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Como um RT-PCR é representativo do conteúdo de RNA em uma célula?

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Por exemplo, primeiro coletamos todo o conteúdo de RNA de uma linha de células de mamíferos. Digamos, por exemplo, que coletamos 80 uL de RNA com uma concentração de 150 ng / uL. Em seguida, para fazer o cDNA, pegamos 1.000 ng do RNA. No entanto, esses 1.000 ng são uma amostra completamente aleatória do RNA total que tínhamos. Como essa amostra aleatória de RNA é representativa do conteúdo de RNA originalmente em nossas células?


Não está exatamente claro o que o questionador está perguntando, mas ...

… Uma maneira de pensar sobre isso é perguntar qual a probabilidade de um RNA de baixa abundância estar ausente da amostra retirada da preparação do RNA. Isso tornaria a amostra não representativa no nível qualitativo.

A questão afirma que 12.000 ng de RNA estão isolados. Uma vez que nada mais é especificado, presumo que este seja o RNA total. Uma estimativa aproximada do RNA total por célula eucariótica é de 20 pg.

Isso significa que a preparação veio de 6 x 105 células. (Estou assumindo um rendimento de 100%, mas isso realmente não afetará a conclusão.)

Agora suponha que um mRNA de baixa abundância esteja presente em 10 cópias por célula. A preparação de RNA total, portanto, contém 6 x 106 cópias desse mRNA de baixa abundância.

Tiramos uma amostra de 1.000 ng do total de 12.000 ng. Em outras palavras, tomamos 1/12 da preparação do RNA. Se essa preparação de RNA contém 106 cópias do mRNA de baixa abundância, qual é a probabilidade de pegarmos uma amostra que não contém cópias desse mRNA de baixa abundância? Aqui minha matemática me falha, mas intuitivamente digo que a probabilidade é muito muito pequeno.

Agora, se houver 1.000 diferentes mRNAs de baixa abundância na célula, a probabilidade de perder cada um deles é muito muito pequeno, mas a probabilidade geral de perder um deles é 1000 x muito muito pequeno, então talvez muito pequeno.

Vou continuar pensando em como calcular o valor de muito muito pequeno, mas se alguém quiser ajudar - obrigado desde já!


Quais são as diferenças entre PCR, RT-PCR, qPCR e RT-qPCR?


A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular relativamente simples e amplamente utilizada para amplificar e detectar sequências de DNA e RNA. Em comparação com os métodos tradicionais de clonagem e amplificação de DNA, que geralmente podem levar dias, a PCR requer apenas algumas horas. O PCR é altamente sensível e requer um modelo mínimo para detecção e amplificação de sequências específicas. Os métodos básicos de PCR avançaram ainda mais a partir da simples detecção de DNA e RNA. Abaixo, fornecemos uma visão geral dos diferentes métodos de PCR e os reagentes que fornecemos na Enzo Life Sciences para suas necessidades de pesquisa. Nosso objetivo é ajudar os cientistas a acessar rapidamente os reagentes de PCR para usar em seu próximo projeto de pesquisa!

Para PCR padrão, tudo o que você precisa é uma DNA polimerase, magnésio, nucleotídeos, primers, o modelo de DNA a ser amplificado e um termociclador. O mecanismo de PCR é tão simples quanto seu propósito: 1) DNA de fita dupla (dsDNA) é desnaturado por calor, 2) os primers se alinham às fitas simples de DNA e 3) os primers são estendidos pela DNA polimerase, resultando em duas cópias do original Faixa de DNA. O processo de desnaturação, recozimento e alongamento em uma série de temperaturas e tempos é conhecido como um ciclo de amplificação. Cada etapa do ciclo deve ser otimizada para o modelo e conjunto de primer usados. Este ciclo é repetido aproximadamente 20-40 vezes e o produto amplificado pode então ser analisado. O PCR é amplamente utilizado para amplificar DNA para uso experimental subsequente. A PCR também tem aplicações em testes genéticos ou para detecção de DNA patogênico.

Como a PCR é um método altamente sensível e volumes muito pequenos são necessários para reações únicas, a preparação de uma master mix para várias reações é recomendada. A master mix deve ser bem misturada e então dividida pelo número de reações, garantindo que cada reação contenha a mesma quantidade de enzima, dNTPs e primers. Muitos fornecedores, como a Enzo Life Sciences, também oferecem misturas de PCR que já contêm tudo, exceto primers e o modelo de DNA.

As regiões ricas em guanina / citosina (ricas em GC) representam um desafio nas técnicas de PCR padrão. As sequências ricas em GC são mais estáveis ​​do que as sequências com menor conteúdo de GC. Além disso, as sequências ricas em GC tendem a formar estruturas secundárias, como loops em gancho. Como resultado, as fitas duplas ricas em GC são difíceis de separar completamente durante a fase de desnaturação. Consequentemente, a DNA polimerase não pode sintetizar a nova fita sem impedimento. Uma temperatura de desnaturação mais alta pode melhorar isso e os ajustes em direção a uma temperatura de recozimento mais alta e um tempo de recozimento mais curto podem evitar a ligação inespecífica de primers ricos em GC. Reagentes adicionais podem melhorar a amplificação de sequências ricas em GC. DMSO, glicerol e betaína ajudam a romper as estruturas secundárias que são causadas pelas interações de GC e, portanto, facilitam a separação das fitas duplas.


RT-PCR e síntese de cDNA de amp

A síntese de DNA a partir de um molde de RNA, via transcrição reversa, produz DNA complementar (cDNA). As transcriptases reversas (RTs) usam um modelo de RNA e um primer complementar à extremidade 3 & prime do RNA para direcionar a síntese da primeira fita de cDNA, que pode ser usada diretamente como um modelo para a reação em cadeia da polimerase (PCR). Esta combinação de transcrição reversa e PCR (RT-PCR) permite a detecção de RNAs de baixa abundância em uma amostra e a produção do cDNA correspondente, facilitando assim a clonagem de genes de baixa cópia. Alternativamente, o cDNA de primeira fita pode ser feito de fita dupla usando DNA Polimerase I e DNA Ligase. Estes produtos de reação podem ser usados ​​para clonagem direta sem amplificação. Neste caso, a atividade de RNase H, tanto da RT quanto fornecida exogenamente, é necessária.

Muitos RTs estão disponíveis em fornecedores comerciais. A transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV) e a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV) são RTs comumente usados ​​em fluxos de trabalho de biologia molecular. ProtoScript & reg II Reverse Transcriptase é uma transcriptase reversa M-MuLV recombinante com atividade RNase H reduzida e termoestabilidade aumentada. Pode ser usado para sintetizar a primeira cadeia de cDNA a temperaturas mais elevadas do que o M-MuLV de tipo selvagem. A enzima é ativa até 50 & degC, proporcionando maior especificidade, maior rendimento de cDNA e mais produto de cDNA de comprimento total, de até 12 kb de comprimento.

O uso de RTs projetados melhora a eficiência da formação de produto de comprimento total, garantindo que a cópia da extremidade 5 & prime do transcrito de mRNA seja completa e permitindo a propagação e caracterização de uma cópia fiel de DNA de uma sequência de RNA. O uso de RTs mais termoestáveis, onde as reações são realizadas em temperaturas mais altas, pode ser útil para a transcrição reversa de RNA que contém estrutura secundária.

Para obter ajuda na comparação dos reagentes de síntese de RTs e cDNA disponíveis, consulte nosso gráfico de seleção de síntese de RT / cDNA.

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Este produto destina-se apenas a fins de pesquisa. Este produto não se destina a ser usado para fins terapêuticos ou de diagnóstico em humanos ou animais.


Visão geral de qPCR e RT-qPCR

A PCR quantitativa, envolvendo uma etapa de transcrição reversa ou não, é rotineiramente usada em laboratórios de biologia molecular e revolucionou a forma como a pesquisa é realizada devido ao seu pipeline relativamente simples (Figura 2). Suas vantagens em relação ao PCR padrão incluem a capacidade de visualizar quais reações funcionaram em tempo real e sem a necessidade de um gel de agarose. Também permite uma análise verdadeiramente quantitativa. Um dos usos mais comuns de qPCR é determinar o número de cópias de uma sequência de DNA de interesse. Usando a quantificação absoluta, o usuário é capaz de determinar os números de cópias alvo em referência a uma curva padrão de concentração definida de uma maneira muito mais precisa do que nunca. RT-qPCR, por outro lado, permite a investigação de alterações de expressão gênica após o tratamento de sistemas modelo com inibidores, estimulantes, pequenos RNAs interferentes (siRNAs) ou modelos de nocaute, etc. Esta técnica também é usada rotineiramente para detectar mudanças na expressão de ambos antes (como controle de qualidade) e após (confirmação da mudança) experimentos de RNA-Seq.

Fluxo de trabalho de um experimento qPCR e RT-qPCR padrão. Após o isolamento da amostra, a integridade é analisada antes da geração de cDNA e início do ensaio de qPCR usando corantes intercalantes ou sondas de hidrólise. A fluorescência é detectada ao longo dos ciclos de PCR e usada para gerar uma curva de amplificação que é usada para quantificar a amostra alvo durante a análise de dados.

Preparação de amostra

A etapa mais crucial no pipeline qPCR e RT-qPCR é indiscutivelmente o isolamento da amostra. Não importa o quão bom seja o design do seu ensaio, se o material inicial estiver contaminado ou degradado, você não obterá resultados precisos. Uma amostra de boa qualidade é o bloco inicial de dados de boa qualidade. Ao isolar o DNA para qPCR, é essencial que ele esteja livre de contaminantes que possam inibir a reação. Na maioria das vezes, a extração é realizada por meio de kits disponíveis no mercado, que apresentam a vantagem de serem fáceis de usar, simples e rápidos, principalmente quando integrados a um sistema robótico. O tipo de extração de RNA realizada depende do tipo de RNA necessário. O método de extração mais comum usado é com kits de extração de RNA total. Isso isola o RNA mensageiro (mRNA o precursor da síntese de proteínas), o RNA de transferência (o tRNA decodifica o mRNA durante a tradução com o ribossomo) e o RNA ribossômico (o rRNA lê a ordem dos aminoácidos durante a tradução e os liga ao ribossomo), mas frequentemente (nem sempre ) falha em isolar RNAs menores, como RNA não codificante (RNA funcional ncRNA transcrito do DNA, mas não traduzido em proteínas) e micro RNAs (miRNAs regulam a expressão gênica inibindo a tradução do mRNA). Com a explosão de interesse em RNAs potenciadores (eRNAs pequenos RNAs transcritos de potenciadores) que podem variar consideravelmente em comprimento, é essencial que os métodos de extração sejam cuidadosamente considerados para garantir o isolamento do RNA de interesse. Além das considerações de extração, é essencial que o RNA não esteja contaminado com DNA, uma vez que não pode ser distinguido do cDNA na reação qPCR. Para superar isso, a maioria dos protocolos depende do uso de um tratamento com DNase I, que digere qualquer DNA.

Durante o isolamento, a degradação da amostra é sempre uma possibilidade. Por conseguinte, qualquer bom pipeline envolverá uma etapa de controle de qualidade para avaliar a integridade da amostra. Isso pode ser feito rapidamente avaliando a razão A260 / 280 (comparando a absorbância em 260 vs 280 nm, uma medida de contaminação por proteínas) e a razão A260 / 230 (260 vs 230 nm, uma indicação da presença de contaminantes orgânicos) da amostra, no entanto, isso não é muito preciso e está sujeito à interferência de vários fatores. Uma medida mais precisa é o uso de um sistema de eletroforese em gel virtual, como o Aligent Bioanalyser. Esse sistema funciona por meio de um chip que separa o RNA com base no tamanho e detecta o RNA por meio de corantes fluorescentes. Isso é então traduzido para um computador que, usando um algoritmo, produz um número de integridade de RNA (RIN) que representa a qualidade da amostra, sendo 10 o mais alto.

A etapa final na preparação da amostra para RT-qPCR é a geração de cDNA. O cDNA utiliza RT-PCR (Figura 1) para gerar cDNA a partir do modelo de RNA usando uma transcriptase reversa. Isso pode ser feito empregando oligo (dT) primers, que se anelam à cauda poliA do RNA, ou usando hexâmeros aleatórios (primers de seis a nove bases de comprimento, que se anelam em vários pontos ao longo do RNA transcrito). Geralmente, uma mistura dos dois primers é considerada a melhor, pois permite a amplificação do RNA da cauda poliA (principalmente mRNA) e RNA não contendo poliA (tRNA, rRNA, etc.). Além da consideração do primer, a geração de cDNA pode fazer parte do experimento qPCR (denominado RT-qPCR de uma etapa) ou é gerada separadamente do qPCR (RT-qPCR de duas etapas), conforme mostrado na Figura 3. A vantagem de RT-qPCR de uma etapa é que há menos variação experimental e menos riscos de contaminação, além de permitir a triagem de alto rendimento, portanto, esta opção é geralmente usada para triagem clínica. No entanto, isso significa que a amostra só pode ser usada um número limitado de vezes, enquanto RT-qPCR de duas etapas permite mais reações por amostra e opções de priming flexíveis e é geralmente a opção preferida para análise de expressão gênica em larga escala, mas permite requerem mais otimização.


Eosinófilos humanos e de camundongo têm atividade antiviral contra o vírus da parainfluenza

Os vírus respiratórios causam exacerbações da asma. Como os eosinófilos são os leucócitos proeminentes nas vias aéreas de 60–70% dos pacientes com asma, avaliamos os efeitos dos eosinófilos em um vírus respiratório comum, parainfluenza 1, no pulmão. Os eosinófilos recrutados para as vias aéreas de camundongos do tipo selvagem após a sensibilização com ovalbumina e o desafio diminuíram significativamente o RNA do vírus da parainfluenza nos pulmões 4 dias após a infecção em comparação com animais não sensibilizados. Este efeito antiviral também foi observado em camundongos transgênicos IL-5 com uma abundância de eosinófilos das vias aéreas (NJ.1726), mas foi perdido em camundongos deficientes em eosinófilos transgênicos (PHIL) e em camundongos transgênicos IL-5 cruzados com camundongos deficientes em eosinófilos (NJ .1726-PHIL). A perda da proteína do grânulo de eosinófilos eosinófilos peroxidase, usando camundongos transgênicos deficientes em eosinófilos peroxidase, não reduziu o efeito antiviral dos eosinófilos. Mecanismos antivirais de eosinófilos também foram explorados em vitro. Os eosinófilos humanos isolados reduziram significativamente os títulos do vírus parainfluenza. Este efeito não envolveu a degradação do RNA viral por RNases de grânulos de eosinófilos. No entanto, os eosinófilos tratados com um inibidor da óxido nítrico sintase perderam sua atividade antiviral, sugerindo que os eosinófilos atenuam a infectividade viral através da produção de óxido nítrico. Consequentemente, a produção de óxido nítrico de eosinófilos foi medida com uma sonda fluorescente intracelular. Os eosinófilos produziram óxido nítrico em resposta ao vírus e a um agonista sintético do receptor imune inato sensível ao vírus, receptor Toll-like (TLR) 7. O IFNγ aumentou a expressão do eosinófilo TLR7 e potencializou a produção de óxido nítrico induzida por TLR7. Esses resultados sugerem que os eosinófilos promovem a depuração viral no pulmão e contribuem para as respostas imunes inatas contra infecções respiratórias por vírus em humanos.

Os eosinófilos humanos e de camundongo são antivirais contra o vírus parainfluenza por meio da produção de óxido nítrico e servindo como um hospedeiro sem saída para a infecção por vírus, mas não por meio da produção de RNases de grânulos de eosinófilos ou peroxidase de eosinófilos. Os eosinófilos podem ter um papel antiviral subestimado nas infecções do trato respiratório em humanos.

Os eosinófilos são encontrados infiltrando as vias aéreas de aproximadamente dois terços dos pacientes com asma (1) e foram associados experimentalmente à hiper-reatividade das vias aéreas (2) e à remodelação das vias aéreas (3). Compreensivelmente, isso levou à suposição de que os eosinófilos são apenas mal-adaptativos na asma e, portanto, muitos tratamentos para asma são projetados para reduzir a inflamação eosinofílica (4–7). Essa estratégia produziu resultados variáveis. Muitos pacientes com asma permanecem mal controlados apesar da terapia máxima (8). As exacerbações dos sintomas da asma continuam a causar morbidade significativa, gastos com saúde e morte (9, 10). Além disso, a prevenção e o tratamento para a causa mais comum de exacerbações da asma, as infecções respiratórias por vírus, são virtualmente inexistentes (11). Essas deficiências destacam nosso conhecimento limitado da biologia dos eosinófilos e estimularam estudos que tentam definir o papel dos eosinófilos durante as infecções por vírus respiratórios na asma. Por exemplo, camundongos transgênicos IL-5 com eosinófilos sistêmicos elevados tiveram títulos mais baixos de vírus sincicial respiratório (RSV) em comparação com camundongos do tipo selvagem (12), enquanto camundongos transgênicos IL-5 com eosinofilia das vias aéreas tiveram títulos mais baixos de vírus da pneumonia em camundongos comparados com controles (13). Da mesma forma, descobrimos que os eosinófilos recrutados para as vias aéreas após a sensibilização com ovalbumina foram associados a menos vírus parainfluenza 1 nos pulmões de cobaias, embora esses experimentos não tenham sido planejados para estabelecer um papel causal para os eosinófilos (14). Coletivamente, esses estudos sugerem que os eosinófilos contribuem para a imunidade antiviral nos pulmões.

Os eosinófilos detectam vírus invasores por meio de vários mecanismos, incluindo receptor Toll-like (TLR) - interações ligando (15). O TLR7 se liga ao RNA de fita simples que é um motivo genômico comum para muitos vírus respiratórios (16). A ligação de TLR7 desencadeia a resposta primária de diferenciação mieloide 88 (MyD88) sinalização dependente de proteína adaptadora que promove uma resposta antiviral de eosinófilos (12). No entanto, os mediadores responsáveis ​​pela atividade antiviral dos eosinófilos estão em debate. Os eosinófilos liberam uma variedade de proteínas granulares após a ativação que podem ser antivirais. A proteína catiônica eosinófila e a neurotoxina derivada de eosinófilos são membros da superfamília RNase A e são propostos como tendo um efeito virucida pela degradação de genomas de RNA virais (13, 17, 18). A peroxidase de eosinófilos também é liberada dos grânulos de eosinófilos e contribui para a geração de espécies reativas de oxigênio aos antimicrobianos (19). Se os eosinófilos têm como alvo todos os vírus com essas proteínas ou por meio de mecanismos exclusivos, é necessário um estudo mais aprofundado.

O vírus parainfluenza é um dos vários vírus conhecidos por causar exacerbações da asma (20). A parainfluenza é detectada nas vias aéreas em até 18% dos adultos durante as exacerbações agudas da asma (21). Sua prevalência é semelhante à da influenza e do coronavírus, e significativamente maior do que o VSR em adultos. Dado que uma estimativa de 16 milhões de consultas de cuidados agudos para exacerbações de asma ocorrem anualmente (22), as exacerbações induzidas por parainfluenza representam uma carga considerável de doença, mas a interação entre o vírus parainfluenza e os eosinófilos não está claramente definida.

Neste estudo, investigamos a hipótese de que os eosinófilos inibem a infecção do vírus parainfluenza nos pulmões. Os experimentos aqui descritos avaliaram o efeito dos eosinófilos na depuração do vírus parainfluenza na Vivo e avaliou o papel de potenciais mediadores antivirais. Também examinamos os efeitos do IFNγ nas respostas antivirais dos eosinófilos como um mecanismo potencial para aumentar a atividade antiviral mediada pelos eosinófilos.

Camundongos que expressam IL-5 no epitélio das vias aéreas (NJ.1726) (23), camundongos deficientes em eosinófilos (PHIL) (24) e camundongos deficientes em peroxidase eosinófila (25) foram mantidos por retrocruzamento em um fundo C57BL / 6. Os animais foram tratados de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal dos EUA. Os protocolos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Oregon Health & amp Science University (Portland, OR) e da Mayo Clinic (Scottsdale, AZ).

O vírus parainfluenza (vírus Sendai ATCC, Manassas, VA) foi cultivado em monocamadas de células de rim de macaco rhesus (RMK), purificado por centrifugação de densidade de sacarose e titulado em células RMK (26) (Vejo os materiais e métodos online). Os títulos foram expressos como múltiplos da dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID50 quantidade de vírus necessária para infectar 50% das monocamadas de RMK).

Camundongos fêmeas com idade de 6–8 semanas foram sensibilizados por injeção intraperitoneal com 0,04 μg e 0,2 μg de ovalbumina (Sigma, St. Louis, MO) com alúmen nos Dias 1 e 14, respectivamente. Nos dias 24, 26 e 28, os camundongos foram anestesiados com cetamina (45 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg) e desafiados com ovalbumina intratraqueal a 2%. Os camundongos foram infectados com parainfluenza (2,8 × 10 4 TCID50 Unidades) por via intranasal no Dia 27. No Dia 31, os pulmões foram lavados e homogeneizados (Vejo os materiais e métodos online).

O RNA da proteína da matriz parainfluenza em homogenatos de pulmão foi amplificado por RT-PCR em tempo real e normalizado para 18S. A expressão relativa de RNA foi convertida em replicações absolutas de RNA usando uma curva padrão de RNA de parainfluenza (Vejo os materiais e métodos online).

Os eosinófilos foram isolados com pureza superior a 99% e viabilidade superior a 99% do sangue de voluntários humanos saudáveis ​​por centrifugação de densidade usando Ficoll-Paque Plus (Sigma) e seleção negativa (Vejo os materiais e métodos online). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa. Os sujeitos forneceram consentimento informado por escrito.

Os eosinófilos humanos foram incubados durante a noite com ou sem IFNγ (300 U / ml). O meio foi removido e o parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) foi adicionado durante 2 horas. Algumas culturas foram pré-tratadas com inibidor de óxido nítrico sintase, cloridrato de éster metílico de Nω-Nitro-L-arginina ([l -NOME] 100 μM Sigma) 30 minutos antes da inoculação. A infecciosidade viral foi quantificada em células RMK por ensaio de hemadsorção. Os títulos infecciosos são expressos como TCID50 U / ml de sobrenadante de cultura.

Os eosinófilos humanos foram carregados com uma sonda fluorescente de detecção de óxido nítrico, (Strem, Newburyport, MA), e expostos a parainfluenza ou agonista TLR7 sintético, Vejo os materiais e métodos online. A fluorescência foi medida 60 minutos depois por leitor de placas.

Eosinófilos humanos foram inoculados com parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) por 2 horas, lavado para remover o vírus não ligado e mantido em meio fresco por 72 horas. O RNA viral em sobrenadantes de cultura foi quantificado a cada 24 horas por RT-PCR em tempo real (Vejo os materiais e métodos online).

A expressão de eosinófilos TLR7 foi avaliada por RT-PCR em tempo real e imunofluorescência (Vejo os materiais e métodos online).

Os dados foram comparados usando ANOVA unilateral com Bonferroni post hoc teste. Os dados são apresentados como média (± SEM). UMA P valor inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Camundongos C57BL / 6, sensibilizados e desafiados com ovalbumina, reduziram significativamente (em ~ 90%) o RNA do vírus parainfluenza nos pulmões 4 dias após a infecção em comparação com animais não sensibilizados (Figura 1A). A sensibilização e o desafio com ovalbumina causaram um aumento substancial de eosinófilos no fluido do lavado broncoalveolar, bem como macrófagos e neutrófilos (Figura 1B).

Figura 1. Sensibilização com ovalbumina e desafio aumentam a depuração da infecção pelo vírus parainfluenza nos pulmões na Vivo. (UMA) Camundongos C57BL / 6 foram sensibilizados (intraperitoneal, dias 1 e 14) e desafiados (intratraqueal, dias 24, 26 e 28) com ovalbumina e infectados com vírus parainfluenza (intranasal, dia 27). O RNA do vírus parainfluenza foi quantificado por RT-PCR em tempo real 4 dias após a infecção. Camundongos sensibilizados e desafiados reduziram significativamente o RNA de parainfluenza no pulmão em comparação com camundongos de controle infectados com parainfluenza não sensibilizados. (B) A sensibilização e o desafio com ovalbumina aumentaram o total de células inflamatórias, macrófagos (MΦ), eosinófilos (Eos) e neutrófilos (Neut) no fluido de lavagem broncoalveolar em comparação com controles não sensibilizados. Não houve diferenças nos linfócitos (linfa) entre os grupos (n = 5). *P & lt 0,05 em comparação com camundongos de controle infectados com parainfluenza não sensibilizados. Os dados são apresentados como médias (± SEM).

Camundongos NJ.1726 (↑ Eos ↑ IL-5) expressam constitutivamente IL-5 no epitélio pulmonar e têm elevado número de eosinófilos nos pulmões (23). Aos 4 dias após a infecção, o RNA de parainfluenza foi significativamente diminuído nos pulmões de camundongos NJ.1726 em comparação com controles de ninhada de tipo selvagem (Figura 2A). Camundongos transgênicos NJ.1726 IL-5 foram cruzados com camundongos PHIL (ØEos), que são congenitamente desprovidos de eosinófilos, para diferenciar o efeito de eosinófilos de IL-5. O conteúdo de RNA da parainfluenza nos pulmões de camundongos NJ.1726-PHIL deficientes em eosinófilos que expressam IL-5 (ØEos ↑ IL-5) foi semelhante ao de camundongos infectados de tipo selvagem, indicando que eosinófilos, não IL-5, eram mediadores o efeito antiviral. Da mesma forma, camundongos PHIL deficientes em eosinófilos por si só tinham níveis de RNA de parainfluenza comparáveis ​​aos camundongos infectados de tipo selvagem (Figura 2A). A lavagem broncoalveolar confirmou um aumento significativo de eosinófilos nas vias aéreas de camundongos NJ.1726 em comparação com controles de ninhada do tipo selvagem e uma ausência de eosinófilos em camundongos PHIL e NJ.1726-PHIL (Figura 2B). Não houve diferenças significativas nos leucócitos totais ou outros subconjuntos de células inflamatórias no lavado broncoalveolar entre os grupos (Figura 2C).

Figura 2. Os eosinófilos promovem a eliminação do vírus parainfluenza no pulmão murino na Vivo. Camundongos de controle de tipo selvagem (WT) (C57BL / 6), camundongos transgênicos com eosinófilos pulmonares elevados devido à superexpressão de IL-5 por um promotor específico do pulmão (NJ.1726 ↑ Eos ↑ IL-5), camundongos transgênicos com pulmão alto IL-5, mas desprovido de eosinófilos (NJ.1726-PHIL ØEos ↑ IL-5), e camundongos deficientes em eosinófilos (camundongos transgênicos PHIL ØEos) foram infectados com o vírus parainfluenza (intranasal). (UMA) O conteúdo de RNA da parainfluenza no pulmão foi quantificado por RT-PCR em tempo real 4 dias após a infecção. Os camundongos NJ.1726 (↑ Eos ↑ IL-5) reduziram significativamente o RNA de parainfluenza em comparação com os camundongos de controle (WT). Os camundongos NJ.1726-PHIL (ØEos ↑ IL-5) e os camundongos PHIL (ØEos) apresentaram níveis de RNA de parainfluenza comparáveis ​​ao WT. (B) A lavagem broncoalveolar de camundongos NJ.1726 infectados com parainfluenza (↑ Eos ↑ IL-5) continha significativamente mais eosinófilos em comparação com todos os outros grupos. Nenhum eosinófilo foi detectado no lavado broncoalveolar em camundongos PHIL (ØEos) ou NJ.1726-PHIL (ØEos ↑ IL-5). (C) Não houve diferenças em outros tipos de células inflamatórias entre os grupos (n = 7–10). *P & lt 0,05. Os dados são apresentados como médias (± SEM).

A peroxidase de eosinófilos é uma proteína granulada liberada pelos eosinófilos. Camundongos com deficiência de peroxidase de eosinófilos de tipo selvagem e transgênicos foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina e infectados com o vírus parainfluenza. O RNA do vírus parainfluenza foi quantificado a partir do pulmão homogeneizado por RT-PCR em tempo real 4 dias após a infecção. Sensibilização e desafio com ovalbumina foram associados com RNA de parainfluenza significativamente reduzido em camundongos do tipo selvagem e com deficiência de peroxidase de eosinófilos em comparação com controles não sensibilizados (Figura 3A), indicando que o efeito antiviral mediado por eosinófilos não era dependente da liberação de peroxidase de eosinófilos. Camundongos do tipo selvagem sensibilizados e desafiados e com deficiência de peroxidase de eosinófilos tinham eosinófilos das vias aéreas significativamente elevados em relação aos camundongos de tipo selvagem não sensibilizados e deficientes em peroxidase de eosinófilos (Figuras 3B e 3C).

Figura 3. A peroxidase de eosinófilos não é necessária para o efeito antiviral de eosinófilos na Vivo. (UMA) Camundongos WT e camundongos nocaute da peroxidase eosinófila (EPX - / -) foram sensibilizados e desafiados (S / C) com ovalbumina e infectados com o vírus parainfluenza. O RNA viral foi quantificado por RT-PCR em tempo real 4 dias após a infecção. Camundongos WT sensibilizados e desafiados (WT S / C) e EPX - / - (EPX - / - S / C) reduziram significativamente o RNA de parainfluenza no pulmão em comparação com camundongos de controle infectados com parainfluenza não sensibilizados. (B) A sensibilização com ovalbumina e o desafio aumentaram os eosinófilos no fluido do lavado broncoalveolar em camundongos WT e EPX - / - em comparação com controles não sensibilizados. (C) Não houve diferenças em outros tipos de células inflamatórias entre os grupos (n = 4–5). *P & lt 0,05. Os dados são apresentados como médias (± SEM).

Eosinófilos humanos isolados foram inoculados com parainfluenza por 2 horas, em seguida, lavados para remover o vírus não ligado e cultivados em meio fresco por 72 horas para avaliar se parainfluenza infecta eosinófilos diretamente e, em caso afirmativo, se os eosinófilos suportam a produção de progênie viral. O RNA da parainfluenza, quantificado por RT-PCR em tempo real a partir de sobrenadantes de cultura, aumentou progressivamente ao longo de 72 horas (Figura 4, eixo esquerdo), indicando que o vírus é capaz de infectar eosinófilos e produzir transcrições virais. No entanto, apesar da replicação, os títulos do vírus parainfluenza, conforme determinado pelo ensaio de hemadsorção, permaneceram indetectáveis ​​nestes pontos de tempo (Figura 4, eixo direito), indicando que os eosinófilos não suportam a produção de vírus infecciosos.

Figura 4. Os eosinófilos infectados com parainfluenza produzem descendência viral que não é infecciosa. Os eosinófilos humanos foram isolados do sangue periférico e infectados com o vírus parainfluenza por 2 horas, lavados para remover o vírus não ligado e mantidos em cultura por 72 horas. O RNA da parainfluenza de sobrenadantes de eosinófilos foi quantificado por RT-PCR em tempo real a cada 24 horas (quadrado sólido, eixo esquerdo) Ao mesmo tempo, os títulos do vírus parainfluenza infeccioso foram avaliados por ensaio de hemadsorção usando células de rim de macaco rhesus e expressos como dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID50) U / ml (círculo aberto, eixo direito) (n = 4). Os dados são apresentados como médias (± SEM).

Os níveis de RNA que codificam três proteínas estruturais do vírus parainfluenza (ou seja, proteína da matriz, proteína de fusão e nucleoproteína) foram comparados 2 horas após a inoculação entre culturas de eosinófilos infectados por vírus e culturas com meio inoculado por vírus para determinar se o efeito antiviral mediado por eosinófilos resultou da liberação de RNases de grânulos de eosinófilos. Ao mesmo tempo, os títulos do vírus parainfluenza foram avaliados neste ponto de tempo em células RMK por ensaio de hemadsorção. Os eosinófilos diminuíram significativamente os títulos do vírus parainfluenza em comparação com culturas inoculadas com vírus sem eosinófilos, mostrando que os eosinófilos reduzem a infectividade do vírus parainfluenza (Figura 5A). Uma redução adicional nos títulos de vírus foi observada quando os eosinófilos foram pré-tratados com IFNγ. No entanto, as quantidades de RNA para todas as três proteínas estruturais do vírus parainfluenza foram semelhantes entre as culturas contendo eosinófilos infectados com vírus e culturas inoculadas com vírus desprovidas de eosinófilos (Figura 5B), demonstrando que a infecciosidade reduzida não foi devido à degradação do genoma do RNA viral pelas RNases de grânulos de eosinófilos.

Figura 5. A atividade antiviral dos eosinófilos contra parainfluenza não envolve RNases granulares. Os eosinófilos humanos foram isolados do sangue periférico e infectados com o vírus parainfluenza. (UMA) A infecciosidade viral foi avaliada 2 horas após a inoculação por ensaio de hemadsorção e expressa como TCID viral50 U / ml. A infecciosidade da parainfluenza foi quase indetectável nos sobrenadantes de eosinófilos cultivados (Eos) e eosinófilos pré-tratados com IFNγ (Eos + IFNγ) em comparação com o vírus parainfluenza cultivado em meio sem eosinófilos (Media + IFNγ). (B) O RNA que codifica as proteínas estruturais, matriz, fusão e nucleoproteína (NP) do vírus parainfluenza foi quantificado em sobrenadantes de eosinófilos por RT-PCR em tempo real 2 horas após a inoculação. Nenhuma diferença foi detectada entre qualquer um dos três genes, sugerindo que a redução na infecciosidade parainfluenza não foi devido à degradação do RNA viral por RNases de grânulos de eosinófilos (n = 4–7). *P & lt 0,05. Os dados são apresentados como médias (± SEM).

O vírus parainfluenza foi incubado na presença de eosinófilos humanos isolados por 2 horas e, em seguida, a infectividade viral foi quantificada por titulação em células RMK (via ensaio de hemadsorção). Conforme mostrado na Figura 6A, os eosinófilos diminuíram significativamente os títulos do vírus parainfluenza em comparação com o parainfluenza incubado em meio sem eosinófilos. Os eosinófilos foram cultivados com o inibidor de óxido nítrico sintase, l -NAME, para determinar se o efeito antiviral mediado por eosinófilos foi devido à produção de óxido nítrico. Eosinófilos tratados com l -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Figura 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (UMA) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (n = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. eu -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (n = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. eu -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Figura 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (UMA) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (n = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue) TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (n = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways na Vivo and in isolated human eosinophils em vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia na Vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus em vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase na Vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect na Vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Conclusões

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Palavras-chave: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Bonecos

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( UMA )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( UMA )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( UMA )…


Assista o vídeo: Nunca mais se atrapalhe com contas de laboratório (Agosto 2022).