturantes. As bandas são detectadas por brometo de etídio ou coloração com prata de géis ou por autorradiografia de produtos de PCR formados com iniciadores marcados.

Um nível ainda mais alto de eficiência de custos pode ser alcançado combinando dois ou mais loci para análise simultânea por meio de PCR multiplex. As amostras podem ser combinadas antes da reação de PCR & # 151 se os diferentes pares de primers não causarem artefatos combinatórios & # 151 ou após a reação de PCR, mas antes da execução do gel. Em todos os casos, todo o processo é passível de automação.

8.3.6.3 Classificação e frequência de microssatélites

Os microssatélites podem ser classificados primeiro de acordo com o número de nucleotídeos na unidade de repetição. Elementos de repetição de mononucleotídeo e dinucleotídeo são bastante comuns com cada incremento subsequente no comprimento do nucleotídeo & # 151 do trinucleotídeo ao tetranucleotídeo ao pentanucleotídeo & # 151 a frequência de ocorrência cai rapidamente. Perfeito microssatélites são aqueles que contêm um único elemento de repetição ininterrupto flanqueado em ambos os lados por sequências não repetidas (Weber, 1990). Uma grande proporção de loci microssatélites são imperfeita com duas ou mais execuções da mesma unidade de repetição interrompidas por trechos curtos de outras sequências. As propriedades polimórficas de microssatélites imperfeitos são determinadas pelo mais longo trecho de repetição perfeita dentro do locus. Não raramente, os microssatélites são de um imperfeita e composto natureza, com uma mistura de duas ou mais sequências distintas de diferentes unidades de repetição.

Com base em uma análise de dot blot quantitativa, Hamada e seus colegas (1982a, 1982b) estimaram o número de locos de repetição CA no genoma do camundongo em & # 126100.000, equivalente a uma média de um locus a cada 30 kb. Outra estimativa do número de cópias repetidas de CA foi obtida por varredura de 287 kb de sequências genômicas de camundongos inseridas no GenBank para (CA) n onde n era seis ou mais (Stallings et al., 1991). Esta análise encontrou repetições de CA uma vez a cada 18 kb em média. A diferença entre essas duas estimativas pode ser explicada inteiramente por sequências com apenas 6-9 repetições, que são muito curtas para serem detectadas pela análise dot blot baseada em hibridização (Weber, 1990).

A segunda classe de microssatélites mais frequente no genoma do camundongo é a repetição GA, que ocorre com uma frequência de aproximadamente metade da observada para repetições CA (Cornall et al., 1991). Os loci de repetição de GA são tão provavelmente polimórficos quanto os loci de repetição de CA. Assim, ao rastrear os dois simultaneamente, pode-se aumentar as chances de encontrar um microssatélite útil em 50%.

A repetição de mononucleotídeo poli (A & # 149T) é encontrada no genoma de camundongo em uma frequência semelhante a, senão maior do que, as repetições de CA. No entanto, muitas vezes está contido nas repetições B1, B2 e L1 altamente dispersas, que estão presentes em & # 126100.000 cópias por genoma haplóide. Assim, triagens aleatórias para tratos de poli (A & # 149T) freqüentemente levarão os investigadores a essas regiões repetitivas mais extensas, onde será difícil derivar pares de primers específicos de locus para análise de PCR. No entanto, se alguém estiver ciente dessa armadilha, torna-se possível usar programas de computador para auxiliá-lo nesta tarefa, e muitas vezes é possível digitar elementos B1 (ou B2 ou L1) contendo microssatélites (Aitman et al., 1991) . As repetições de mononucleotídeos, tanto dentro quanto fora dos elementos de repetição mais complexos, são tão provavelmente polimórficas quanto as repetições de dinucleotídeos (Aitman et al., 1991). No entanto, uma segunda armadilha potencial com longos tratos poli (A & # 149T) é que, como é o caso com tratos longos (TA) n & # 149 (AT) n dinucleotídeo, há uma temperatura de fusão reduzida que requer o uso de PCR etapas de alongamento sob condições de especificidade reduzida, levando a um aumento da incidência de produtos artefatos. Como consequência dessas armadilhas, os tratos poli (A & # 149T) têm sido usados ​​com muito menos frequência como fonte de marcadores microssatélites polimórficos. O microssatélite poli (C & # 149G) não está associado a nenhuma dessas armadilhas, mas é muito menos frequentemente observado & # 151 por uma ordem de magnitude & # 151 no genoma do camundongo (Aitman et al., 1991).

Microssatélites de unidade de repetição de tri e tetranucleotídeo também estão presentes no genoma, mas em uma frequência dez vezes menor que a dos loci dinucleotídeo (CA) ne (GA) n (Hearne et al., 1992). 67 Como tal, eles serão representados com muito menos frequência em bibliotecas genômicas e clones individuais. No entanto, uma vez descobertos, esses microssatélites de ordem superior são muito melhores para trabalhar do que os loci dinucleotídeos. O nível de polimorfismo observado com os loci tri e tetranucleotídeo parece semelhante ao observado com repetições CA e GA, mas os alelos são muito mais prontamente resolvidos com deslocamentos de mobilidade de 3-4 bp para cada diferença de unidade de repetição. Além disso, escadas de produtos de PCR artefatos comumente vistos com repetições de dinucleotídeos não aparecem com tanta frequência ou intensidade com loci de unidades de repetição de ordem superior (Hearne et al., 1992).

8.3.6.4 Níveis de polimorfismo e taxas de mutação

Como no caso dos locos minissatélites, a geração de novos alelos microssatélites não se deve a mecanismos clássicos de mutagênese. Em vez disso, o número de repetições em tandem é alterado como consequência do pareamento incorreto, ou deslizamento, durante a recombinação ou replicação dentro da sequência de repetição em tandem. Conforme ilustrado na Figura 8.4, eventos desse tipo criarão novos alelos ao expandir ou contrair o tamanho do locus. A frequência com que esses eventos ocorrem é uma função do número de repetições no locus com uma distribuição sigmoidal. Microssatélites CA com 10 ou menos unidades de repetição são improváveis ​​de mostrar polimorfismo com 11 a 14 unidades de repetição, há uma probabilidade intermediária e crescente de detectar polimorfismo com 15 unidades de repetição ou mais, há uma probabilidade máxima de detectar polimorfismo (Weber , 1990 Dietrich et al., 1992). Assim, para maximizar a probabilidade de detecção de polimorfismo, deve-se focar as análises em loci de repetição CA com n & # 062 & # 061 15. Os rastreios de hibridação podem ser configurados para realizar esta tarefa testando manchas com um oligonucleótido (CA) 15 sob condições de rigor elevado de 65 & # 176C com 0,1 X SSC (Dietrich et al., 1992).

Um grande número de laboratórios relatou agora os resultados de investigações sobre as frequências nas quais os polimorfismos de microssatélites são detectados em comparações de duas ou mais linhagens consanguíneas ou espécies de camundongos.Espera-se que os resultados reais variem dependendo do método usado para recuperar microssatélites (porque isso determinará o limite inferior para o número de repetição) e do método usado para digitar os produtos de PCR (porque os géis de agarose têm menos resolução do que os géis de poliacrilamida). Em uma análise de mais de 300 microssatélites de repetição de CA que são predominantemente do n & # 062 & # 061 15 classe, uma taxa média de polimorfismo de aproximadamente 50% foi observada em comparações de pares entre nove clássicos M. musculus linhagens consanguíneas o nível mais baixo de polimorfismo observado foi de 35% entre DBA / 2J e C3H / HeJ, e o maior foi de 57% entre B6 e LP / J (Dietrich et al., 1992). Não inesperadamente, níveis ainda mais elevados de polimorfismo foram observados em comparações de pares entre cepas consanguíneas clássicas e outras Mus espécies ou subespécies. A taxa de polimorfismo entre B6 e Milímetros. Castaneus foi de 77%, e entre B6 e M. spretus, foi & # 12690% (Love et al., 1990 Dietrich et al., 1992). Para um número pequeno, mas significativo de loci, os primers projetados para amplificar um locus de cepa consanguínea não conseguiram amplificar um produto alélico do M. spretus genoma (Love et al., 1990) isso é quase certamente devido a um polimorfismo interespecífico em uma sequência alvo reconhecida por um dos primers flanqueadores.

Vários pesquisadores tentaram medir a taxa em que novos alelos de microssatélites são criados. Isso pode ser facilmente realizado no camundongo, onde as relações entre um grande número de diferentes linhagens consanguíneas foram bem documentadas e é possível contar as gerações que separam várias linhagens umas das outras (Bailey, 1978). Os resultados desses estudos indicam que a taxa de mutação é altamente variável & # 151 em pelo menos uma ordem de magnitude. Essa variabilidade pode ser uma consequência dos efeitos da posição genômica, mas o mecanismo de geração do alelo deve ser esclarecido antes que se possa dizer com certeza. Na análise mais abrangente até o momento, Dietrich e colegas (1992) analisaram a taxa média de mutação em 300 loci dentro do conjunto BXD de cepas consanguíneas recombinantes. A taxa média de mutação foi calculada em um em 22.000 por locus por geração, que é 5-50 vezes maior do que a normalmente atribuída à mutagênese em loci clássicos. Esta taxa média de microssatélites & # 034mutação & # 034 é alta o suficiente para permitir a geração de uma grande quantidade de polimorfismo entre os indivíduos de uma espécie, mas baixa o suficiente para permitir que alguém siga com precisão a segregação de dois ou mais alelos de uma geração para a próxima dentro de um cruzamento genético típico.

8.3.6.5 O incrível poder dos microssatélites

O alto nível de polimorfismo associado a microssatélites (como uma classe) representa apenas um componente de sua rápida ascensão para se tornar a & # 034ferramenta genética de escolha & # 034 para mapeadores que trabalham com todas as espécies animais. Sua singularidade e poder também residem na facilidade com que podem ser descobertos, na facilidade com que podem ser digitados e na facilidade com que podem ser disseminados. Para desenvolver um painel de loci microssatélites para análise do genoma do camundongo, Todd e seus colegas simplesmente pesquisaram nos bancos de dados EMBL e GenBank por entradas que continham (CA) 10, (GA) 10 ou seus complementos (Love et al., 1990 ) Para aumentar o tamanho deste painel para análise de mapeamento de alta resolução, bibliotecas genômicas construídas para conter inserções curtas foram rastreadas com sondas de repetição de CA e clones positivos foram isolados e sequenciados (Cornall et al., 1991 Dietrich et al., 1992).

Usando um painel combinado de 317 loci microssatélites, o Whitehead / MIT Genome Center desenvolveu um mapa de ligação do genoma de camundongo completo de primeira geração com um espaçamento médio de 4,3 cM (Dietrich et al., 1992). Com a publicação das sequências de oligonucleotídeos que definem e permitem a tipificação de cada locus, os marcadores passaram a ser disponibilizados a todos de forma democrática. Em janeiro de 1994, o grupo Whitehead havia definido e mapeado mais de 3.000 loci microssatélites. 68 Mapeamento atualizado, distribuição de cepas e informações de sequência em todos esses loci podem ser obtidas eletronicamente conforme descrito no Apêndice B. Além disso, a empresa comercial Research Genetics Inc. tornou a vida ainda mais fácil para a comunidade genética de camundongos, oferecendo cada primer par neste painel a um custo bastante reduzido em relação à síntese personalizada de DNA.

Uma vez que a tipagem de microssatélites é baseada em PCR, e geralmente não há necessidade de blotting ou sondagem, os resultados podem ser obtidos rapidamente com um gasto mínimo de material muitas vezes precioso e sempre preciosas horas-homem e mulher. Dietrich e colegas (1992) relataram que dois cientistas podem & # 034genotipar novos cruzamentos para todo o genoma em algumas semanas por cruzamento & # 034, o que representa uma ordem de magnitude de melhoria sobre as abordagens baseadas em RFLP.

Os microssatélites podem servir não apenas como marcadores para loci anônimos, mas também para genes funcionais. Stallings e seus colegas (1991) descobriram que 78% dos clones de uma biblioteca de cosmídeos de camundongo têm repetições de CA. Se também se procurasse por repetições de GA, a porcentagem de clones de cosmídeo positivos para microssatélites seria ainda maior. Uma probabilidade ainda maior de identificar loci microssatélites & # 151 perto de 100% & # 151 pode ser alcançada com clones recuperados de bibliotecas de inserção maiores construídas com cromossomos artificiais de levedura (YACs) ou vetores procarióticos especiais (consulte a Seção 10.3.3). Pequenos fragmentos que contêm o microssatélite podem ser subclonados e sequenciados para identificar um conjunto único de primers flanqueadores para análise genética. Os microssatélites podem realmente ser vistos como reagentes de mapeamento genético universal.

Durante a década de 1980, as dificuldades encontradas na busca de RFLPs entre as cepas consanguíneas clássicas levaram ao surgimento do cruzamento interespecífico & # 151 entre um M. musculus- linhagem consanguínea derivada e M. spretus & # 151, que se tornou uma ferramenta crítica para o desenvolvimento dos primeiros mapas de alta resolução baseados em locus de DNA do genoma de camundongo (Avner et al., 1988 Copeland e Jenkins, 1991 e Seção 9.3). Painéis de retrocruzamento interespecífico ainda representam uma ferramenta poderosa para mapear clones de DNA recentemente caracterizados. No entanto, com microssatélites, agora é possível voltar aos cruzamentos clássicos entre M. musculus cepas para mapear variantes fenotípicas interessantes, conforme discutido na Seção 9.4.


As 8 técnicas mais usadas em genômica e ndash explicadas!

Aqui, detalhamos sobre as oito principais técnicas usadas em genômica.

As oito técnicas são: (1) Isolamento de DNA genômico, (2) Separação de DNA, (3) Corte e união de DNA, (4) Clonagem e vetores, (5) Detecção de gene de interesse, (6) DNA recombinante e Clonagem, (7) Produção de Múltiplas Cópias de DNA Usando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e (8) Sequenciamento de DNA.

1. Isolamento de DNA genômico:

Como o DNA está presente no núcleo da célula, muitos métodos são usados ​​para romper as barreiras externas como matriz extracelular, envelope nuclear e parede celular no caso das plantas.

Estes são obtidos tratando o tecido ou a célula com vários tipos de detergentes, que dissolvem as barreiras externas. No caso de células vegetais, algumas enzimas são usadas como celulase, pectinase, celobiosidase, xilanase, etc. que quebram a parede celular.

Uma vez que a célula é quebrada, os detritos (matriz extracelular, membrana, etc.) são removidos por centrifugação em alta velocidade. Após a centrifugação, as proteínas indesejadas e o RNA são removidos tratando-se com enzimas como protease (proteínas de quebra) e RNAse (RNA de quebra).

Para o isolamento da forma muito pura de DNA, uma técnica chamada ultracentrifugação de gradiente de densidade é usada (Fig. 81). Neste, diferentes componentes celulares são colocados em um gradiente com densidades variadas (NaCl e sacarose é usado) e eles são centrifugados a uma velocidade muito alta de 40.000 rotações por minuto a 70.000 (r.p.m.).

Como diferentes componentes celulares têm densidades diferentes, eles migram e param no gradiente onde sua densidade é igual à densidade do NaCl e da sacarose. Dessa forma, o DNA também para em uma densidade específica e é extraído do tubo de gradiente.

2. Separação de DNA:

As moléculas de DNA são carregadas negativamente, portanto, quando são submetidas a um campo elétrico, passam do eletrodo negativo para o positivo. Para a movimentação do DNA sob a influência da corrente elétrica é utilizado um meio denominado gel. Esta é uma substância semissólida feita de polímeros como Agarose, Poliacrilamida etc.

Esse material gelificante forma uma rede porosa de fibras e as moléculas de DNA se movem por esses poros. Para separar moléculas grandes de DNA, o gel de agarose é usado e, para separar pequenos fragmentos de DNA, o gel de poliacrilamida é usado. Este método é denominado Eletroforese em Gel. Para a eletroforese em gel, é usado um tampão que está envolvido na condução da corrente através do gel.

Quando as moléculas de DNA passam do eletrodo negativo para o positivo, as moléculas maiores de DNA se movem lentamente e estão mais próximas do pólo negativo. As moléculas menores de DNA se movem mais rápido e são posicionadas mais em direção ao pólo positivo. Este fenômeno é ilustrado na Fig. 8.2.

3. Corte e união de DNA:

A tecnologia do DNA recombinante envolve principalmente o corte preciso e a união de moléculas de DNA. Tipos especiais de enzimas são usados ​​para cortar DNA em um determinado local, são chamados de Enzimas de Restrição. A característica da enzima de restrição é que ela reconhece uma sequência específica (nucleotídeos) nas moléculas de DNA e corta naquele local. Por meio desse corte preciso, eles geram extremidades compatíveis da molécula de DNA que podem ser unidas posteriormente.

O tipo de sequência que é reconhecido pelas enzimas de restrição é chamado de sequência de palíndromo (são sequências que são imagens espelhadas uma da outra - Fig. 8.3). Uma vez que o DNA é cortado por uma enzima de restrição, os dois pedaços de qualquer molécula de DNA podem ser unidos por outra enzima chamada Ligase.

4. Clonagem e vetores:

Para inserir um pedaço de DNA estranho e para propagar o fragmento de DNA para produção em grande escala, um vetor é usado. Os vetores são veículos de clonagem que podem se replicar dentro de um hospedeiro apropriado. Muitos tipos diferentes de vetores são usados ​​para clonagem molecular - estes são principalmente Plasmídeo (molécula de DNA circular de fita dupla), Cosmídeo (moléculas de DNA circular que também podem ser empacotadas dentro de um vírus), bacteriófago (vírus que infecta diferentes cepas bacterianas), etc. ( Miller, 1992).

Uma vez que o vetor apropriado é selecionado, ele é cortado pela enzima de restrição para criar um local para a inserção do DNA estranho. Em seguida, o DNA estranho é ligado ao vetor e é transferido para uma célula hospedeira onde o vetor, junto com o DNA estranho, pode se multiplicar. Para selecionar o vetor dentro da célula hospedeira, vários tipos de marcadores selecionáveis ​​são usados, como resistência a antibióticos, etc.

5. Detecção do gene de interesse:

Para detectar um gene particular de interesse, as técnicas que são normalmente utilizadas são Southern Hybridization, Colony Hybridization, Dot blot (Sambrook et al. 1989). O princípio por trás desses métodos é simples. A molécula de DNA de nosso interesse que queremos detectar é chamada de Alvo.

A molécula de DNA com uma sequência conhecida com a qual vamos detectar a molécula alvo em uma mistura de outra molécula de DNA é chamada de sonda. A sonda é preparada incorporando isótopo radioativo de fosfato. Normalmente é usado o radioisótopo de fosfato P 32 ou P 33. O P 32 ou P 33 é incorporado no dATP, que é o bloco de construção do DNA. Estes são então incorporados na molécula da sonda pelo processo denominado Rotulagem.

Na Southern Hybridization, a molécula de DNA alvo é separada de acordo com seu peso molecular por agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, o DNA no gel é desnaturado (o DNA torna-se de fita simples) usando um álcali como o NaOH. Após a desnaturação, o DNA é transferido para uma superfície sólida como membranas feitas de Nylon ou Nitrocelulose.

O DNA transferido na membrana é usado como uma réplica e é hibridizado com a sonda radiomarcada. Após o término da hibridização, a membrana é lavada com tampões de modo que a ligação não específica da sonda seja removida.

A membrana é então seca e colocada em uma cassete de autoradiografia de raios-X. Após a exposição da sonda ligada à membrana com o filme de raios-X, o sinal radioativo é detectado na folha de raios-X. O sinal corresponde à posição do gene de interesse.

6. DNA recombinante e clonagem:

O DNA recombinante é uma molécula de DNA quimérica que contém DNA de uma fonte e alguma parte da molécula de DNA é de outra fonte. Conforme explicado anteriormente, a molécula de DNA pode ser cortada precisamente em um determinado ponto com a ajuda de enzimas de restrição. Quando duas moléculas de DNA são cortadas com uma determinada enzima de restrição e então unidas por uma enzima chamada ligase, a molécula de DNA resultante é chamada de molécula de DNA quimérica ou recombinante.

A clonagem significa a produção de uma cópia exata de qualquer material. É como uma máquina Xerox, que continua produzindo a mesma cópia de um documento. A clonagem é uma parte essencial da tecnologia do DNA recombinante. A clonagem de uma molécula de DNA significa produzir cópias idênticas dessa molécula de DNA. Nesse caso, a molécula de DNA é unida a um vetor ou veículo (o que é explicado na seção anterior).

O vetor contém as informações para a replicação, também conhecida como origem de replicação. Devido à presença da Origem de Replicação no DNA do vetor, o vetor - quando introduzido dentro de uma célula hospedeira se replica. Quando a replicação do vetor ocorre, ele também produz grandes cópias de si mesmo e também do DNA estranho (Fig. 8.4).

7. Produção de múltiplas cópias de DNA usando a reação em cadeia da polimerase (PCR):

Várias cópias de uma molécula de DNA podem ser produzidas por PCR. Em 1983, a bioquímica Kary Mullis estabeleceu o princípio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Isso só pode ser feito se partes da sequência em questão forem conhecidas. Neste, a molécula de DNA modelo (da qual queremos fazer várias cópias) é desnaturada em alta temperatura 94 ° - 95 ° C (o DNA torna-se a forma de fita simples).

Em seguida, são adicionados DNA de fita simples curtos, conhecidos como iniciadores (oligonucleotídeos de geralmente 20-25 bases de comprimento). Eles marcam o ponto de partida da síntese de DNA, uma vez que a DNA polimerase e os trifosfatos de desoxinucleosídeos foram adicionados. Os iniciadores são homólogos à sequência do DNA molde.

Os primers ligam-se à sequência homóloga no DNA molde e este processo é denominado anelamento. Dois primers são escolhidos que garantem através de sua posição no fragmento de DNA que a síntese começa nas extremidades opostas do fragmento, tendo em mente que a polimerização enzimática vai de 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Após o recozimento, uma DNA polimerase termoestável é adicionada, chamada Taq polimerase (derivada de uma bactéria termoestável Thermus aquaticus e funciona a 72 ° C).

Esta polimerase termoestável é ativa mesmo em temperaturas mais altas, como 94 ° -95 ° C. Essa polimerase continua adicionando bases complementares aos primers e uma nova molécula de DNA é sintetizada. Todo esse processo é repetido várias vezes e a cada vez é chamado de ciclo. Por esse motivo, a técnica é chamada de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Na PCR, o DNA é amplificado de forma exponencial. Isso significa que a partir de uma molécula de DNA são produzidas duas moléculas de DNA. Essas duas moléculas de DNA servem como modelos no próximo ciclo e formam quatro moléculas de DNA. Todo esse processo se repete de forma cíclica.

A mudança repetida na temperatura para completar diferentes etapas em um ciclo de PCR é feita em uma máquina chamada termociclador (máquina de PCR). Este é um dispositivo controlado por microprocessador baseado na tecnologia Peltier, que é capaz de mudanças rápidas de temperatura em poucos segundos (Fig. 8.5).

O PCR é usado não apenas para a amplificação de DNA genômico, mas também para detectar e analisar a expressão de RNA, bem como clonar genes expressos. Nestes casos, o processo de amplificação é precedido por uma reação de transcriptase reversa (RT). Forma o material de RNA para o cDNA de fita simples analisado é sintetizado. Isso é conhecido como RT-PCR.

8. Sequenciamento de DNA:

Para determinar a sequência de um trecho de DNA, é usada uma técnica conhecida como método de Sanger de sequenciamento di + desoxi. Neste método, o DNA é desnaturado e o primer pode se anular com a fita de DNA. Em seguida, a reação de polimerização é realizada na presença de Klenow DNA polimerase e dNTP (desoxi ribo nucleotídeo trifosfato). Normalmente quatro reações realizadas e em cada reação são juntamente com a mistura de dNTP, um trifosfato de di + desoxi nucleotídeo (dd-NTP) é usado - por exemplo, dd-ATP, dd-GTP, dd-CTP, dd-TTP (Fig. 8.6).

O princípio por trás da reação é que a DNA Polimerase sintetizará a fita complementar de DNA e, durante a síntese, quando o derivado dd-NTP for incorporado, a reação irá parar, pois não haverá grupo hidroxila livre disponível no 3 & # 8242 fim. Por este processo, fragmentos de comprimentos diferentes serão produzidos, os quais serão marcados novamente na extremidade 5 & # 8242.

Esses pequenos fragmentos são então resolvidos em um gel de sequenciamento de Acilamida-Ureia e a Autoradiografia é feita para saber a posição exata das bandas. A partir da posição das bandas, podemos determinar a sequência do DNA, já que a banda mais baixa (menor banda) será a primeira base na qual a sequência será encerrada.


A ciência por trás do teste para o vírus COVID-19

O novo teste da Mayo Clinic para o vírus que causa COVID-19 é descrito em um recente comunicado à imprensa como um teste PCR. Embora a maioria não saiba o que isso significa, o PCR é uma ferramenta bem usada em testes laboratoriais e médicos. Larry Pease, Ph.D., um imunologista da Mayo Clinic e o professor de Biologia Celular Gordon H. e Violet Bartels e Kyle Rodino, Ph.D., um microbiologista clínico, explicam como esse teste funciona.

Para começar, PCR significa uma técnica de laboratório conhecida como reação em cadeia da polimerase. Nesse teste, o objetivo é amplificar seletivamente traços de material genético, identificando partes específicas do DNA. Só para lembrar, o DNA é o código genético que está presente em todas as células do corpo. Quando uma célula se divide, ela copia o DNA, separando as duas fitas e, em seguida, criando uma nova fita de DNA, copiando o modelo. O PCR imita o que normalmente acontece nas células.

A Mayo Clinic anuncia em 12 de março de 2020 que desenvolveu um teste que pode detectar o vírus SARS-CoV-2 em amostras clínicas. O vírus SARS-CoV-2 causa COVID-19.

O DNA é usado porque, no nível mais discriminatório, a estrutura do DNA pode dizer que organismo está sendo observado. No caso de humanos, o PCR pode identificar uma pessoa usando sua assinatura genética. No caso do COVID-19, os pesquisadores publicaram mais de 100 genomas coletados de pacientes para identificar as principais características do vírus que causa a doença, o SARS-CoV-2.

O PCR funciona apenas no DNA, e o vírus COVID-19 usa o RNA como código genético. O RNA é semelhante ao DNA, mas possui apenas uma única fita. Felizmente, as enzimas virais para converter RNA em DNA foram descobertas décadas atrás e têm sido utilizadas, junto com a PCR, para encontrar assinaturas exclusivas no RNA também. Neste caso, PCR é referido como PCR de transcrição reversa ou RT-PCR.

Primeiro, uma pessoa com sintomas de COVID-19 liga para seu médico local e pergunta como será avaliada. Lembre-se: ligue primeiro. Não vá à sua clínica ou hospital sem ligar para descobrir a maneira mais segura de fazer o teste. Assim que o paciente chega a um local de teste seguro, uma amostra é coletada pela equipe de saúde. Normalmente, isso significa que um cotonete estreito é colocado no nariz ou na boca de uma pessoa para coletar células da parte posterior da garganta.

"Uma amostra do trato respiratório superior, particularmente um esfregaço nasofaríngeo, é a amostra mais comum coletada para detectar o vírus de forma confiável", diz o Dr. Rodino. "Algumas amostras respiratórias inferiores, como escarro, também são aceitáveis ​​em alguns ambientes."

No laboratório, a amostra é processada para que o RNA seja isolado e coletado. Todo o resto é removido. O RNA é misturado com outros ingredientes: enzimas (DNA polimerase e transcriptase reversa), blocos de construção de DNA, cofatores, sondas e primers que reconhecem e se ligam ao SARS-CoV-2.

Em seguida, o RNA viral é convertido em uma cópia de DNA, e essa única cópia é então convertida em milhões de cópias usando PCR, que podem ser facilmente detectadas.

O processo é o seguinte: usando calor e enzimas, as fitas de DNA viral convertidas são separadas. Primers curtos de DNA que combinam com a fita complementar do molde de DNA viral se unem, funcionando como um local de início artificial para a síntese de DNA.

Os blocos de construção químicos do DNA são adicionados e unidos, estendendo o primer de DNA sintético para formar uma cópia do modelo de DNA viral. Um segundo primer feito na orientação oposta a jusante do primeiro primer também está presente na reação. Isso cria uma cópia complementar à primeira fita sintetizada.

Após uma rodada de síntese de DNA, a mistura de reação é aquecida para derreter as duas fitas, gerando dois modelos que podem ser amplificados na próxima rodada. As cópias se acumulam, rodada a rodada, de forma exponencial, de modo que milhões e milhões de cópias são geradas para serem estudadas por meio de abordagens convencionais.

Como as enzimas e produtos químicos adicionados ao tubo de reação são relativamente resistentes ao calor - "As enzimas sensíveis ao calor são isoladas de bactérias resistentes ao calor de fontes termais", diz o Dr. Pease - a reação pode prosseguir de uma forma automatizada de aquecimento, resfriamento e Síntese de DNA. Leva apenas horas para concluir o ensaio e obter os resultados.

Se o DNA complementar de SARS-CoV-2 estiver presente na amostra, os primers podem copiar as regiões-alvo. À medida que copiam essas regiões, as sondas presas a esses novos fragmentos liberam um sinal visual que pode ser lido pelo instrumento usado neste processo.

“Os milhões de cópias amplificam esse sinal para que ele seja facilmente detectado como resultado positivo. Se o vírus não estiver presente, as sondas não aderem, não há liberação de sinal e é um resultado negativo”, explica Dr. Rodino.

Este tipo de análise é usado para pesquisa e testes de laboratório clínico. O PCR pode detectar todos os tipos de bactérias, parasitas, vírus e fungos, começando com DNA ou RNA. Embora o princípio e os ingredientes sejam semelhantes, cada uso requer primers ou sondas específicas para detectar organismos diferentes. É por isso que algo para o SARS-CoV-2 teve que ser desenvolvido do zero. Durante o desenvolvimento, esses tipos de testes são ajustados para garantir que são muito bons em detectar o organismo de interesse (sensível) e para garantir que o teste não mostre um resultado positivo quando o organismo não está lá (específico).

"A importância das etapas envolvidas no PCR foi reconhecida por uma série de prêmios Nobel ao longo de décadas", disse o Dr. Pease. "A ciência médica avança como resultado de descobertas básicas sobre a base molecular dos sistemas vivos, e este é um exemplo de como essas descobertas se unem para resolver um problema importante em nossas vidas."

Trabalhando como equipe clínica e de pesquisa, os especialistas da Mayo conseguiram lançar um teste PCR para SARS-CoV-2 em questão de semanas - reduzindo o que normalmente leva de meses a anos.


Métodos para detectar interações proteína-DNA

O método de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) pode ser usado para monitorar a regulação da transcrição por meio da modificação da histona (epigenética) ou das interações de ligação do fator de transcrição-DNA. O método de ensaio ChIP permite a análise das interações DNA-proteína em células vivas, tratando as células com formaldeído ou outros reagentes de reticulação, a fim de estabilizar as interações para purificação e detecção downstream. A realização de ensaios ChIP requer o conhecimento da proteína alvo e da sequência de DNA que será analisada, pois os pesquisadores devem fornecer um anticorpo contra a proteína de interesse e primers de PCR para a sequência de DNA de interesse. O anticorpo é usado para precipitar seletivamente o complexo proteína-DNA dos outros fragmentos de DNA genômico e complexos proteína-DNA. Os primers de PCR permitem a amplificação e detecção específicas da sequência de DNA alvo. A técnica de PCR quantitativa (qPCR) permite que a quantidade de sequência de DNA alvo seja quantificada. O ensaio ChIP é compatível com formatos baseados em array (ChIP-on-chip) ou sequenciamento direto do DNA capturado pela proteína imunoprecipitada (ChIP-seq).

  • capturar um instantâneo de proteína-DNA específica
    interações à medida que ocorrem nas células vivas
  • quantitativo quando combinado com análise qPCR
  • capacidade de criar o perfil de um promotor para diferentes proteínas
  • o pesquisador precisa obter anticorpos de grau ChIP
  • requer a concepção de primers específicos
  • difícil de se adaptar para triagem de alto rendimento

Um guia passo a passo para ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) bem-sucedidos

Esta visão geral atualizada do procedimento ChIP inclui detalhes adicionais sobre a seleção de anticorpos primários (ou seja, anticorpos validados por ChIP). A nota de aplicação também descreve e fornece exemplos de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) como uma técnica para estudar epigenética, uma vez que permite aos pesquisadores capturar um instantâneo de interações específicas de proteína-DNA.

Nosso manual técnico de interação de proteínas de 72 páginas fornece protocolos e informações técnicas e de produtos para ajudar a maximizar os resultados dos estudos de interação de proteínas. O manual fornece antecedentes, dicas úteis e conselhos de solução de problemas para ensaios de imunoprecipitação e co-imunoprecipitação, ensaios pull-down, far-western blotting e crosslinking. O manual também apresenta uma seção expandida sobre métodos para estudar interações proteína-ácido nucleico, incluindo ChIP, EMSA e RNA EMSA. O manual é um recurso essencial para qualquer laboratório que esteja estudando interações de proteínas.

O conteúdo inclui: Introdução às interações de proteínas, Ensaios de co-imunoprecipitação, Ensaios de pull-down, Far-western blotting, Mapeamento de interação de proteína, Ensaios repórter de dois híbridos de levedura, Ensaios de mudança de mobilidade eletroforética [EMSA], Ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP), Proteína –Conjugados de ácido nucléico e muito mais.

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O ensaio de mudança de mobilidade por eletroforese de DNA (EMSA) é usado para estudar a ligação de proteínas a sondas de oligonucleotídeos de DNA conhecidas e pode ser usado para avaliar o grau de afinidade ou especificidade da interação. A técnica é baseada na observação de que os complexos de proteína-DNA migram mais lentamente do que as moléculas de DNA livres quando submetidos a poliacrilamida não desnaturante ou eletroforese em gel de agarose. Uma vez que a taxa de migração do DNA é alterada ou retardada após a ligação da proteína, o ensaio também é referido como um ensaio de deslocamento do gel ou de retardamento do gel. Adicionar um anticorpo específico de proteína aos componentes de ligação cria um complexo ainda maior (anticorpo-proteína-DNA), que migra ainda mais lentamente durante a eletroforese. Isso é conhecido como “supershift” e pode ser usado para confirmar identidades de proteínas. Até a concepção do EMSA, as interações proteína-DNA foram estudadas principalmente por ensaios de ligação de filtro de nitrocelulose usando sondas marcadas radioativamente.

  • detectar proteínas de ligação de DNA de baixa abundância a partir de lisados
  • testar mutações no local de ligação usando muitas configurações de sonda com o mesmo lisado
  • teste de afinidade de ligação por meio de análise mutacional de sonda de DNA
  • EMSA não radioativo possível usando sondas de DNA biotiniladas ou marcadas com fluorescência
  • analisar interações proteína-DNA in vitro
  • difícil de quantificar
  • precisa realizar o ensaio supershift com anticorpo para ter certeza da identidade da proteína em um complexo

Tradicionalmente, as sondas de DNA foram radiomarcadas com ³²P incorporando um [γ-³²P] dNTP durante uma reação de preenchimento 3 'usando fragmento Klenow ou por marcação de extremidade 5' usando [γ-³²P] ATP e T4 polinucleotídeo quinase. Após a eletroforese, o gel é exposto a um filme de raios-X para documentar os resultados. O Kit Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA é um ensaio não radioativo que oferece desempenho robusto e sensível. O kit inclui reagentes para configurar e personalizar reações de ligação de DNA, um conjunto de controle de DNA e extrato de proteína para testar o sistema do kit, conjugado estreptavidina-HRP estabilizado para sondar o DNA alvo marcado com biotina e um módulo de substrato quimioluminescente excepcionalmente sensível para detecção.

EMSA quimioluminescente de quatro diferentes complexos DNA-proteína. Os duplexes alvo marcados com biotina variaram em tamanho de 21–25 bp. Os fatores de transcrição Oct-1, AP1 e NF-κB foram derivados do extrato nuclear HeLa. O extrato EBNA-1 é fornecido como um controle no Kit LightShift Chemiluminescent EMSA. As sequências competidoras específicas não marcadas (quando usadas) estavam presentes em um excesso molar de 200 vezes sobre o alvo marcado. Os tempos de exposição do filme de raios-X para cada sistema variaram de 2 minutos para EBNA, Oct-1 e AP1, e 5 minutos para NF-κB.


Ponto final RT-PCR: Relativo vs. Competitivo vs. Comparativo

Apesar dos rápidos avanços feitos na área de química e instrumentação de detecção de PCR em tempo real, a RT-PCR de ponto final ainda permanece uma técnica muito comumente usada para medir mudanças na expressão gênica em pequenos números de amostra.

O ponto final RT-PCR pode ser usado para medir mudanças nos níveis de expressão usando três métodos diferentes: relativo, competitivo e comparativo. Os procedimentos mais comumente usados ​​para quantificar os resultados de RT-PCR de ponto final dependem da detecção de um corante fluorescente, como o brometo de etídio, ou quantificação do produto de PCR marcado com P32 por um phosphorimager ou, em menor extensão, por contagem de cintilação.

A quantificação relativa compara a abundância do transcrito em várias amostras, usando um controle interno co-amplificado para normalização da amostra. Os resultados são expressos como proporções entre o sinal específico do gene e o sinal de controle interno. Isso produz um valor relativo corrigido para o produto específico do gene em cada amostra. Esses valores podem ser comparados entre as amostras para uma estimativa da expressão relativa do RNA alvo nas amostras, por exemplo, 2,5 vezes mais IL-12 na amostra 2 do que na amostra 1.

A quantificação absoluta, usando RT-PCR competitivo, mede a quantidade absoluta (por exemplo, 5,3 x 105 cópias) de uma sequência de mRNA específica em uma amostra. Diluições de um RNA sintético (idêntico em sequência, mas ligeiramente mais curto do que o alvo endógeno) são adicionadas às réplicas de RNA de amostra e são co-amplificadas com o alvo endógeno. O produto de PCR do transcrito endógeno é então comparado à curva de concentração criada pelo "RNA competidor" sintético.

O RT-PCR comparativo imita o RT-PCR competitivo em que a mensagem alvo de cada amostra de RNA compete por reagentes de amplificação dentro de uma única reação, tornando a técnica quantitativa confiável. Como o cDNA de ambas as amostras tem o mesmo local de ligação do primer de PCR, uma amostra atua como competidora da outra, tornando desnecessário sintetizar uma sequência de RNA competidora.

Ambas as técnicas de quantificação RT-PCR relativas e competitivas requerem experimentos piloto. No caso de RT-PCR relativo, os experimentos piloto incluem a seleção de um método de quantificação e a determinação da faixa exponencial de amplificação para cada mRNA em estudo. Para RT-PCR competitivo, um transcrito competidor de RNA sintético deve ser sintetizado e usado em experimentos piloto para determinar o intervalo apropriado para a curva padrão. O RT-PCR comparativo produz sensibilidade semelhante ao RT-PCR relativo e competitivo, mas requer uma otimização significativamente menor e não requer a síntese de um competidor.


ASPECTOS METODOLÓGICOS

O ensaio de PCR no diagnóstico envolve várias etapas críticas, como extração de DNA de amostras, amplificação por PCR e detecção de amplicons. Em particular, quando amostras clínicas específicas, como LCR, com apenas algumas bactérias presentes, são testadas por PCR, cada procedimento deve ser cuidadosamente projetado e executado.

O LCR é amplamente utilizado para o diagnóstico de doenças do sistema nervoso central (SNC). Como o LCR tem funções importantes, incluindo amortecimento do cérebro, manutenção de uma pressão intracraniana constante, fornecimento de nutrientes e remoção de metabólitos tóxicos do SNC, uma avaliação indireta do estado do cérebro pode ser obtida a partir do LCR. Uma vez que o LCR é considerado livre de germes, a detecção de micróbios no LCR, mesmo em números baixos, fornece informações valiosas sobre uma possível infecção. No entanto, deve-se notar que a detecção de micróbios no LCR nem sempre indica uma infecção do SNC, uma vez que o comprometimento da barreira hematoencefálica pode permitir o trânsito de micróbios. No entanto, a detecção, identificação e quantificação de microrganismos no LCR são importantes no diagnóstico de meningite e outras infecções do SNC. Em particular, estudos recentes indicam possível envolvimento de microrganismos em doenças específicas do SNC, incluindo doença de Alzheimer e MS (3, 30, 45, 56). Portanto, a detecção de até mesmo alguns microrganismos no LCR por um protocolo padronizado é uma questão crítica para o diagnóstico de tais doenças. O adulto normal produz aproximadamente 500 ml de LCR por dia, com aproximadamente 150 ml de LCR no SNC em um determinado momento (34). Assim, a quantidade disponível de LCR e o número de amostras para diagnóstico são limitados. Portanto, a realização de PCR usando uma amostra de LCR se tornará o teste diagnóstico de primeira linha para infecções do SNC (11, 33), devido a uma sensibilidade que requer apenas uma quantidade limitada de LCR, a especificidade do ensaio e a velocidade. Na verdade, uma série de ensaios usando PCR para detecção de uma ampla gama de bactérias em amostras de LCR foram relatados (37, 38, 42, 66). No entanto, a sensibilidade e especificidade do ensaio de PCR para detecção de patógenos podem não ser melhores do que aquelas do ensaio de cultura, que foi padronizado e validado para a maioria dos patógenos, devido à confiabilidade da sensibilidade da PCR no processo de ensaio. Portanto, um resultado de PCR negativo pode ser usado com confiança moderada para descartar o diagnóstico de infecção (33).

A estabilidade do DNA bacteriano alvo durante o armazenamento do LCR é uma questão prática importante em laboratórios clínicos. No entanto, apenas informações limitadas sobre os efeitos de várias condições de manuseio e armazenamento sobre a estabilidade do DNA bacteriano no LCR estão disponíveis. A exposição do LCR a várias condições ambientais, como temperatura ambiente versus 4 & # x000b0C por até 96 h e congelamento-descongelamento até três vezes, não afeta a capacidade de um ensaio de PCR altamente sensível para detectar DNA bacteriano em amostras de LCR (60 ) Esse relatório, no entanto, testou apenas condições ambientais limitadas. Portanto, o armazenamento e o manuseio adequados do LCR ainda são essenciais para a detecção de micróbios após a amplificação por PCR.

Contaminação.

Uma vez que a PCR é baseada na amplificação de DNA, resultados falso-positivos ou negativos podem ocorrer facilmente. Em particular, um único ciclo de PCR resulta em um grande número de moléculas amplificáveis ​​que podem potencialmente contaminar amplificações subsequentes da mesma sequência alvo (39). Na verdade, uma fonte primária de reações falso-positivas foi identificada como transporte de produto amplificado de reações anteriores (41). A contaminação de reagentes, dispositivos de pipetagem, superfícies de laboratório ou mesmo a pele dos trabalhadores (35) pode gerar resultados falso-positivos. Para controlar essa contaminação transportada, deve-se prevenir a transferência física de DNA entre amostras amplificadas e entre controles experimentais positivos e negativos. Para tanto, a preparação das amostras para ensaio de PCR deve ser realizada em sala ou capela de biossegurança separada daquela em que são realizadas as reações. Usar uma ponta de pipeta com barreira de aerossol é essencial para evitar contaminação cruzada e contaminação residual. A exposição aos raios ultravioleta também é capaz de destruir amplicons contaminantes, mas é eficiente apenas em superfícies e com amplicons maiores que 300 bp (19). Usando uracil N-glicosilase (UNG) para clivar o dUTP incorporado em produtos de PCR é considerado um protocolo poderoso para evitar a contaminação do amplicon de transporte enzimaticamente (41), particularmente em um laboratório clínico que está realizando PCR extensivamente. Isso é realizado substituindo dUTP por dTTP e adicionando UNG à mistura mestre. Para proteger o produto contendo dUTP, UNG deve ser inativado quimicamente ou por calor antes que o produto de PCR possa ser analisado posteriormente. Portanto, o protocolo dUTP requer apenas duas mudanças em um protocolo de PCR padrão: a substituição de dUTP por dTTP em todas as reações e a incubação de todas as misturas de PCR com UNG antes do ciclo de temperatura. Na verdade, este protocolo foi aplicado com sucesso para a detecção de Toxoplasma gondii no LCR, bem como em outras amostras clínicas (46).

Extração de DNA.

Uma vez que as amostras clínicas têm inibidores de PCR, como a hemina, que se liga a Taq polimerase e inibe sua atividade (10), a purificação do DNA é importante para evitar tais efeitos. Na verdade, os inibidores são detectados com frequência em amostras de LCR (14), e a fervura do LCR não é suficiente para a remoção dos inibidores que afetam a detecção de micróbios por PCR (9). O rendimento da extração do DNA alvo também é um fator crítico na detecção de bactérias por PCR em amostras clínicas, particularmente quando se espera que apenas algumas bactérias estejam nas amostras. Como as bactérias têm uma parede celular rígida, que pode resistir a um protocolo de digestão comum para extração de DNA, o protocolo de extração de DNA bacteriano em amostras clínicas deve ser uma consideração adicional para a preparação da amostra.

O protocolo clássico de extração de DNA é baseado na purificação com solventes orgânicos como fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. Os precipitados obtidos do LCR contendo apenas algumas bactérias podem conter muito pouco material e podem não ser visíveis. Portanto, o manuseio desses precipitados pode exigir suposições, particularmente durante a lavagem dos precipitados. Assim, parece provável que o rendimento resultante de DNA bacteriano do LCR com apenas algumas bactérias pode não ser consistente. Nesse sentido, um estudo recente desenvolveu um novo protocolo de purificação de DNA por meio de carreadores de fase sólida, que absorvem seletivamente os ácidos nucléicos (7). Este protocolo é baseado na natureza dos ácidos nucléicos, que podem se ligar a partículas de sílica ou vidro na presença de agentes caotrópicos, como NaI ou NaClO4 (44, 62, 65). Uma purificação de DNA de filtro de fibra de vidro de extração caotrópica (GFX Pharmacia Biotech, Milwaukee, Wis.) É um protocolo desse tipo e utiliza uma matriz de fibra de vidro para isolamento de DNA.Um kit de isolamento de DNA baseado no método de esferas de isotiocianato de guanidínio-sílica (7) também está disponível comercialmente (kit de isolamento NucliSens Organon Teknika, Durham, N.C.). O kit de isolamento NucliSens resulta em rendimento de DNA suficiente e um PCR altamente reprodutível para & # x003b2-globina em células fixas (16). No entanto, não há relato sobre a aplicação de tais kits para o isolamento de DNA bacteriano de amostras clínicas. Fahle e Fischer (22) examinaram a eficácia do isolamento de DNA viral de amostras clínicas, incluindo LCR, usando seis kits comerciais diferentes de extração de DNA. Concluiu-se no relatório que o kit de isolamento NucliSens e o kit de isolamento de DNA Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minn.) Foram os mais sensíveis entre os kits testados, incluindo o kit de coluna de captura Generation (Gentra Systems), MasterPure Kit de purificação de DNA (Epicenter Technologies, Madison, Wis.), Kit de extração de ácido nucleico IsoQuick (MicroProbe Corp., Bothell, Wash.) E kit de sangue QIAamp (Qiagen, Valencia, Calf.), Para extrair DNA de citomegalovírus de amostras clínicas, com base na recuperação de DNA com a ampla gama de tipos de espécimes avaliados. Avaliações semelhantes de extrações de DNA com kits comerciais também foram realizadas por três outros grupos (13, 36, 61). A partir desses estudos, o kit QIAamp foi considerado mais adequado do que outros métodos comerciais e não comerciais avaliados para a extração de DNA para PCR. Alguns kits de extração e purificação disponíveis comercialmente com base em um protocolo de purificação de fase sólida estão listados na Tabela & # x200B Tabela1. 1 Esses kits eliminam não apenas suposições, mas também etapas de extração de fenol-clorofórmio trabalhosas. No entanto, há apenas informações limitadas sobre o isolamento de DNA bacteriano de amostras clínicas, particularmente LCR, com esses kits comerciais.

TABELA 1.

Kits comerciais de extração de DNA com base no protocolo de purificação de fase sólida

KitFornecedorMétodo
Kit de coluna de captura de geraçãoSistemas GentraColuna não baseada em sílica
Kit de isolamento NucliSensOrganon TeknikaPartículas de sílica
QIAmp DNA Mini KitQiagenColuna de membrana baseada em sílica
Kit de centrifugação de sangue UltraCleanLaboratórios MoBioMembrana à base de sílica
Kit de DNA genômico de sangue MagPrepNovagenPartículas magnéticas de sílica
SNAP kit de DNA de sangue totalInvitrogenColuna de membrana à base de sílica
Kit de purificação de DNA de sangue genômico GFXAmershamMatriz de fibra de vidro

Genes alvo.

A escolha de genes-alvo e o projeto de iniciadores oligonucleotídicos são elementos críticos na determinação da sensibilidade da PCR (29, 53). Mesmo quando o mesmo gene é selecionado como alvo, a PCR com diferentes conjuntos de primers mostra uma diferença de sensibilidade de 100 a 1.000 vezes entre os conjuntos de primers (29). Portanto, a sequência de primers é importante na sensibilidade e especificidade da PCR. A sensibilidade da PCR também depende do gene alvo selecionado, porque o número de cópias de genes ou operons por bactéria variam. A este respeito, se apenas a sensibilidade da PCR for considerada, a transcrição reversa-PCR é outro método de seleção devido ao número de cópias múltiplas de mRNAs por bactéria. No entanto, o valor prático da transcrição reversa-PCR no diagnóstico é limitado devido ao curto período de vida e à vulnerabilidade dos mRNAs bacterianos.

O polimorfismo de sequência de um gene alvo é outra preocupação em relação à especificidade da PCR. Alguns genes bacterianos, como o C. trachomatis gene da proteína da membrana externa, têm regiões hipervariáveis ​​dentro do gene (23). Portanto, produtos de PCR de tamanhos diferentes, bem como sequências diferentes, podem ocorrer entre isolados clínicos da bactéria quando tal gene é selecionado como um alvo para PCR.

Um PCR universal que amplifica regiões conservadas em várias bactérias é ideal para detectar qualquer patógeno na triagem de amostras clínicas (8, 40, 42, 49, 63). Para tanto, a região conservada do gene 16S rRNA foi selecionada como gene alvo para a PCR universal devido ao fato de quase todos os patógenos bacterianos comuns encontrados em fluidos corporais terem sido sequenciados (27, 42, 49). Utilizando este PCR universal, uma alta sensibilidade de detecção de PCR para bactérias 10 gram-negativas e 250 gram-positivas no LCR foi relatada (42). No entanto, uma vez que o PCR universal pode detectar quase todas as bactérias, incluindo a flora normal, como estafilococos na pele, a discriminação de contaminantes é difícil, especialmente quando as amostras contêm poucas bactérias.

Protocolos de PCR.

Existem vários protocolos de PCR para aumentar a sensibilidade, especialmente ao lidar com um pequeno número de bactérias como alvo. Nested PCR é um desses protocolos para detecção de apenas algumas bactérias em amostras clínicas. O processo utiliza dois PCRs consecutivos. O primeiro PCR contém um par externo de primers, enquanto o segundo contém dois primers aninhados que são internos ao primeiro par de primers ou um dos primeiros primers e um único primer aninhado. O fragmento maior produzido pela primeira reação é usado como molde para o segundo PCR. A sensibilidade e a especificidade da amplificação de DNA podem ser consideravelmente melhoradas usando o PCR interno, às vezes com 1.000 vezes mais sensibilidade do que um PCR padrão. No entanto, no caso de detecção de C. pneumoniae por nested PCR em uma solução padrão enriquecida com bactérias, a sensibilidade nem sempre foi melhorada em comparação com a de uma única PCR padrão. Por exemplo, PCRs aninhados e únicos com primers específicos para o C. pneumoniae omp-1 gene apresentou a mesma sensibilidade (0,005 inclusão ou 2,5 corpos elementares por PCR) (2).

Um problema freqüentemente encontrado na amplificação por PCR de sequências de genes alvo é o aparecimento de bandas menores espúrias no espectro do produto (17). Isso geralmente é interpretado como sendo devido a um malpriming por um ou ambos os amplímeros de oligonucleotídeo para o modelo alvo. O Touchdown PCR é projetado para evitar tais problemas e fornece uma banda de PCR claramente específica. O touchdown PCR utiliza um protocolo com temperaturas de anelamento decrescentes em cada ciclo de cima para abaixo da temperatura de anelamento esperada (17). A aplicação desta técnica para detecção de C. pneumoniae forneceu uma sensibilidade analítica melhorada (0,004 a 0,063 unidades formadoras de inclusão por PCR) (43).

Detecção de produtos de PCR.

Existem vários protocolos de detecção diferentes relatados para produtos de PCR, além do método de eletroforese tradicional em um gel de agarose contendo brometo de etídio. A hibridização Southern com uma sonda específica marcada com um radioisótopo ou marcador não radioisotópico para amplicons de PCR tem sido amplamente utilizada para o estudo da especificidade da PCR. Este protocolo de detecção também fornece uma sensibilidade mais alta do que o método de detecção de brometo de etídio, mas requer etapas extras de blotting e hibridização. O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) digoxigenina (DIG) -PCR é um dos métodos de detecção de amplicon de PCR que utiliza uma placa de microtitulação e está agora disponível comercialmente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.). Este método envolve a captura de amplicons marcados com DIG pela sonda imobilizada na superfície de uma placa de ELISA revestida com estreptavidina. O híbrido ligado é detectado com um conjugado anti-DIG-peroxidase e o substrato colorimétrico. Este sistema ELISA demonstrou ser 10 a 100 vezes mais sensível do que o método tradicional de eletroforese (48). O método de detecção de imunoensaio PCR utilizando um pequeno dispositivo especial (Clearview Immunoassay Detection Device Oxoid Inc., Ogdensburg, NY), que contém uma membrana e uma almofada de aplicação de amostra contendo grânulos de látex marcados com um anticorpo anti-2,4-dinitrofenol, é outro tipo de método de detecção para amplicons projetado para detectar bactérias específicas em isolados clínicos (12, 59). A membrana utilizada neste sistema é revestida com linhas de anticorpo antibiotina e anticorpo anti-DIG. Portanto, uma avaliação dos resultados da PCR como positivos ou negativos, utilizando este kit de detecção em laboratórios clínicos que não possuem equipamento de eletroforese, é relativamente fácil. A aplicação deste kit para detecção de Neisseria meningitidis no LCR mostrou um limite de detecção de um a três organismos por PCR, que é 10 vezes mais sensível do que a detecção de produtos de PCR na eletroforese tradicional com géis de agarose (54). Os ensaios baseados em sonda fluorescente com primers marcados ou sondas específicas marcadas com um corante fluorescente foram desenvolvidos com as vantagens de um sistema fechado que evita contaminação durante a PCR e maior sensibilidade de detecção para amplicons. Existem dois tipos de ensaios, usando leituras em tempo real e de ponto final. Particularmente, a PCR em tempo real, que fornece informações rápidas e precisas sobre os genes-alvo, tem sido cada vez mais utilizada. Esta abordagem tem a vantagem de quantificar a PCR na fase exponencial em vez de usar o acúmulo de produto de PCR no ponto final ou tentar capturar a PCR na fase exponencial, como foi feito anteriormente em muitas PCRs quantitativas (52). Esta técnica não baseada em gel tem várias outras vantagens sobre as técnicas comuns à base de gel de agarose. Por exemplo, este sistema permite um grande aumento no rendimento. O ensaio de sonda fluorescente é executado em um formato de 96 poços, e muitas das etapas do ensaio são automatizadas. O ensaio é um sistema fechado no qual o tubo de reação nunca é aberto após a amplificação. Além disso, ele usa um sistema de detecção automatizado que quantifica e calcula o grau de fluorescência do controle em cada ciclo e, portanto, define com precisão o número do ciclo e a faixa linear para um resultado positivo (52). Embora atualmente existam poucos relatos sobre a detecção e quantificação de bactérias no LCR por PCR em tempo real, essa técnica tem excelente potencial como um importante protocolo para detecção de bactérias em amostras clínicas, incluindo LCR, devido a essas vantagens.


Discussão

Conforme previsto na hipótese e ilustrado nas Figs. & # X000a0 1, & # x200B, 2, 2, & # x200B, 3, 3, & # x200B, 4, 4, & # x200B, 5, 5, & # x200B , 6, 6 e & # x200B e 7, 7, o aparecimento de diferentes perfis de amplificação de PCR para diferentes isolados bacterianos (Fig. & # X000a0 3) ​​apóia a hipótese de que mais de um par de primer geral foi necessário para detectar todas as bactérias, a hipótese previu a deficiência de & # x0201cUniversal Primers & # x0201d. Os resultados mostraram que G4, G6, G8, G9 e G10 falharam com um ou mais isolados. A falha inevitável de pares de primers universais (ou pares de primers gerais) pode ser ainda prevista com base nas distribuições de primer. A Tabela & # x000a0 2 mostra que nenhum primer único poderia reagir com todos os 44 gêneros listados, o que significa que qualquer par de primer dado falhará pelo menos uma vez ( 2,2%). O par de primer & # x0201cUniversal & # x0201d 909F.R (Tabela & # x000a0 1) [17] falhará com 22 gêneros diferentes ou 50% daqueles listados na Tabela & # x000a0 2. Isso torna o par de primer 909 nem específico nem universal. O par de iniciadores QUGP-F3.R2 (que se mostrou útil neste estudo, Tabela & # x000a0 7) falhará com três gêneros que não possuem a sequência QUGP-R2 (Aquifex, Rickettsia, Thermotoga Tabela & # x000a0 2) e irá falhar com nove gêneros que não possuem QUGP-F3 (Anabaena, Aquifiex, Bordetella, Campylobacter, Chlamedophila1, Desulfovibrio, Mycoplasma, Prochlorococcus, e Thermotoga) Ao aplicar este par de iniciadores de PCR aos 44 gêneros listados na Tabela & # x000a0 2, o par de iniciadores falhará com dez gêneros, permitindo a detecção de apenas 34 gêneros (72%). Da mesma forma, o par de primer QUGP-F5.R4 detectará 84% dos gêneros listados QUGP-F5 falhará com dois gêneros (Clamidófila1,Rodopirélula Tabela & # x000a0 2) enquanto QUGP-R4 irá falhar com Clamidófila1 e cinco gêneros adicionais (Mycoplasma, Syntrophobacter, Thermus, Treponema e Wolbachia) Consequentemente, QUGP-F5.R4 detectará apenas 37 (84%) gêneros daqueles listados na Tabela & # x000a0 2. Matematicamente, os dois pares QUGP-F3.R2 e QUGP-F5.R4 irão detectar (95,4%) todos os 44, exceto (Clamidófila1 e Mycoplasma) No entanto, misturar os dois pares terá a vantagem adicional de gerar um novo par (QUGP-F5.R2) que detectará Mycoplasma mas não Clamidófila1. Portanto, a mistura dos quatro primers resultará na detecção de 43 gêneros (97,8%). Agora, está claro como o G7 com seus 10 pares de primers pode detectar bactérias. G7 detectará todos os 44 gêneros mostrados na Tabela & # x000a0 2, que pode ser uma amostra representativa de todas as bactérias. De acordo com o presente estudo, gêneros adicionais (não listados na Tabela & # x000a0 2) foram detectados por G7 (Acinetobacter, Alkaligenes, Serratia, Klebsiella e outros Tabela & # x000a0 7). Esses cálculos apóiam fortemente o potencial da abordagem UM sobre a abordagem & # x0201cUniversal Primer & # x0201d.

A etapa limitante na identificação de uma bactéria usando o UM reside na etapa de detecção (Etapa I). O UM resolveu essa limitação fornecendo uma série de misturas de primer (Tabela & # x000a0 5 A, B). De acordo com a UM, Golden Mixtures G7 e G5 podem produzir 12 pares de primers diferentes (ou amplicons de PCR). Pares de primer adicionais podem ser gerados pela incorporação de QUGP-F1 e QUGP-R7 em misturas Golden. A incorporação de QUGP-F1 gera 6 pares de primers adicionais (Tabela & # x000a0 6). Os 20 pares de primers possíveis mostrados na Tabela & # x000a0 6 são susceptíveis de detectar qualquer bactéria. G7 permitiu a formação de 10 pares de primers diferentes responsáveis ​​pelos amplicons observados na Fig. & # X000a0 6 a (QUGP-Fn3 nem pares com QUGP-Rn3 nem com QUGP-F4). Dois pares de primers adicionais (QUGP-Fn5.R4 e QUGP-Fn6.R4) podem ser gerados com G5. Portanto, a aplicação de G7 e G5 a qualquer bactéria aumentará as chances de detectar essa bactéria em 12 vezes em relação a qualquer par de primers de PCR único, ou em 20 vezes se todos os pares de primers da Tabela & # x000a0 6 forem usados.

A detecção de todos os 101 isolados bacterianos testados utilizando as diferentes misturas QUGP com falha zero apoia fortemente a capacidade do UM de detectar qualquer bactéria. As misturas douradas foram desenvolvidas por razões práticas e para simplificar o processo em relação à utilização de pares de primers únicos G7, a capacidade de produzir amplicons de PCR positivos com cada um dos (67/67) isolados bacterianos testados, atesta seu potencial para detectar a maioria, senão todas as bactérias.

Tanto o G7 quanto o G10 foram capazes de detectar DNA bacteriano quando diluído 10.000 vezes, o que implica que as amostras devem ser suficientemente diluídas quando houver suspeita de contaminação casual diluição de amostras de sangue contaminadas com Staphylococcus epidermidis ou outras bactérias podem ajudar a evitar a detecção de tais contaminantes, esta área precisa de uma extensa investigação antes que possa ser colocada em qualquer uso prático. G7 pode ser aplicado para testar a presença ou ausência de bactérias em uma variedade de amostras, incluindo amostras clínicas.

A aplicação de G7 é provavelmente mais adequada na análise de comunidades bacterianas, uma vez que se espera que amplifique a grande maioria, senão todas as espécies, dentro da amostra testada. Análise qualitativa de produtos de PCR mistos com técnicas disponíveis, como microarrays [12], C0t análise, clonagem e sequenciamento, RFLP, análise de eletroforese em gel de gradiente desnaturante [14, 39] ou qualquer combinação desses métodos irá melhorar nossa compreensão das comunidades bacterianas.

Um requisito crítico para o sequenciamento de DNA é que um primer de sequenciamento só deve se anelar a um único local no DNA molde. Portanto, as amostras contendo espécies mistas de DNA obtidas com os primers gerais não são adequadas para o sequenciamento direto de DNA. Outro obstáculo associado à ribotipagem baseada em sequenciamento é sua dependência da disponibilidade de sequências de rDNA para análise de alinhamento (BLAST). Por exemplo, a análise BLAST identificou o isolado QUBC35 como Citrobacter koseri (95,5%), também foi identificado como Citrobacter freundii (92,5%) ou C. youngae (7,4%) com o sistema API 20E, a indisponibilidade de algumas espécies para análise BLAST pode ter enviesado a identificação do isolado como C. koseri. Outro exemplo foi obtido quando a bactéria espiral QUBC70 foi sequenciada por PCR, mas foi mal identificada. Era 95% idêntico ao Phaeospirillum sp. muito provavelmente como resultado da ausência da sequência correspondente nas bases de dados de nucleotídeos. O isolado QUBC70 está sendo identificado por perfil bioquímico, a sequência obtida será depositada no banco de genes após a identificação da bactéria ser realizada e confirmada. Ter um banco de nucleotídeos / genes bacterianos completo (especialmente para sequências de nucleotídeos ribossomais) certamente melhorará a confiabilidade do UM e de quaisquer outros métodos baseados em sequência.

Isolados mostrando homologias BLAST inferiores a 98% não foram aceitos, a menos que verificados por outro método. Duas razões principais contribuíram para a má identificação, o sequenciamento deficiente e a ausência da sequência correspondente no banco de dados de nucleotídeos. Ameaças adicionais para a validade do UM vêm de fortes associações entre as espécies bacterianas, como no caso das bactérias parasitas (Bdellovibrio sp.), número de cópias do gene e polimorfismo.

Quando genes altamente conservados, como genes 16S, são usados ​​para identificação bacteriana, as sequências longas (& # x02265500 & # x000a0bases) podem fornecer poder discriminatório suficiente entre as bactérias do que as sequências mais curtas. Portanto, sequências & # x02265500 & # x000a0bases longas são preferíveis para identificação, embora sequências mais curtas específicas de espécies possam ser aplicadas [9, 20 & # x0201322, 24].

A validade do UM foi estabelecida todos os 40 amplicons de PCR sequenciados eram aqueles de 16S rDNA. A UM detectou e identificou 24 gêneros e 34 espécies. Essa ampla gama de detecção e identificação de espécies justifica a aplicação do método a qualquer outra bactéria. O UM foi ainda validado por estar de acordo com outros métodos de identificação, como API, perfis morfológicos e bioquímicos e primers de PCR específicos para espécies. A reprodutibilidade dos resultados obtidos pela UM atesta a sua estabilidade na detecção de todos Enterococcus faecalis isolados (QUBC80,81 e 83). A capacidade da UM de discriminar entre Streptomyces spp. QUBC50, 102, 103, 104 e 106 também foram ilustrados. A repetição do sequenciamento e da análise BLAST com o mesmo isolado do QUBC70 revelou os mesmos resultados exatos.

Em conclusão, G7 juntamente com G5 podem representar uma verdadeira substituição aos primers universais como previsto na hipótese, essas duas misturas continham um total de 8 primers gerais (7 primers em G7 e 4 primers em G5). Potencialmente, eles podem detectar todas as bactérias, pois geram um total de 12 pares de primers. G7 e G5 podem ser utilizados para servir a uma série de outras aplicações, como a detecção da presença de bactérias em amostras, análises de comunidades bacterianas e identificação bacteriana.


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