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Fragmento de clonagem de DNA - pelo menos tentando

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Tenho tentado clonar um fragmento (cerca de 1,6 kb) usando o sistema pGEM, infelizmente não foi bem sucedido. Então, mudei para pJET, e adivinha? Novamente, eficiência de transformação muito baixa. Agora estou mudando para pENTR. No entanto, estou pensando por que estou lutando para clonar este fragmento. Tentei aumentar a inserção: proporção do vetor; placa um maior # de e. células coli; Deixei minha reação de ligadura durante a noite, mas nada é muito útil. Alguém tem algum palpite ou sugestão sobre isso? Alguém acha que o fragmento é muito longo? Obrigado :)


O tamanho do fragmento em si não deve ser um problema em princípio.

A clonagem tem muitas etapas, portanto, qualquer coisa que você não testou especificamente pode estar causando problemas. Se vetores diferentes também não forem o problema, você provavelmente deve examinar suas etapas experimentais:

  • Muitas vezes, um problema pode ser o EtOH residual das etapas de limpeza, o que tornará a ligação e a transformação muito ineficientes.
  • Você também deve testar suas células competentes com outro plasmídeo para ter certeza de que ainda são viáveis
  • Você verificou se todos os fragmentos correm no tamanho correto em um gel? Você pode ter digestão em estrelas ou enzimas ligadas que causam problemas. Além disso, você também pode verificar o produto de ligadura em um gel (embora você não seja capaz de usá-lo para a transformação), para ver se a reação funciona corretamente

Fragmento de DNA clonado - pelo menos tentando - Biologia

Ótima pergunta! Na verdade, conheci vários biólogos moleculares que não entendiam as diferenças e pensavam que as duas técnicas eram intercambiáveis, para grande desgosto deles! Mas, primeiro, pelo bem da Rede, uma rápida revisão dos dois protocolos:

Clonagem bacteriana O primeiro passo na clonagem de um fragmento de DNA é a escolha de um vetor adequado: para pequenos fragmentos como subclones (menos do que alguns kb), geralmente usamos plasmídeos para fragmentos maiores como cDNAs (até cerca de 11 kb), usamos bacteriófagos e até mesmo para fragmentos maiores como clones genômicos (até cerca de 35 kb), usamos cosmídeos. (Pode-se até usar yACs para os maiores fragmentos cromossômicos, mas eles não são vetores bacterianos.) Uma vez que o vetor é escolhido, o fragmento da amostra é inserido no vetor - usando enzimas de restrição e ligases de DNA - e o clone é inserido na bactéria usando um dos vários métodos. Agora é simplesmente uma questão de cultivar a bactéria e depois lisá-la para isolar e purificar o fragmento clonado, agora abundante.

Polimerase CHain Ração O PCR está nos ingredientes e no mecanismo. A amostra de DNA é misturada em uma solução de reação com tampões, nucleotídeos livres e primers de DNA de fita simples. A isso é adicionada uma polimerase de DNA (proprietária) isolada de bactérias "termofílicas" que vivem perto de águas ferventes em torno de gêiseres e aberturas no fundo do mar. O mais comumente usado é Taq DNA polimerase, isolada da bactéria Gram-negativa aeróbia em forma de bastonete, Thermus aquaticus. A mistura de reação mais polimerase é então colocada em um termociclador, que usa temperaturas específicas para recozer os primers para a amostra, copiar a amostra e, em seguida, liberar a cópia da amostra, e então repete esse processo muitas vezes. Usando primers de ambas as extremidades do fragmento desejado, cada cópia pode atuar como um modelo para os ciclos subsequentes, e o número de cópias aumenta exponencialmente a cada ciclo. O resultado final é a amostra original agora contendo bilhões de cópias do fragmento alvo.

Você já pode ver algumas das diferenças importantes, mas aqui estão as principais restrições de cada técnica para tornar as coisas mais claras. Primeira clonagem bacteriana: várias das etapas para clonar um fragmento, especialmente a ligação, têm eficiências relativamente baixas e requerem uma quantidade relativamente grande de material de partida para o sucesso. Isso é especialmente verdadeiro se o fragmento desejado não tiver os locais de restrição adequados e exigir algumas modificações adicionais, como terminação cega. Portanto, para pequenas quantidades de fragmentos de DNA com extremidades cegas, a clonagem bacteriana pode ser no mínimo extremamente difícil. O PCR tem seus próprios problemas. Em primeiro lugar, a reação de PCR é totalmente dependente de primers de DNA que reconhecerão a sequência alvo e, se o alvo for desconhecido, não há como projetar primers específicos. Em segundo lugar, as polimerases utilizadas para executar as reações têm notoriamente baixa fidelidade, ou seja, frequentemente introduzem mutações à medida que copiam as fitas alvo. Em terceiro lugar, o PCR tem um alcance limitado e não pode produzir fragmentos com eficiência acima de alguns quilobases de comprimento - na verdade, ele é projetado para fragmentos na faixa de centenas de pares de base.

Mas o PCR é ótimo para amplificar pequenas quantidades de DNA, até cópias únicas em um cromossomo. Este é o principal uso do PCR na maioria dos laboratórios hoje, como uma ferramenta de diagnóstico para determinar a presença de um pedaço de DNA em uma amostra que contém, para começar, muito pouco material. Em muitos casos, a PCR foi usada antes da clonagem para produzir amostra suficiente para que a ligação ocorresse de forma eficiente, no entanto, isso é sempre seguido pelo sequenciamento cuidadoso dos produtos clonados para verificar as mutações induzidas por PCR. (Nosso laboratório está interessado em como as mutações funcionam, por isso usamos frequentemente PCR para criar novos mutantes.) Além disso, a PCR pode ser usada para introduzir locais de restrição e outras modificações nas extremidades dos fragmentos amplificados, incluindo as modificações nos primers. Em cada um desses últimos casos, porém, o objetivo final da amplificação por PCR é produzir material suficiente para usar na clonagem bacteriana, uma vez que a PCR só pode produzir quantidades de microgramas de DNA, enquanto a clonagem produz quantidades de miligramas. Ainda assim, como várias empresas de biotecnologia trabalham para desenvolver polimerases de DNA termicamente estáveis ​​e de alta fidelidade, a utilidade da PCR para clonagem, em vez de simples diagnóstico, continuará a aumentar.

Para responder aos pontos finais de sua pergunta, as restrições monetárias são menos importantes do que outras considerações, uma vez que os custos de termocicladores e reagentes para PCR são superados pelos custos de incubadoras e centrífugas para clonagem bacteriana. Quanto às restrições de tempo, novamente a natureza da amostra e o resultado final desejado ditarão a utilidade relativa de cada método. E, finalmente, o Projeto Genoma Humano usa ambas as técnicas extensivamente, uma vez que o sequenciamento de DNA requer pequenos fragmentos com primers conhecidos e o mapeamento cromossômico requer enormes clones sobrepostos.

Tente os links na Biblioteca MadSci para obter mais informações sobre Biologia Molecular.


Montagem de grandes fragmentos de DNA bacteriano de alto G + C em levedura

A capacidade de montar grandes pedaços de DNA procariótico por recombinação de levedura tem grande aplicação em biologia sintética, mas clonar grandes pedaços de DNA procariótico de alto G + C em levedura pode ser um desafio. Considerações adicionais na clonagem de grandes pedaços de DNA de alto G + C em levedura podem estar relacionadas a genes tóxicos, ao tamanho do DNA ou à ausência de origens de replicação de levedura na sequência. Como exemplo de nossa capacidade de clonar DNA de alto G + C em leveduras, optamos por trabalhar com Synechococcus elongatus PCC 7942, que tem um teor médio de G + C de 55%. Determinamos que nenhuma região do cromossomo é tóxica para a levedura e que fragmentos de DNA de S. elongatus sobre

200 kb não são mantidos de forma estável. As construções de DNA com um tamanho total abaixo de 200 kb podem ser prontamente montadas, mesmo com 62 kb de sequência sobreposta entre os pedaços. A adição de origens de replicação de levedura nos permitiu aumentar o tamanho total do DNA que poderia ser montado para pelo menos 454 kb. Assim, as estratégias de clonagem que utilizam recombinação de levedura com grandes sequências procarióticas de alto G + C devem incluir origens de replicação de levedura como parte do processo de design.


Inserção de um fragmento de DNA estranho em um vetor

A seção específica de DNA gerada pela ação da enzima de restrição é spliced ​​ou incorporada em um agente denominado veículo de clonagem. O veículo de clonagem também é chamado de vetor. Veículos ou vetores de clonagem: moléculas curtas de DNA que podem penetrar na parede das células hospedeiras vivas e se multiplicar dentro das células.

Atualmente, pequenas moléculas de DNA de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos Lambda e M 13 de E. coli: e vários vírus animais são usados ​​como vetores de clonagem para transferir o fragmento de DNA do tubo de ensaio para a célula hospedeira viva.

Para ser útil no processo de clonagem, um vetor ou veículo de clonagem deve ter as seguintes características:

1. Deve ser uma molécula pequena e bem caracterizada, possuindo meios de introduzir DNA em uma célula.

2. Deve ter uma origem de replicação que permita a auto-replicação, bem como a replicação do segmento de DNA estranho.

3. Deve ser capaz de selecionar moléculas híbridas por meio de um ensaio direto, de preferência pelo crescimento de uma célula hospedeira em um meio de cultura sólido.

O fragmento de DNA gerado pela ação de endonucleases de restrição deve ser unido ao vetor, seja um plasmídeo ou um fago, antes de ser clonado em uma bactéria. O piasmídeo é separado do cromossomo principal por ultracentrifugação. O anel do plasmídeo é aberto pela enzima de restrição e o gene é combinado com o vetor.

O processo de splicing produz um DNA quimérico ou molécula de DNA híbrido contendo DNA estranho e o DNA do veículo de clonagem. Esse DNA também é chamado de molécula de DNA recombinante. Uma vez que o DNA estranho é integrado ao veículo de clonagem, o DNA quimérico assim formado é introduzido e transferido para uma célula hospedeira. Normalmente, as células hospedeiras usadas para clonagem são organismos unicelulares, como bactérias ou leveduras.

A célula hospedeira que recebeu DNA recombinante ou DNA quimérico é então considerada transformada e a introdução de DNA quimérico na célula hospedeira é chamada de transformação. A clonagem de genes é essencialmente a inserção de um fragmento específico de DNA estranho em uma célula, de modo que o DNA inserido seja replicado e transmitido às células-filhas durante a divisão celular.

A célula hospedeira deve aceitar o vetor com genes estranhos, incorporá-lo ao seu genoma e começar a transcrever esse gene.

Plasmídeos como vetor:

Os plasmídeos são pequenos DNAs circulares extracromossômicos de fita dupla, que possuem um número limitado de sítios de restrição. Eles estão presentes no citoplasma bacteriano e nas leveduras. O plasmídeo que tem sido usado extensivamente na clonagem é o pBR 322 (Fig. 24.6) que tem 4363 pares de bases.

Eles responderam independentemente do cromossomo bacteriano e carregam genes para fertilidade, resistência a antibióticos, capacidade de fermentar açúcares e também genes para produção de bacteriocinas, hemolisinas etc., uma propriedade d auxilia na seleção de células transformadas.

Eles diferem em seus tamanhos e genes contidos em seu DNA. Os plasmídeos podem ser categorizados com base no número de cópias por célula em:

Eles também podem ser classificados em conjugativos e não conjugativos, dependendo se eles carregam ou não um conjunto de genes de transferência ou genes tra que promovem a conjugação bacteriana.

Geralmente os plasmídeos conjugativos são plasmídeos estringentes de alto peso molecular que estão presentes em número limitado (1-3 cópias por célula) e os plasmídeos não conjugativos são do tipo relaxado que um pequeno com baixo mol. em peso e estão presentes em várias cópias (20 e # 8211 25 cópias por célula).

Os plasmídeos que são populares na clonagem contêm cerca de 6.500 pares de bases e têm um único local onde podem ser clivados por uma endonuclease de restrição. Além disso, existem alguns outros plasmídeos que são maiores o suficiente e são difíceis de manusear. Eles geralmente não são usados ​​na clonagem de genes. Alguns plasmídeos são capazes de se integrar no cromossomo bacteriano e são chamados de epissomas, por exemplo, fatores F de E. coil.

Às vezes, após clivagem por uma enzima de restrição e durante a inserção de fragmento de DNA estranho no plasmídeo, alguns genes importantes são destruídos, por exemplo. A enzima de restrição Bam HI destrói o gene ter-r (resistente contra tetraciclina).

Em geral, os veículos do plasmídeo têm uma densidade diferente do DNA do hospedeiro e, portanto, podem ser purificados facilmente por sedimentação. Assim, para clonar um pedaço de DNA estranho, o DNA é integrado ou unido ao DNA do plasmídeo e o DNA quimérico ou recombinante é usado para transformar uma bactéria hospedeira, como E. coli.

O plasmídeo com DNA estranho então se replica dentro da bactéria quando ela cresce e se divide e, assim, o pedaço de DNA estranho torna-se clonado.

Bacteriófagos como vetores:

Os bacteriófagos ou seus derivados também são usados ​​como vetores ou veículos de clonagem. O bacteriófago lambda (λ) é um dos elementos mais bem compreendidos na genética bacteriana.

Um bacteriófago é um vírus que infecta bactérias. Esses são comumente chamados de fagos. Os bacteriófagos são mais complicados do que os plasmídeos. Ao contrário dos plasmídeos, os vetores fágicos são necessários para a clonagem de grandes fragmentos de DNA e, portanto, banco de genes ou bibliotecas genômicas podem ser construídos.

O fago contém uma cabeça e uma cauda longa presas à cabeça, que são constituídas por proteínas. Dentro da bainha proteica, há uma molécula de DNA de fita dupla linear.

O DNA do fago contém genes para proteínas da bainha e tem uma origem de replicação. Os fagos, assim como os plasmídeos, carecem de maquinaria que leva à produção de proteínas e, portanto, eles se reproduzem dentro das células bacterianas vivas. Quando um fago entra em contato com uma célula bacteriana, a cauda do fago adere à parede celular da bactéria E. coli e injeta seu DNA linear no citoplasma da célula hospedeira.

O DNA do fago lambda é uma molécula duplex linear de cerca de 48,5 kb pares que possui cerca de 60 genes.

Genes funcionalmente relacionados são agrupados no mapa linear (Fig. 24.7). Agrupamento de genes à esquerda do código do mapa linear para proteínas da cabeça e da cauda, ​​aqueles no meio estão envolvidos no fago lisogênico, ou seja, na recombinação e os genes à direita da região central estão preocupados com a regulação e imunidade do profago à infecção, síntese de DNA e lise da célula hospedeira.

Quando presente no interior da célula hospedeira, o DNA do fago pode ser integrado no cromossomo bacteriano ou pode permanecer em estado livre no citoplasma.

O ciclo de replicação do fago é realizado de duas maneiras:

No processo lítico, a molécula de DNA de fita dupla linear injetada dentro da célula bacteriana torna-se circular através da fita simples de 12 nucleotídeos chamada sítio cos [Fig. 24.7 (a)] que se replica por um mecanismo de círculo rolante e produz vários genomas.

No fago lambda que se replica na fase lítica, grande parte da região central não é essencial para o crescimento do fago e pode ser deletada ou substituída sem prejudicar o ciclo de crescimento infeccioso. Ao mesmo tempo, o DNA do fago também secou a síntese de proteínas necessárias para produzir cabeças vazias onde as moléculas de DNA estão empacotadas.

Eventualmente, a cauda também é formada e ligada à cabeça e as partículas de fago da progênie são liberadas para fora da célula bacteriana (Fig. 24.8). No estágio inicial da infecção, alguns fagos produzem proteínas que destroem o DNA bacteriano, dividindo-o em nucleotídeos individuais. O fago lambda replica-se no fago lítico.

No processo lisogênico, o DNA do fago se integra ao cromossomo bacteriano e se replica junto com o cromossomo do hospedeiro, sem efeito prejudicial ao hospedeiro (Fig. 24.8).

A seguir estão as vantagens dos sistemas de clonagem de fago sobre os plasmídeos:

(i) DNA estranho pode ser empacotado in vitro em fagos e transduzido em células hospedeiras bacterianas com melhor eficiência.

(ii) Moléculas de DNA estranhas longas de até 25 kPB de comprimento podem ser inseridas no DNA do fago.

(iii) A triagem e o armazenamento de DNA recombinante são mais fáceis em fagos do que em plasmídeos.

O vetor M 13 é um fago de DNA de fita simples filamentoso. O fago M-13 pode infectar células bacterianas masculinas através dos pili. Uma vez dentro da célula hospedeira, o DNA do fago é replicado, transcrito e traduzido em produtos de genes virais. A fita positiva (+) do vírus é usada para sintetizar a fita complementar (-) dando origem a uma cópia de fita dupla de M-I3 que é conhecida como a forma de replicação parental (RF).

A forma de replicação serve como modelo a partir do qual várias (100 e # 8211 200) cópias de moléculas de RF são sintetizadas. Os fagos de DNA de fita simples prejudicam a célula bacteriana, em vez das partículas de fago liberadas continuamente da célula sem qualquer dano a ela. Nenhum empacotamento de DNA viral é necessário com este sistema.

As partículas M 13 continuam a infectar as bactérias masculinas circundantes e uma placa de células em crescimento sic é formada. Assim, com o sistema M 13, o fago recombinante pode ser distinguido do não recombinante com base na cor da placa.

Os cosmídeos (cos + plasmídeo) são vetores sintetizados artificialmente contendo DNA de plasmídeo com um fragmeoi de λDNA incluindo o sítio cos empacotado em uma partícula de fago. Os cosmídeos consistem essencialmente em um DNA de fita dupla circular com genes resistentes a antibióticos, vários locais de restrição e locais cos do fago λ.

O cosmídeo HC 79, por exemplo, consiste em um fragmento de DNA de 1,7 kb consistindo na região cos da fase λ inserida em qualquer região essencial de pBR 322. O DNA estranho pode ser clonado em qualquer local de restrição em pBR 322 e o produto após a ligação é empacotado em vitro.

O cosmídeo infecta o hospedeiro que é selecionado para crescimento em meio contendo antibiótico e as colônias formadas são analisadas quanto à presença de DNA de plasmídeo. Os cosmídeos recombinantes, ao contrário do vetor, são mantidos como plasmídeos na célula hospedeira.

Os cosmídeos recombinantes são mais estáveis ​​e fáceis de armazenar. Fragmentos de DNA maiores podem ser clonados nos cosmídeos. Assim, eles combinam o melhor i do vetor de clonagem com capacidades máximas.


CLONAGEM TERAPEUTICA

A clonagem terapêutica (também chamada de clonagem de embriões) é a criação de embriões para uso em pesquisas biomédicas. O objetivo da clonagem terapêutica não é criar clones, mas obter células-tronco. As células-tronco são "células mestras" capazes de se diferenciar em vários outros tipos de células. Esse potencial é importante para os pesquisadores biomédicos porque as células-tronco podem ser usadas para gerar qualquer tipo de célula especializada, como células nervosas, musculares, sanguíneas ou cerebrais. Muitos cientistas acreditam que as células-tronco podem não apenas fornecer um suprimento imediato de tecido de reposição, mas também podem ser a chave para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para doenças comuns, como doenças cardíacas e câncer, bem como doenças degenerativas como Alzheimer e Parkinson. Os pesquisadores acreditam que no futuro será possível induzir as células-tronco a se transformarem em órgãos completos.

As células-tronco usadas em pesquisas são colhidas do blastocisto após sua divisão por cinco dias, durante o estágio inicial do desenvolvimento embrionário. Muitas pessoas consideram os embriões humanos como seres humanos ou pelo menos como seres humanos em potencial e consideram sua destruição, ou mesmo o uso de técnicas para obter células-tronco que possam colocar em risco sua viabilidade futura, como imoral ou antiética.

Em novembro de 2001, os pesquisadores do ACT Jose B. Cibelli et al. relatado em "Somatic Cell Nuclear Transfer in Humans: Pronuclear and Early Embryonic Development" (e-biomed: The Journal of Regenerative Medicine, 26 de novembro de 2001) que haviam criado um embrião humano clonado e, ao contrário de grupos que alegaram ter feito isso antes, publicaram seus resultados. O comunicado de imprensa da ACT "Advanced Cell Technology, Inc. (ACT) Anunciou Hoje a Publicação de Sua Pesquisa sobre Transferência Nuclear de Células Somáticas Humanas e Partenogênese" (25 de novembro de 2001, http://www.advancedcell.com) se gabava de que essa conquista era oferecida "a primeira prova de que células humanas reprogramadas podem fornecer tecido" e afirmou que essa conquista foi um primeiro passo vital em direção ao objetivo da clonagem terapêutica & # x2014 usando embriões clonados para colher células-tronco embrionárias capazes de crescer em tecido de substituição perfeitamente compatível com pacientes individuais . Para clonar embriões humanos, Cibelli et al. coletou óvulos de mulheres e cuidadosamente removeu o material genético dos óvulos com uma agulha fina. Uma célula da pele foi inserida dentro de cada um dos oito ovos enucleados, que foram estimulados quimicamente a se dividir. Apenas três dos oito ovos começaram a se dividir, e apenas um atingiu seis células antes que a divisão celular cessasse.

Naquele mesmo ano, pesquisadores do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Austrália do Sul usaram cordeiros para fazer experiências com clonagem terapêutica. O objetivo era substituir as células afetadas pelo mal de Parkinson por outras saudáveis ​​derivadas de um embrião clonado. Em 2003, pesquisadores na Itália relataram com sucesso o uso de células-tronco adultas para curar ratos que tinham uma forma de esclerose múltipla. Os cientistas injetaram nos ratos doentes células-tronco extraídas do cérebro de ratos adultos reproduzidas em laboratório. O exame pós-morte dos ratos mostrou que as células-tronco migraram para áreas danificadas dos nervos e do cérebro e depois repararam.

Em agosto de 2003, uma equipe de pesquisa chinesa liderada por Huizhen Sheng, um cientista americano treinado que trabalha na Shanghai Second Medical University, relatou que havia feito células-tronco embrionárias humanas combinando células da pele humana com ovos de coelho. Sua realização foi publicada na revista científica chinesa Pesquisa Celular, uma publicação revisada por pares do Instituto de Biologia Celular de Xangai e da Academia Chinesa de Ciências. Os pesquisadores removeram o DNA dos ovos de coelho e injetaram células de pele humana dentro deles. Os ovos então cresceram para formar embriões contendo material genético humano. Após vários dias, os embriões foram dissecados para extrair suas células-tronco.

Em fevereiro de 2004, cientistas da Universidade Nacional de Seul, na Coreia do Sul, relataram no jornal Ciência que eles haviam clonado com sucesso embriões humanos saudáveis, removido células-tronco embrionárias e cultivado em camundongos. Em janeiro de 2006, após uma longa investigação, a Universidade Nacional de Seul concluiu que a pesquisa relatada em Ciência tinha sido fabricado. Como resultado, a revista retratou o artigo juntamente com outro estudo do mesmo autor. Em maio de 2006, o investigador, Hwang Woo-suk, foi acusado de fraude, peculato e violação dos estatutos de bioética da Coreia do Sul.

Em 2005, Wilmut recebeu uma licença do governo britânico para clonar embriões humanos para gerar linhas de células-tronco para estudar doenças do neurônio motor (MND). Wilmut e seus colegas estão trabalhando para clonar embriões para gerar células-tronco que, por sua vez, se tornariam neurônios motores com defeitos genéticos causadores de MND. Ao observar as células-tronco se transformarem em neurônios, os pesquisadores esperam descobrir o que causa a degeneração das células. A pesquisa envolve comparar as células-tronco com células saudáveis ​​e doentes de pacientes com MND para obter uma melhor compreensão da doença e para testar potenciais tratamentos com drogas.

A clonagem reprodutiva humana continua ilegal na Grã-Bretanha, mas a clonagem terapêutica & # x2014 criando embriões como uma fonte de células-tronco para curar doenças & # x2014 é permitida em uma base aprovada. A licença concedida a Wilmut e seus colegas é a segunda concedida pela Autoridade de Fertilização e Embriologia Humana da Grã-Bretanha.

Em julho de 2006, os pesquisadores Deepa Deshpande et al. movimento restaurado para ratos paralisados ​​usando um novo método que demonstra o potencial das células-tronco embrionárias para restaurar a função em humanos que sofrem de distúrbios neurológicos. Eles publicaram seus resultados em "Recuperação da paralisia em ratos adultos usando células-tronco embrionárias" (Annals of Neurology, Julho de 2006). Embora os ensaios clínicos em humanos ainda estejam a anos de distância, os resultados dessa pesquisa representam um importante avanço na busca pela cura da paralisia e de outros distúrbios neurológicos.

Em outubro de 2006, Kevin A. D'Amour et al., Em "Production of Pancreatic Hormone-Expressing Endocrine Cells from Human Embryonic Stem Cells" (Nature Biotechnology, 19 de outubro de 2006), relatou o desenvolvimento de um processo para transformar células-tronco embrionárias humanas em células pancreáticas que podem produzir insulina e outros hormônios. Os pesquisadores prevêem testar essas células em animais em 2008 e, se os estudos em animais forem bem-sucedidos, os testes clínicos em pacientes humanos podem começar em 2009.

Três estudos & # x2014 Volker Sch & # xE4 chinger et al. em "Intracoronary Bone Marrow-Derived Progenitor Cells in Acute Myocardial Infarction", Ketil Lunde et al. em "Intracoronary Injection of Mononuclear Bone Marrow Cells in Acute Myocardial Infarction" e Birgit Assmus et al. em "Transcoronary Transplantation of Progenitor Cells after Myocardial Infarction" & # x2014 que descreve o uso de células-tronco no tratamento de doenças cardíacas foi publicado em 21 de setembro de 2006, edição do New England Journal of Medicine. Os estudos produziram resultados conflitantes: Sch & # xE4 chinger e seus colegas relataram benefícios para pacientes que sofreram infarto do miocárdio (ataque cardíaco). Lunde e seus colaboradores não encontraram nenhum benefício no tratamento de tais pacientes com células-tronco. Assmus e seus colaboradores estudaram pacientes com insuficiência cardíaca crônica, que apresentaram melhora após o tratamento. No editorial "Cardiac Cell Therapy & # x2014 Mixed Results from Mixed Cells" na mesma edição da revista, Antony Rosenzweig escreve que os três estudos "fornecem uma perspectiva realista sobre esta abordagem, deixando espaço para otimismo cauteloso e enfatizando a necessidade de um estudo mais aprofundado."

Rick Weiss, em "Stem Cell Work Shows Promise and Risks" (Washington Post, 23 de outubro de 2006), relata que a pesquisa conduzida no University of Rochester Medical Center usando células nervosas cultivadas a partir de células-tronco embrionárias humanas para tratar ratos afetados pela doença de Parkinson produziram resultados mistos. O tratamento reduziu os sintomas dos animais, mas causou tumores no cérebro dos roedores. Os pesquisadores reconheceram que seu trabalho mostrou a promessa e os riscos associados aos tratamentos com células-tronco.

Pesquisa promete benefícios terapêuticos sem clonagem

Em "Homologous Recombination in Human Embryonic Stem Cells" (Nature Biotechnology, Março de 2003), Thomas P. Zwaka e James A. Thomson relatam que usaram células-tronco embrionárias humanas para separar genes individuais e substituir genes diferentes em seu lugar. Sua realização foi anunciada como o primeiro passo em direção ao objetivo de regenerar partes do corpo humano por meio do transplante de células-tronco ou tecidos cultivados a partir de células-tronco em pacientes. Zwaka e Thomson usaram cargas elétricas e produtos químicos para tornar as membranas das células permeáveis, as células permitiram a entrada de genes customizados e, então, encontraram e substituíram suas contrapartes no DNA das células.

A capacidade de fazer mudanças genéticas precisas nas células-tronco humanas poderia ser usada para aumentar seu potencial terapêutico ou torná-las mais compatíveis com o sistema imunológico dos pacientes. Alguns pesquisadores afirmam que o sucesso dessa façanha de bioengenharia pode eliminar a necessidade de buscar a prática altamente debatida da clonagem terapêutica, mas outros alertam que tal pesquisa pode aumentar as preocupações entre aqueles que temem que a tecnologia de células-tronco levará à criação de "bebês projetados. , "que são criados para características específicas, como aparência, inteligência ou destreza atlética.

Em maio de 2003, o pesquisador da Universidade da Pensilvânia Hans R. Sch & # xF6ler e seus colegas anunciaram outra estreia histórica: os pesquisadores transformaram células embrionárias de camundongos comuns em óvulos em pratos de laboratório ("Scientists Produce Mouse Eggs from Embryonic Stem Cells, Demonstrating Totipotency Mesmo In Vitro, " ScienceDaily, 2 de maio de 2003). Sch & # xF6ler selecionou de uma população de células-tronco aquelas que possuíam certas características genéticas que sugeriam o potencial de se tornarem ovos. Eles então os isolaram em pratos de laboratório. Eventualmente, as células se transformaram em dois tipos de células, incluindo os óvulos jovens. Os ovos amadureceram normalmente e pareciam saudáveis ​​em termos de aparência, tamanho e expressão gênica. Quando cultivados por alguns dias, os ovos também sofreram divisão espontânea e formaram estruturas semelhantes a embriões, processo denominado partenogênese. Essa descoberta implica que os óvulos estavam totalmente funcionais e provavelmente poderiam ser fertilizados com esperma.

Depois de refinada, essa tecnologia poderia ser aplicada para produzir células-ovo em laboratório que permitiriam aos cientistas projetar características em animais e ajudar os conservacionistas a reconstruir populações de espécies ameaçadas de extinção. Ele oferece aos pesquisadores a chance de observar os óvulos de mamíferos à medida que amadurecem, um processo que ocorre invisível dentro do ovário. A tecnologia também oferece uma oportunidade incomparável de aprender sobre meiose (divisão de redução), o processo de divisão celular durante o qual um óvulo ou espermatozóide libera metade de seus genes para que possa se juntar a um gameta do sexo oposto. Também existem muitos benefícios médicos potenciais. Por exemplo, mulheres que não podem fazer ovos saudáveis ​​podem usar essa tecnologia para garantir uma prole saudável.

Como muitas novas tecnologias, transformar células em óvulos simultaneamente resolve os problemas éticos existentes e cria novos. Por exemplo, como as células-tronco embrionárias se transformaram espontaneamente em óvulos, esse procedimento supera muitas das objeções éticas à clonagem, que envolve a criação de descendentes de um único pai. No entanto, também abre caminho para a criação de "ovos projetados" do zero e, se realizado com células humanas, pode redefinir as definições biológicas de mães e pais.

Em setembro de 2003, os esforços para transformar células-tronco em espermatozoides foram bem-sucedidos. Toshiaki Noce e seus colegas em Tóquio, Japão, observaram células-tronco embrionárias de camundongos machos que se desenvolveram espontaneamente, com algumas células realmente se tornando células germinativas. Quando os pesquisadores transplantaram as células germinativas para o tecido testicular, as células sofreram meiose e formaram células espermáticas. Uma possível aplicação médica dessa tecnologia seria ajudar casais inférteis porque o homem não pode produzir espermatozóides saudáveis. Uma das questões éticas que poderiam surgir seria o potencial de dois homens serem pais biológicos de uma criança. Outra é o potencial de gerar um ser humano que nunca teve pais usando duas células-tronco cultivadas em laboratório, uma transformada em espermatozóide e a outra em óvulo. Muitos especialistas em ética aconselham a consideração de tais questões antes de permitir a experimentação humana.

Em 2004, o National Institutes of Health (NIH) relatou que pesquisadores da Escola de Medicina Veterinária da Universidade da Pensilvânia usaram células de camundongos para cultivar células progenitoras de esperma em uma cultura de laboratório (3 de novembro de 2004, http://www.nih.gov /news/pr/nov2004/nichd-03.htm). Conhecidas como células-tronco espermatogoniais, as células progenitoras são incapazes de fertilizar óvulos, mas dão origem a células que se desenvolvem em espermatozoides. Os pesquisadores transplantaram as células em camundongos inférteis, que foram então capazes de produzir espermatozóides e filhos geneticamente relacionados aos camundongos doadores.

Esta descoberta tem muitas aplicações potenciais, incluindo o desenvolvimento de novos tratamentos para a infertilidade masculina e a extensão da vida reprodutiva de espécies ameaçadas de extinção. Os pesquisadores também tentarão manipular geneticamente as células de esperma cultivadas em um meio de cultura e, em seguida, implantá-las em animais. Dessa forma, eles poderiam introduzir novas características em animais de laboratório e gado, como resistência a doenças. A técnica de cultura oferece aos pesquisadores oportunidades adicionais para investigar o potencial das células-tronco espermatogoniais como uma fonte de células-tronco adultas para substituir o tecido doente ou ferido.

Novos métodos de obtenção de células-tronco sem destruir embriões

Em "Embryonic and Extraembryonic Stem Cell Lines Derived from Single Mouse Blastomeres" (Natureza, 12 de janeiro de 2006), Young Chung et al. relatam que as culturas de células-tronco embrionárias podem ser derivadas de células únicas de embriões de camundongo. Irina Klimanskaya et al., Em "Human Embryonic Stem Cell Lines Derived from Single Blastomeres" (Natureza, 23 de agosto de 2006), descreve uma técnica para remover uma única célula & # x2014 chamada de blastômero & # x2014 de um embrião de três dias com oito a dez células e usando um processo bioquímico para criar células-tronco embrionárias a partir do blastômero . O método de remoção de uma célula do embrião é muito parecido com a técnica usada para o diagnóstico genético pré-implantação, que é realizado para rastrear a célula em busca de defeitos genéticos. Os pesquisadores observaram que as linhas de células-tronco embrionárias humanas derivadas de um único blastômero eram comparáveis ​​às linhas derivadas com técnicas convencionais. Embora Klimanskaya e seus colegas afirmem que o novo método "tornará muito mais difícil se opor a essa pesquisa", os oponentes da pesquisa com células-tronco afirmam que a nova técnica é moralmente inaceitável porque mesmo uma única célula removida de um embrião inicial pode ter o potencial para produzir uma vida.

Outra técnica relatada em 2006 pode eliminar a necessidade de células-tronco embrionárias. Erika Verifique as notas em "Receita simples dá poderes embrionários às células adultas" (Natureza, 6 de julho de 2006) que pesquisadores no Reino Unido descobriram o gene, denominado nanog, que é a chave para "reprogramar" células adultas de volta ao estado embrionário. A reprogramação de células adultas usando nanog pode possibilitar aos cientistas a geração de células que se especializam e se desenvolvem em todos os tipos de células do corpo, sem o uso controverso de células-tronco embrionárias humanas.


A reunião do Havaí e os experimentos iniciais de clonagem de DNA

No início de 1972, concordei em me juntar a Tsutomu Watanabe, um microbiologista da Keio University que foi um pioneiro em estudos de resistência bacteriana a antibióticos, e Donald Helinski na organização de uma conferência Estados Unidos-Japão sobre plasmídeos no final daquele ano. Poucas semanas antes da reunião, que foi realizada em meados de novembro na Universidade do Havaí em Honolulu, Don me contatou para sugerir que Herb Boyer, cujo trabalho no plasmídeo codificado EcoEnzima RI que ele acabara de conhecer, ser adicionada à lista de oradores. Telefonei nosso convite para Herb e, assim, comecei uma interação científica que, menos de 6 meses depois, resultou na clonagem de genes de resistência a antibióticos a partir de plasmídeos.

A colaboração real começou durante uma longa caminhada perto da praia de Waikiki, em Honolulu, em busca de uma lanchonete para fazer um lanche noturno. Boyer e eu fomos acompanhados por Stanley Falkow, que recentemente mudou seu laboratório para a Universidade de Washington, Charles Brinton, um microbiologista da Universidade de Pittsburgh, e a esposa de Charles, Ginger. Durante essa caminhada, Herb e eu discutimos os resultados recentes de nossos laboratórios. Descrevi nossos experimentos mostrando que E. coli poderiam ser transformados geneticamente com DNA de plasmídeo nu, e nossos experimentos de cisalhamento de DNA de plasmídeo, que ainda não haviam sido publicados, e Herb descreveu os dados de sequenciamento não publicados que ele, Joe Hedgpeth e Howard Goodman obtiveram para o EcoLocal de clivagem RI. Enquanto Herb e eu conversávamos, percebi que EcoRI era o ingrediente que faltava para a análise molecular de plasmídeos de resistência a antibióticos. Plasmídeos grandes seriam cortados especificamente e reproduzivelmente pela enzima, e esse método de clivagem certamente seria melhor do que os métodos mecânicos de cisalhamento que eu vinha usando para fragmentação de círculos de DNA de plasmídeo. Porque EcoRI reconhece uma sequência de seis pares de bases, os locais de clivagem no DNA duplex estariam em média com cerca de 4.100 pares de bases separados e cada um dos fragmentos de DNA produzidos provavelmente conteria apenas alguns genes. O número de fragmentos seria pequeno o suficiente para separá-los por centrifugação, permitindo seu uso em experimentos de hibridização DNA-DNA. Por causa da assimetria de clivagem do EcoSequência de reconhecimento de RI, as extremidades dos múltiplos fragmentos de DNA de plasmídeo gerados por EcoRI seria complementar - e, nas condições certas, fragmentos de DNA de plasmídeo individual na mistura poderiam se unir em diferentes combinações. Se clivagem por EcoRI deixou a função de replicação do plasmídeo intacta, a região que codifica esta função pode se juntar aleatoriamente a diferentes combinações de genes de resistência a antibióticos na mistura de fragmentos, formando círculos de DNA que podem ser selados usando DNA ligase, como foi mostrado para as extensões complementares em as extremidades de λ DNA (44, 45). E o procedimento de transformação do DNA plasmídeo nos permitiria selecionar e, com sorte, clonar separadamente, genes de resistência específicos usando combinações apropriadas de antibióticos em placas de cultura.

Herb inicialmente não parecia estar especialmente interessado em estudar a estrutura do DNA do plasmídeo R e se ofereceu simplesmente para fornecer a enzima que generosamente deu a outros. No entanto, ele estava animado com o uso de plasmídeos R de replicação autônoma para clonar EcoFragmentos de DNA gerados por RI. Quando encontramos uma pequena delicatessen com uma atraente placa de vitrine que dizia "Shalom", no lugar do onipresente "Aloha", decidimos prosseguir em colaboração e concordamos com o design básico do projeto que nossos laboratórios conduziriam em conjunto Fora. Teríamos como alvo o plasmídeo R6-5, sobre o qual Sharp, Davidson e eu tínhamos aprendido muito com a análise de heteroduplex, e que Chang e eu tínhamos tosado usando um dispositivo de agitação mecânica e lâminas de metal em nossos experimentos iniciais. Poucos minutos depois, com sanduíches quentes de corned beef e cerveja gelada (fig. 1), Herb e eu esboçamos um plano experimental com guardanapos retirados do distribuidor em nossa mesa.

Desenho de D. Adair no Honolulu Advertiser jornal, 26 de setembro de 1988, que acompanha um artigo relatando a demolição da delicatessen da praia de Waikiki, onde os experimentos iniciais de clonagem de DNA foram planejados. As pessoas representadas no sentido horário presume-se que sejam H. Boyer (12 horas), S. Cohen, G. Brinton, C. Brinton e S. Falkow. Reproduzido com permissão.

Nossa estratégia era direta (fig. 2), mas não havia garantia de que funcionaria. Sim, sabíamos que poderíamos transformar geneticamente E. coli com DNA de plasmídeo e usar genes de resistência a antibióticos para identificar células que adquirem plasmídeos, e esperávamos da sequência de nucleotídeos no EcoRI local de clivagem em que a enzima de restrição cortaria o DNA de nossos grandes plasmídeos reprodutivelmente em múltiplos fragmentos. Sabíamos de resultados anteriores publicados que DNAs com extremidades complementares se ligariam por emparelhamento de bases: Khorana e seus colegas juntaram fragmentos de fita dupla de DNAs sintéticos in vitro adicionando quimicamente nucleotídeos complementares a eles um de cada vez (50) - demonstrando que tal recombinação é independente da sequência dos segmentos duplex que estão sendo unidos. Jensen et al. (51) usaram a estratégia de reunir DNAs naturais adicionando enzimaticamente trechos de nucleotídeos complementares aos seus terminais, e Peter Lobban no laboratório de Dale Kaiser e David Jackson no laboratório de Paul Berg mostraram que fragmentos díspares do mesmo genoma ou genomas diferentes que foram mantidos juntos por segmentos de fita simples complementares instalados enzimaticamente podem ser ligados para criar junções covalentemente ligadas (52, 53). Berg comentou mais tarde: “não é preciso ser um gênio para descobrir que, se você pode criar extremidades artificiais que são complementares entre si, as duas moléculas de DNA se unirão” (54). Além disso, os resultados obtidos por Mertz e Davis (47) e por Sgaramella (48) e publicados durante o mês do encontro do Havaí mostraram que as quatro extensões de fita simples de nucleotídeos geradas por EcoRI têm comprimento suficiente para permitir que fragmentos de DNA sejam unidos in vitro.

No entanto, apesar de nossa expectativa de que seríamos capazes de unir bioquimicamente as extremidades complementares de EcoFragmentos de DNA de plasmídeo gerados por RI, havia importantes incógnitas biológicas nos experimentos que Boyer e eu planejamos. Seria a clivagem de R6-5 com EcoRI interrompe regiões necessárias para replicação de DNA de plasmídeo ou expressão de resistência a antibióticos? E as moléculas de DNA recombinante criadas em laboratório seriam reproduzidas e transcritas em células bacterianas? As junções de DNA formadas durante a recombinação genética legítima em células são geradas por um processo que resultou de bilhões de anos de evolução. A junção aleatória de DNAs por meios artificiais criaria conformações de cromatina anômalas que impedem a propagação das moléculas? Essas múltiplas questões levaram Falkow, que juntamente com Charles Brinton participaram da discussão e imaginou a possibilidade de isolar um gene de toxina bacteriana entérica que ele estava estudando usando o procedimento que Boyer e eu tínhamos acabado de esboçar, a observar: “Se isso funciona, me avisa ”(55). Um colega sênior de Stanford com quem conversei após meu retorno a Palo Alto estava consideravelmente menos otimista, proferindo a opinião de que nada interpretável provavelmente viria do projeto experimental “confuso”.

Diagrama esquemático da estratégia usada para a construção de plasmídeos biologicamente funcionais (1). Fragmentos de DNA de plasmídeo R6-5 gerados por clivagem usando o EcoAs endonucleases RI puderam associar-se aleatoriamente in vitro e foram então unidas covalentemente pela DNA ligase. O DNA na mistura resultante foi introduzido em tratamento com cloreto de cálcio E. coli, e colônias bacterianas que expressam fenótipos de resistência a antibióticos individuais codificados por R6-5 foram selecionadas em meio contendo antibióticos. Construtos de plasmídeo isolados destes E. coli os clones continham fragmentos de DNA portadores de genes de resistência específicos.

Começamos os experimentos logo após o ano novo. Eles foram mais tranquilos do que poderíamos esperar e, em março de 1973, havíamos demonstrado a viabilidade da abordagem de clonagem de DNA que Boyer e eu tínhamos delineado alguns meses antes em guardanapos delicatessen. Durante uma visita ao Laboratório Cold Spring Harbor naquele inverno para dar uma palestra, Herb aprendeu sobre o método de eletroforese em gel de agarose / coloração de DNA ainda não publicado que Phillip Sharp, Bill Sugden e Joseph Sambrook desenvolveram para separar e visualizar fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (56), esse avanço ofereceu uma adição extremamente importante aos métodos de centrifugação e heteroduplex que estávamos usando para analisar plasmídeos. Na colaboração, o laboratório de Herb purificou a endonuclease de restrição que usamos e caracterizou o DNA de plasmídeo em géis de agarose corados com brometo de etídio. Meu laboratório isolou e purificou o DNA de plasmídeo, fez transformações e seleção bacteriana e caracterizou os produtos por análise de heteroduplex e ultracentrifugação em gradientes. Os dados foram analisados ​​em ambos os locais, e os resultados foram discutidos entre os laboratórios quase diariamente. Eu chegava ao laboratório no início da manhã para olhar as placas de cultura quando as colônias produzidas por células plaqueadas no final da noite anterior ainda eram minúsculas. Muitas vezes desejei que a bactéria crescesse mais rápido para que pudéssemos obter resultados mais cedo. Annie morava em San Francisco e carregava materiais entre Stanford e UCSF. Tínhamos pressa em isolar o DNA do plasmídeo para que ela pudesse carregar parte dele para o laboratório de Herb para análise do gel no dia seguinte. Foi uma época extraordinariamente emocionante para todos nós.

Ao introduzir uma mistura de EcoFragmentos de DNA R6-5 gerados por RI em E. coli, recuperamos um plasmídeo que expressou resistência à canamicina, mas não os outros genes de resistência de R6-5. Este replicon incluiu apenas três dos fragmentos de DNA característicos do plasmídeo parental (Fig. 3, Principal, pistas a e b). Uma análise posterior indicou que um desses fragmentos codificava funções e locais necessários para a replicação autônoma de DNA, mas não continha nenhum gene de resistência detectável, um segundo fragmento sem a capacidade de replicação autônoma, mas carregando um gene de resistência à canamicina, foi anexado na mistura de fragmentos para a replicação região e, durante a transformação bacteriana e seleção de células resistentes à canamicina, o gene foi clonado. Estávamos absolutamente entusiasmados, mas sabíamos que a clonagem de DNA robusta exigiria um vetor de plasmídeo que incluísse um gene selecionável e recursos de replicação em um único EcoFragmento gerado por RI. Descobrimos que o plasmídeo de resistência à tetraciclina que Chang e eu isolamos durante nossos experimentos de cisalhamento mecânico - um replicon que denominamos pSC101 (Fig. 3, Principal, pista c e Fig. 3, Meio) - tinha exatamente essas propriedades. Usando pSC101 como um vetor, fomos capazes de identificar o fragmento de DNA R6-5 específico que carrega o gene de resistência à canamicina (Fig. 3, Fundo).

Análise de DNA nos experimentos iniciais de clonagem de DNA. (Principal) Eletroforese em gel de agarose (pista a) do plasmídeo pSC102 contendo três dos múltiplos EcoFragmentos de DNA de R6-5 gerados por RI (faixa b). Lane c mostra que EcoA clivagem RI do vetor pSC101 produz um único fragmento de DNA do tamanho esperado. (Meio) Fotomicrografia eletrônica de pSC101, o primeiro plasmídeo usado com sucesso como vetor para clonagem de DNA. (Fundo) Eletroforese em gel de agarose mostrando clonagem do gene de resistência à canamicina de R6-5: (pista d) EcoDNA clivado por RI do vetor de plasmídeo pSC101, (pista c) EcoFragmentos gerados por RI de um novo plasmídeo (pSC102) que foi construído a partir de R6-5 (ver Principal) e que expressa o determinante de resistência à canamicina do replicon R6-5 parental, (pista b) mistura dos DNAs mostrados nas pistas c e d, e (pista a) EcoFragmentos gerados por RI de um novo plasmídeo (pSC105) que expressa tanto o gene de resistência à tetraciclina do vetor pSC101 quanto o gene de resistência à canamicina, que foi clonado de pSC102 ligando-o a pSC101. Principal e Fundo são da ref. 1

No início de maio, havíamos mostrado que nossos resultados de clonagem eram reproduzíveis e nos reunimos para decidir as cifras do manuscrito que estaríamos preparando. Eu esbocei o formato do papel em um caderno que às vezes tem sido referido como meu "caderno de laboratório" (57), mas que foi usado para anotar ideias e planos futuros, em vez de registrar dados experimentais. O artigo (1) foi concluído no início de junho e, após ser modificado para tratar de pequenos pontos levantados pelos revisores, foi comunicado ao PNAS pelo membro da Academia Norman Davidson.

Herb e eu tínhamos reconhecido que pequenos plasmídeos de resistência a antibióticos, como pSC101, poderiam permitir a clonagem de genes de células eucarióticas em E. coli e incluímos esta declaração na seção de discussão do nosso artigo. No entanto, qual DNA eucariótico deve ser usado para testar a noção? Não pudemos selecionar bactérias contendo DNA eucariótico clonado, e apenas alguns genes celulares de eucariotos foram purificados e caracterizados bem o suficiente para identificá-los inequivocamente em isolados bacterianos. Além disso, havia outros experimentos que cada um de nós queria fazer, e nossas prioridades eram diferentes. Herb estava ansioso para usar uma coleção de enzimas de restrição em rápida expansão para construir vetores de alto número de cópias que oferecem maior flexibilidade de locais de clonagem. A questão mais urgente para mim era saber se os híbridos de DNA contendo componentes muito diferentes derivados de espécies não relacionadas poderiam ser propagados e clonados. Nossos laboratórios trocaram ferramentas experimentais e partiram separadamente para atender às nossas diferentes prioridades.


Etapas na clonagem de genes

As 7 etapas básicas envolvidas na clonagem de genes são:

  1. Isolamento de fragmentos de DNA [gene de interesse] a serem clonados.
  2. Inserção de DNA isolado em um vetor adequado para formar DNA recombinante.
  3. Introdução de DNA recombinante em um organismo adequado conhecido como hospedeiro.
  4. Seleção de células hospedeiras transformadas e identificação do clone contendo o gene de interesse.
  5. Multiplicação / Expressão do Gene introduzido no hospedeiro.
  6. Isolamento de múltiplas cópias do gene / proteína expressa pelo gene.
  7. Purificação da cópia / proteína do gene isolado

A. Isolamento do fragmento de DNA ou gene

  • O DNA ou gene alvo a ser clonado deve ser isolado primeiro. Um gene de interesse é um fragmento de gene cujo produto (uma proteína, enzima ou um hormônio) nos interessa. Por exemplo, o gene que codifica o hormônio insulina.
  • O gene desejado pode ser isolado usando a enzima endonuclease de restrição (RE), que corta o DNA em sequências de nucleotídeos de reconhecimento específicas conhecidas como sítios de restrição em direção à região interna (portanto, endonuclease) produzindo extremidades cegas ou pegajosas.
  • Às vezes, a enzima transcriptase reversa também pode ser usada, a qual sintetiza a fita de DNA complementar do gene desejado usando seu mRNA.

B. Seleção de vetor de clonagem adequado

  • O vetor é uma molécula transportadora que pode transportar o gene de interesse (GI) para um hospedeiro, replicando-se ali junto com o GI fazendo suas múltiplas cópias.
  • Os vetores de clonagem são limitados ao tamanho da inserção que podem transportar. Dependendo do tamanho e da aplicação do inserto, o vetor adequado é selecionado.
  • Os diferentes tipos de vetores disponíveis para clonagem são plasmídeos, bacteriófagos, cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs) e cromossomos artificiais de mamíferos (MACs).
  • No entanto, os vetores de clonagem mais comumente usados ​​incluem plasmídeos e bacteriófagos (fago λ) ao lado de todos os outros vetores disponíveis.

C. Características essenciais de vetores de clonagem

Todos os vetores de clonagem são moléculas de DNA transportadoras. Essas moléculas transportadoras devem ter algumas características comuns em geral, tais como:

  • Deve ser autorreplicante dentro da célula hospedeira.
  • Deve possuir um único local de restrição para enzimas RE.
  • A introdução do fragmento de DNA doador não deve interferir com a propriedade de replicação do vetor.
  • Ele deve possuir algum gene marcador de forma que possa ser usado para posterior identificação da célula recombinante (geralmente um gene de resistência a antibióticos que está ausente na célula hospedeira).
  • Eles devem ser facilmente isolados da célula hospedeira.

D. Formação de DNA recombinante

  • O vetor plasmídeo é aberto pela mesma enzima RE usada para o isolamento do fragmento de DNA doador.
  • A mistura de fragmento de DNA doador e vetor de plasmídeo são misturados.
  • Na presença de DNA ligase, ocorre o emparelhamento de bases do fragmento de DNA do doador e do vetor plasmídeo.
  • A molécula de DNA resultante é um híbrido de duas moléculas de DNA - o GI e o vetor. Na terminologia da genética, essa mistura de diferentes fitas de DNA é chamada de recombinação.
  • Portanto, esta nova molécula de DNA híbrido também é chamada de molécula de DNA recombinante e a tecnologia é conhecida como tecnologia de DNA recombinante.

E. Transformação de vetor recombinante em hospedeiro adequado

  • O vetor recombinante é transformado em célula hospedeira adequada principalmente, uma célula bacteriana.
  • Isso é feito por um ou ambos os seguintes motivos:
    • Para replicar a molécula de DNA recombinante a fim de obter as múltiplas cópias do GI.
    • Para permitir a expressão do GI de modo que ele produza seu produto proteico necessário.
    • Algumas bactérias são naturalmente transformáveis, elas absorvem o vetor recombinante automaticamente.

    Por exemplo: Bacilo, Haemophillus, Helicobacter pylori, que são naturalmente competentes.


    Aula 16: DNA recombinante, clonagem e edição de amp

    Na palestra de hoje, o foco muda da genética pura para a genética molecular, começando com a clonagem, seguida pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e, finalmente, edição do genoma.

    Instrutor: Adam Martin

    Aula 1: Bem-vindo, Introdução.

    Aula 2: Ligação Química.

    Aula 3: Estruturas da Am.

    Aula 4: Enzimas e Meta.

    Aula 5: Carboidratos e.

    Aula 9: Remodelação da Cromatina.

    Aula 11: Células, o Simples.

    Aula 16: DNA recombinante.

    Aula 17: Genomas e DNA.

    Aula 18: SNPs e humanos.

    Aula 19: Traffickin celular.

    Aula 20: Sinalização Celular.

    Aula 21: Sinalização Celular.

    Aula 22: Neurônios, Ação.

    Aula 23: Ciclo Celular e.

    Aula 24: Células-tronco, Apo.

    Aula 27: Visualizando Lif.

    Aula 28: Visualizando Lif.

    Aula 29: Cell Imaging Te.

    Aula 32: Morte Infecciosa.

    Aula 33: Bactérias e An.

    Aula 34: Vírus e Ant.

    Aula 35: Cl reprodutivo.

    ADAM MARTIN: Tudo bem, então vamos mudar de marcha novamente hoje, e vamos deixar o tipo de genética pura e começar a falar sobre genética molecular. E eu quero começar com o conceito de - digamos que você queira identificar um pedaço de DNA, purificá-lo e propagá-lo para que você o tenha para uso futuro. E então o processo de fazer isso é conhecido como clonagem. E é o processo de, se você quiser, purificar e propagar um pedaço de DNA em um organismo.

    Assim, o objetivo desta palestra é que você saiba como, se você quiser, digamos, identificar um pedaço de DNA - talvez você esteja interessado no pedaço de DNA que contém um determinado gene. Como você faria para obter esse DNA em um estado que pode ser propagado indefinidamente? E como você pode identificar o pedaço de DNA que deseja?

    E uma ferramenta que vamos usar é uma bactéria do organismo como ferramenta. Então, vou desenhar minha célula de bactéria de amostra aqui. Pode ser algo como E. coli, apenas uma bactéria. E você deve se lembrar, quando falei sobre células algumas semanas atrás, bactérias e células procarióticas têm um cromossomo chamado nucleóide que está presente em seu interior. Então esse é o cromossomo bacteriano.

    Mas as bactérias também podem ter pedaços cromossômicos extras de DNA, chamados de plasmídeos, que existem em seu citoplasma. Estes são plasmídeos. E essas peças cromossômicas extras de DNA se replicam independentemente do cromossomo. E eles podem persistir na célula bacteriana e ser transmitidos às filhas dessa célula bacteriana à medida que as células bacterianas se dividem.

    Portanto, se nos concentrarmos em um plasmídeo individual, como seria a aparência de um plasmídeo, geralmente eles têm um cassete ou um gene que confere resistência aos antibióticos. E essa é frequentemente a razão pela qual essas bactérias estão abrigando esses plasmídeos, porque isso lhes dá uma espécie de vantagem se forem expostas a um certo antibiótico de um organismo predador. Portanto, isso conferiria resistência aos antibióticos.

    Um exemplo comum é a resistência à ampicilina, que abreviarei apenas amp com um R ao lado. Mas esses plasmídeos, para que se propaguem de célula bacteriana em célula bacteriana, também precisam ser capazes de se replicar. Portanto, eles também têm o que é conhecido como uma origem de replicação, que muitas vezes é abreviada como ori, o que basicamente permite que esse plasmídeo seja replicado de forma que cópias do plasma sejam passadas para a geração subsequente de bactérias.

    E podemos tirar vantagem desse sistema de plasmídeo em bactérias, porque podemos pegar, digamos, um pedaço de DNA estranho - e esse DNA estranho pode ser de origem eucariótica. Poderíamos pegar um pedaço de DNA eucariótico e inseri-lo dentro deste plasmídeo. E podemos basicamente usar o plasma como uma espécie de plataforma ou vetor para carregar o pedaço de DNA no qual podemos estar interessados ​​e usar a bactéria para replicar esse DNA e passá-lo para seus descendentes para que você essencialmente tenha um clone de bactérias, e você tem um clone desse DNA em uma determinada população bacteriana.

    Portanto, novamente, isso teria uma origem e talvez uma resistência à ampicilina. Então, como você determinaria se as bactérias contêm ou não um plasmídeo? Você pode pensar em um experimento que poderia fazer para determinar se a bactéria tem esse plasmídeo? Stephen?

    PÚBLICO: Você pode adicionar ampicilina e ela sobreviverá com o plasmídeo.

    ADAM MARTIN: Exatamente. Então, o que Stephen sugeriu é que, se quisesse saber se essa bactéria continha ou não o plasmídeo, ele adicionaria ampicilina à mídia. E se a bactéria não tiver o plasmídeo, ele não poderá crescer. Mas se tiver plasma, codifica esse gene que confere resistência à ampicilina e, assim, poderá crescer. Então isso é exatamente correto. Portanto, você pode selecionar bactérias com um determinado plasmídeo simplesmente cultivando-o em meio que contém um antibiótico.

    Agora quero passar pelas etapas de clonagem de um pedaço de DNA. E vamos passar por isso como uma série de etapas ordenadas para que você possa ver como o processo funciona. Vou começar com um passo para cortar o DNA. Depois de cortar o DNA, misturaremos os pedaços. Depois de misturar as peças, faremos algo conhecido como ligadura, e explicarei isso a você em apenas um minuto. E então, finalmente, terminaremos selecionando os plasmídeos que possuem o pedaço de DNA estranho que desejamos. E isso é conhecido como DNA recombinante, porque você recombinou um pedaço de DNA de um organismo - poderia ser um organismo eucariótico, como os humanos - com um pedaço de DNA que é de uma célula procariótica, uma bactéria.

    Então, temos algum tipo de processo de seleção. Então, vamos passar por isso passo a passo. E vamos começar cortando DNA, ok? Então, cortando DNA. E acabou que falamos - que tipo de enzima você acha que cortaria o DNA? Geralmente, não é tão específico quanto o que está no slide. Que tipo de enzima iria clivar o DNA? Pense em como as enzimas são nomeadas.

    ADAM MARTIN: Sim, então Stephen sugeriu DNase, o que é uma sugestão muito boa, certo? Portanto, uma enzima que cortará o DNA seria a DNase. Outra palavra para isso é nuclease. É algum tipo de nuclease. E o tipo de nuclease sobre o qual falaremos será uma endonuclease.Falamos sobre exonucleases, que mastigam DNA das extremidades no contexto da replicação do DNA.

    Mas o que é uma endonuclease, é uma nuclease que vai reconhecer um fragmento de DNA e clivá-lo no meio. Portanto, não exige um fim. Vai cortar bem no meio. E há um tipo de endonuclease, e essas são chamadas de endonucleases de restrição. Eles são nucleases que estão presentes nativamente em muitas bactérias diferentes. E essas endonucleases de restrição essencialmente olham através da sequência de DNA, e reconhecem uma sequência específica de nucleotídeos e fazem um corte direto nessa sequência.

    Portanto, tenho alguns exemplos para mostrar aqui. A primeira é esta endonuclease de restrição EcoR1. EcoR1's de E. coli, e reconhece a sequência GAATTC. Portanto, ele reconhece este seis nucleotídeos. Seqüência e cliva o DNA de fita dupla na fita superior entre o G e A e na fita inferior entre o G e A, OK? E você pode ver que os dois cortes estão escalonados. Então, quando esse corte é feito, ele deixa o DNA com duas extremidades, e elas são pegajosas, porque há uma saliência de cinco primos em cada extremidade.

    Portanto, cada extremidade tem essa sequência TTAA. E essas bases de nucleotídeos podem emparelhar com a sequência complementar. Portanto, essa sequência poderia emparelhar com uma sequência que tem um AATT final. Portanto, essas duas extremidades que gerei aqui podem grudar uma na outra, ou pode haver outras extremidades que têm a sequência TTAA que pode grudar nelas.

    Portanto, outro exemplo é esta endonuclease Kpn1. E isso é de uma bactéria diferente. Mas, novamente, ele cliva o DNA nas duas fitas. E desta vez, ele divide a fita superior mais abaixo na sequência. E isso gera o que é conhecido como saliência de três primos. Mas, novamente, você tem uma saliência. Portanto, isso é conhecido como "sticky end". Porque, novamente, esses nucleotídeos estão disponíveis para emparelhar com uma sequência complementar.

    O último tipo de enzima de restrição sobre o qual falarei é EcoR5, que é uma enzima diferente da E. coli. E isso gera uma pausa, mas desta vez, corta na mesma posição em ambas as fitas de DNA. E isso gera uma extremidade que é conhecida como extremidade cega, porque não há saliência e não há nucleotídeos que basicamente reconheceriam um tipo de extremidade complementar como as extremidades aderentes fazem, certo?

    Portanto, esses são vários dos muitos tipos diferentes de endonucleases de restrição que estão presentes em uma ampla gama de bactérias. Então, agora que você tem uma ferramenta que permite cortar o DNA, você pode cortar o DNA de duas fontes diferentes. E eu esbocei isso aqui. O vetor é o que o DNA de plasmídeo é comumente referido. Então, comumente nos referimos a esta parte procariótica do plasmídeo, o DNA vetor, e a parte que estamos tentando inserir que é o DNA estranho, a inserção. Esse é o jargão da área.

    Então aqui, eu tenho um plasmídeo. Parece um plasmídeo. Ele tem uma origem de replicação. Tem resistência à ampicilina. E tem esse site EcoR1, o que significa apenas que essa sequência de DNA tem um GAATTC, OK? Então é algo que será reconhecido por essa endonuclease de restrição. E então se você cortar essa enzima com EcoR1, você começa com a parte linear, certo? Então eu, às 6h, comecei a projetar isso aqui.

    Então, digamos que eu tenha meu DNA de plasmídeo e o corte no local EcoR1. Então eu decido. Se você dividir um círculo, terá um pedaço linear de DNA, certo? Mas tem pontas pegajosas, certo? E essas pontas pegajosas - então finja que isso é um pedaço estranho de DNA. Este é o meu DNA eucariótico. Vamos fingir que carrega o gene elastina. E isso também tem um fim. E se eles forem extremidades EcoR1, eles serão capazes de aderir às extremidades pegajosas do plasmídeo.

    E se você pegar um, agora você tem este pedaço de DNA que é dois fragmentos diferentes em conjunto. Mas vai se mover no espaço no citoplasma. E em algum ponto, ele pode ser reconhecido e ficar na outra extremidade EcoR1. E então você tem agora um pedaço circular de DNA novamente, mas agora seu pedaço circular de DNA tem esse pedaço de DNA estranho que está presente dentro do vetor, que é o tipo de fita adesiva aqui.

    Então, eu só queria te mostrar isso. Então você pode meio que - quando você está fazendo biologia molecular, você tem que imaginar o tipo de extremidade colada uma na outra e como elas irão se encaixar e se conectar para o produto final. OK, digamos que você obtenha DNA, e seu DNA poderia ser DNA eucariótico de, digamos, humanos ou moscas ou qualquer que seja seu eucarioto favorito. E no genoma desse organismo, haverá muitos sítios de restrição. Mas se você cortá-lo, obterá vários fragmentos com extremidades adesivas para EcoR1 em ambos os lados.

    E então, se você misturar o vetor e a inserção, terá alguma probabilidade de fazer com que essa inserção seja incorporada ao vetor. E então, uma vez que isso esteja presente e ligado, você pode colocá-lo nas bactérias, e ele será replicado. Então, focamos no corte, mas se você misturar isso, como eu mostrei na fita, você vai ter pontas pegajosas que se juntam e grudam.

    E você eventualmente terá uma situação em que você tem sua inserção - então você tem sua inserção aqui que pode ter seu gene de interesse e seu DNA vetorial aqui. Mas quando essas coisas inicialmente se unem, você não tem uma única molécula onde tudo está ligado covalentemente, certo? Você apenas tem essas interações de pares de bases entre as duas saliências, uma vez que elas se unem por meio de interações de pares de bases.

    Então, se pensarmos sobre o que está acontecendo aqui, você tem, inicialmente, se estivermos pensando em EcoR1, uma sequência que é-- oh, desculpe, isso deve ser um C. Esta é a sequência de nucleotídeos, mas quando está aderindo Juntas, a fita superior terá um fosfato de cinco prime livre nesta adenosina, e não haverá ligação covalente entre esta adenosina e esta guanosina. Então essa é a aparência da vertente superior. A fita inferior seria assim, onde há ligações covalentes ao longo da estrutura do DNA. Desculpa. Teve uma mutação lá.

    E isso é incorporado em uma sequência mais ampla. E esta fita inferior terá um fosfato de cinco primos livre aqui e uma hidroxila de três primos livre aqui, mas não há ligação covalente aqui. Não há ligação covalente aqui, certo? Então, neste estágio, você não tem um único pedaço de DNA. Você tem dois pedaços de DNA que estão interagindo entre si por meio de interações de pares de bases. Então, eventualmente, você quer que seja um único pedaço de DNA. E então você tem que executar uma etapa que é conhecida como - desculpe, meu fosfato atrapalhou.

    Mas você deseja realizar o que é conhecido como ligação, em que você pega algo que está apenas aderindo por meio de interações de pares de bases de nucleotídeos e adiciona um tipo de enzima, chamada DNA ligase, para catalisar a formação de ligações covalentes aqui e aqui. Portanto, a DNA ligase é uma enzima que, se você tiver um fosfato de três cinco primos aqui e uma hidroxila de três primos livre, ela catalisará a formação de uma ligação fosfodiéster entre essas duas bases e o DNA.

    Portanto, essa DNA ligase forma uma ligação fosfodiéster. E você deixa de ter nenhum vínculo para ter um vínculo. Então você eventualmente obteria esta sequência agora, onde há ligações covalentes entre cada um dos pares de bases. E o que você vê aqui é que recriou o site EcoR1. Então, quando você obtém duas extremidades adesivas EcoR1 meio que se reconhecendo e aderindo uma à outra e, em seguida, ligando-as, você recria o local da nuclease para que possa clivá-lo novamente com a enzima EcoR1.

    Então agora, seguindo em frente. Eu vou seguir em frente aqui. Então, a última etapa é que, uma vez que tenhamos pedaços de DNA com esta inserção - digamos que estamos tentando encontrar um pedaço de DNA de um organismo eucariótico. Podemos começar com um animal. Temos que extrair seu DNA cromossômico, digeri-lo com uma enzima de restrição e então digerir o vetor com a mesma enzima de restrição. E então vamos fazer - vamos inserir aleatoriamente esses pedaços de DNA em vetores diferentes, de modo que cada bactéria que obtiver um desses plasmídeos irá replicar um pedaço diferente de DNA de origem eucariótica.

    E isso é conhecido como uma biblioteca de DNA. Então, isso é fazer uma biblioteca de DNA. E uma biblioteca de DNA é essencialmente uma coleção de diferentes pedaços de DNA de alguma fonte, certo? Mas diferentes clones bacterianos replicarão uma parte diferente desse DNA. Então você pode ver que o desafio agora é encontrar a agulha no palheiro, certo? Você está tentando encontrar aquele pedaço de DNA em que está interessado.

    E falarei sobre várias estratégias que você pode usar para encontrar o pedaço de DNA no qual está interessado. Vou me concentrar na seleção. Mas, primeiro, eu só quero diferenciar entre dois tipos diferentes de maneiras pelas quais você pode pesquisar um pedaço de DNA. Você poderia fazer uma tela. E isso é semelhante ao que falamos na segunda-feira, quando você examina uma população inteira de indivíduos e procura um determinado fenótipo.

    Portanto, no caso das moscas, conversamos sobre como o laboratório de Morgan estava procurando diferenças na cor dos olhos. E essa foi uma tela, porque eles olharam através de uma tonelada de moscas normais para encontrar a que queriam. Outra estratégia seria fazer o que é chamado de seleção, onde você mata tudo o que não é o que você quer, fazendo o organismo crescer em algum tipo de condição seletiva. E então você só permite que cresçam os organismos que você deseja. Portanto, isso é chamado de seleção.

    E vou ilustrar vários exemplos de seleções, apenas para que você tenha uma ideia de como isso funciona. Portanto, o primeiro exemplo que darei é a resistência aos antibióticos. E, como Stephen gentilmente apontou no início da palestra, a maneira como podemos selecionar as bactérias que absorveram esse plasmídeo é selecionar as bactérias que crescem na presença do antibiótico. Digamos que você tenha uma população de bactérias e que comece por ser sensível a um antibiótico. Você pode transformá-los com DNA de uma cepa resistente.

    E talvez essa cepa resistente tenha um plasmídeo com um gene que confere resistência a antibióticos, caso em que, se for absorvido por essa bactéria sensível, se você cultivá-la em uma placa que contém o antibiótico, pode obter uma colônia ou um clone de células que assumiu o pedaço de DNA no qual você está interessado - neste caso, o pedaço de DNA que confere resistência a antibióticos. Todo mundo vê como isso funciona? Então, você está selecionando apenas as células para crescer aqui que adotaram esse gene de resistência a antibióticos.

    Vou usar outro exemplo agora de fermento e envolve complementação funcional. E vou começar com algo que envolve a biossíntese de um aminoácido essencial. E então vou para um caso mais interessante, que é um caso que envolve um experimento que envolveu a identificação do regulador mestre da divisão celular em humanos. Mas começaremos apenas com a biossíntese de aminoácidos.

    E existem mutantes de levedura conhecidos como auxotróficos. E essas são leveduras mutantes, ou microrganismos mutantes, que não conseguem produzir um nutriente essencial. Portanto, um auxotrófico é um mutante que não consegue produzir um nutriente essencial. Portanto, não consegue produzir um nutriente. E o oposto de um auxotrófico é chamado de prototrófico. Um prototrófico é essencialmente um microorganismo de funcionamento normal, capaz de produzir todos os nutrientes essenciais de que necessita para crescer e sobreviver, certo? Portanto, isso produz todos os nutrientes.

    E digamos que você tenha um auxotrófico para a leucina. Então você tinha uma cepa que, se não lhe desse leucina, ela não cresceria. Então, vamos começar com um auxotrófico de leucina. E digamos que você queira identificar o gene que está com defeito neste auxotrófico de leucina.

    Você executaria uma estratégia semelhante a esta, onde você teria seu auxotrófico que está transformando, portanto, seu auxotrófico aqui. E você transformaria essa cepa com DNA de qual organismo? Se você está tentando identificar o gene funcional, que organismo você usaria para produzir o DNA que vai transformar nesse organismo?

    ADAM MARTIN: Javier está exatamente certo. Você usaria o prototrofo, certo? Então, neste caso, você usaria o DNA do prototrófico, porque o prototrófico tem uma cópia funcional desse gene. Você sabe que sim, porque é capaz de crescer sem adicionar leucina. E então você poderia pegar os mutantes auxotróficos que são transformados com DNA do prototrófico e reproduzi-los na mídia. E o que deve ser propriedade da mídia? A leucina deve estar presente ou ausente? Carmen?

    ADAM MARTIN: Deve estar ausente, exatamente certo. Portanto, você olharia para placas que não têm leucina ou que não têm leucina. E você selecionaria colônias que agora de repente são capazes de desenvolver leucina. Então, você restaurou a função da biossíntese de leucina neste clone e o transformou em um prototrófico novamente.

    OK, isso é conhecido como complementação funcional, porque você está pegando uma célula que está com defeito em alguma função e está complementando. Você está complementando ou resgatando o fenótipo, ok? Agora, mesmo como um ex-geneticista de leveduras, não considero a biossíntese de aminoácidos e a complementação funcional no contexto da leucina tão estimulantes. Portanto, quero apresentar um último exemplo que envolve um experimento que envolverá os mutantes do ciclo celular de levedura.

    E vou falar sobre o experimento que levou à clonagem do regulador mestre da divisão celular em humanos. E envolve um mutante de levedura e, especificamente, um mutante do ciclo celular de levedura. E esses mutantes do ciclo celular de levedura são conhecidos como mutantes condicionais. Eles são isolados como mutantes condicionais, o que significa que esses mutantes são capazes de crescer sob certas condições, mas não em outras. E, especificamente, a condição que eles usaram é a temperatura, então eles são mutantes sensíveis à temperatura.

    As células de levedura podem crescer a 25 graus, mas não a 37 graus. Então, isso é conhecido como um mutante sensível à temperatura, onde você pode propagar o mutante em uma temperatura, mas então você pode ver se você aumenta a temperatura, então ele para de crescer. E então você pode ver o fenótipo mutante, porque a levedura funcional normal do tipo selvagem pode crescer em ambas as temperaturas. Portanto, este é um tipo especial de mutante.

    E vou contar a vocês sobre um experimento feito por Paul Nurse, que é um excelente geneticista de leveduras. E o que ele fez foi usar esses mutantes do ciclo celular de levedura para identificar o gene humano para o que agora é conhecido como quinase dependente de ciclina, ou CDK, para abreviar. Este é o regulador mestre da divisão celular em organismos que vão desde leveduras até humanos, OK? Mas ele usou a levedura como sistema modelo para identificar esse gene.

    E o processo foi ele pegou células de levedura - e Paul Nurse trabalhou em células de levedura de fissão, que são células em forma de bastão. E ele identificou mutantes de levedura. Mutantes de levedura. E ele tinha um mutante no gene CDK da levedura. Ele realmente não sabia disso na época. Mas o mutante CDK de levedura - o que ele sabia era que esse mutante estava criticamente envolvido no ciclo celular de vários tipos de levedura. Então ele sabia que este é um gene importante.

    E o que ele queria fazer era identificar se os humanos tinham um gene equivalente que pudesse funcionar da mesma maneira. Portanto, se você apenas tiver esse mutante CDK e não fizer nada com ele, ele não crescerá a 37 graus, certo? Mas o que ele fez foi pegar uma biblioteca de DNA - semelhante ao que mostrei antes, onde você simplesmente retalha o DNA de um organismo. Neste caso, ele está usando uma biblioteca de DNA humano. E ele usou um tipo específico de biblioteca, mas vou pular isso por enquanto e voltar a ela mais tarde.

    Então ele usou uma biblioteca de DNA humano. É apenas uma coleção de pedaços de DNA de origem humana, certo? Então ele está pegando DNA humano, colocando-o em um plasmídeo de levedura e transformando a levedura com aquele DNA humano. E ele está procurando por um pedaço de DNA que seja capaz de complementar o mutante CDK, o que significa que as células de levedura seriam capazes de crescer à temperatura não permissiva de 37 graus.

    Então ele procura, em um prato, colônias de fermento que estão crescendo na temperatura não permissiva de 37 graus. Então, se você não fizesse nada com esse mutante, se você não se transformasse no DNA, nada cresceria. Mas ele identificou pedaços de DNA humano que resgataram o fenótipo desse mutante, certo? E então essas são leveduras que têm o gene humano para CDK, e agora crescem.

    E este é um experimento de complementação funcional, porque você está resgatando o crescimento dessa levedura agora não com um gene de levedura, mas com um gene humano. E esse gene CDK humano é tão conservado entre os eucariotos que ainda pode funcionar em uma célula de levedura, o que é incrível. Portanto, isso apenas descreve o experimento aqui. A 25 graus, esses mutantes de levedura podem crescer e formar colônias. E nessa temperatura, você pode transformar a levedura com diferentes pedaços de DNA humano.

    A maior parte do DNA humano não será o que você deseja. Você está procurando a agulha no palheiro. Portanto, a maioria deles não vai crescer a 37 graus. Mas você está procurando por esse cara aqui que obtém o CDK humano e que restaura o crescimento dessa cepa mutante. Então voila, você tem uma colônia de células que estão crescendo. E bum, Paul Nurse ganha um Prêmio Nobel e o resto do campo de fermento também, ou várias pessoas que estão trabalhando em mutantes do ciclo celular. Este é um dos experimentos que levou ao Prêmio Nobel de 2001 para um grupo de geneticistas do ciclo celular de levedura.

    Tudo bem, então eu falei sobre como encontrar a agulha no palheiro. E isso era mais comum quando não conhecíamos a sequência do genoma de um organismo. Mas agora eu quero dizer a você como o conhecimento da sequência do genoma de um organismo permitiria a você replicar e amplificar um pedaço de DNA in vitro. Vou falar sobre uma abordagem conhecida como Reação em Cadeia da Polimerase, ou PCR.

    E o que é PCR é um método in vitro. Portanto, é uma abordagem in vitro para essencialmente amplificar o DNA. E então vamos dizer que você tem um pedaço de DNA - pode ser um pedaço de DNA no genoma - e você conhece a sequência desse DNA. E tem pares de bases entre as duas fitas. Então, normalmente, para que ocorra a replicação do DNA, do que você precisa? O que precisa acontecer aqui? Uma polimerase pode entrar agora? Não? Por que não? Milhas?

    PÚBLICO: O DNA vai-- porque eles vão tentar [INAUDÍVEL] se afastar [INAUDÍVEL] um do outro, então você tem que [INAUDÍVEL].

    ADAM MARTIN: Sim, você tem que desenrolar, certo? Então você tem que desnaturar primeiro. Então, se você faz a natureza, agora você tem dois pedaços de DNA de fita simples, certo? Agora, o que uma polimerase precisa para replicar isso? Sim, Jeremy?

    ADAM MARTIN: Um primer. Exatamente certo? E se você conhece a sequência, pode pedir a uma empresa que sintetize um primer que é a sequência exata aqui e os pares de bases aqui. E vou desenhar a extremidade dos cinco primos da cartilha bem aqui. E agora este primer tem uma hidroxila de três primos livre aqui. E se você adicionar uma polimerase, ela sintetizará esta fita inferior aqui. Portanto, isso é conhecido como primário para a frente.

    E na outra vertente, você pode projetar uma cartilha que é complementar a essas bases aqui.Mais uma vez, a extremidade do cinco primer saiu. Isso seria conhecido como o primer reverso. E então você poderia fazer com que a DNA polimerase sintetizasse a fita oposta.

    Tudo bem, então o passo aqui será primeiro desnaturar. Portanto, o primeiro passo seria derreter ou desnaturar o DNA de fita dupla. Então você desnaturaliza o DNA de fita dupla. Isso geralmente é feito acima de 90 graus Celsius. E então o próximo passo é quando você tiver esses pedaços de DNA de fita simples, você pode agir, pode ter um primer presente que se liga às fitas opostas. Assim, você pode ter recozimento de primer.

    E isso geralmente é feito entre 50 e 60 graus Celsius. Você tem que resfriá-lo para que o primer possa agora formar um par de bases, de forma que nem tudo seja desnaturado. Então você tem que resfriá-lo para que esses primers reconheçam sua sequência cognata e par de bases com ela. E depois de ter o primer recozido ao molde, você pode adicionar DNA polimerase para sintetizar uma nova fita. Assim, o DNA se polimeriza para a síntese de uma nova fita. E isso é comumente feito em torno de 70 graus Celsius.

    E então você pode repetir esse processo indefinidamente. E a cada etapa, você vai dobrar a quantidade de DNA que você tem entre esses dois primers. Deixe-me apenas-- esta é apenas uma figura ilustrando isso. Está disponível no folheto e online. Basicamente, você tem seu pedaço original de DNA de fita dupla. Você o desnaturaliza e permite que os primers se recozam. Síntese de novas fitas.

    Então você pega esses novos pedaços de DNA de fita dupla e os desnaturaliza. Os primers recozem para esses novos fios, e agora você obtém novos fios. E você continua fazendo esse ciclo indefinidamente, e essencialmente amplifica o pedaço de DNA que está entre as duas sequências de primer. Isso é frequentemente usado em perícia, porque você pode ter muito pouco DNA, e apenas adicionando primers, você pode realmente amplificar o número de pedaços de DNA que você tem entre esses dois fragmentos. Então, você passa de pouco DNA para muito DNA.

    OK, alguma pergunta sobre PCR? Vou passar para algo que - tudo bem. Eu realmente estive focado em descobertas até este ponto. Mas sei que vários de vocês são engenheiros e provavelmente desejam fazer alguma engenharia. E então eu tive que - vou falar sobre um campo que está se movendo tão rapidamente, provavelmente terei que reformular totalmente minha palestra para o próximo ano, certo? E vou falar sobre a edição do genoma.

    Então, a última parte desta história, edição do genoma ou DNA. E vou falar sobre um tipo específico de sistema chamado CRISPR-Cas9, que tem sido muito notícia, e há muito entusiasmo com essa abordagem no contexto da edição do genoma humano e, possivelmente, da cura de doenças genéticas . Quem aqui já ouviu falar do CRISPR-Cas9? Tudo bem. Isso é bom. Nossa mídia está fazendo seu trabalho.

    Então, quem sabe o que é? OK, alguns de nós sabem o que é. Eu só quero dar a vocês uma visão geral muito superficial do que é e por que é importante. E vou continuar voltando a isso ao longo do semestre, porque acho que levanta muitas questões éticas, principalmente no contexto das células-tronco. Preciso que você conheça a base antes de entrarmos nas coisas realmente boas.

    Então, vamos ver. Então, vamos projetar algo. Então, vamos falar sobre como reparar o DNA. E se quisermos editar o genoma, a maneira mais comum de fazer isso é fazendo uma quebra de fita dupla, OK? Portanto, se você fizer uma quebra de fita dupla em um pedaço de DNA, ela pode ser reparada de duas maneiras. Um é por união de extremidades não homólogas, onde os dois pedaços de DNA são basicamente unidos novamente. E isso resulta, muitas vezes, em mutações.

    Portanto, se você está tentando consertar algo, a menos que esteja apenas tentando quebrá-lo, provavelmente não é isso que você deseja. Mas uma abordagem alternativa para o reparo do DNA que os organismos têm é algo chamado reparo direcionado por homologia. Nesse caso, você pode quebrar um pedaço de DNA e adicionar um pedaço de DNA que tenha uma sequência diferente, mas com homologia perto de onde está a quebra de fita dupla. E, nesse caso, você pode substituir a sequência original com o que você fornece como DNA doador.

    Portanto, dá a você a capacidade de alterar essencialmente a sequência de DNA em um determinado locus se você for capaz de clivar o DNA em um locus específico. Então, primeiro, quero começar apenas com um experimento mental, certo? Todos vocês estão pensando, OK, precisamos clivar o DNA de fita dupla. E cara, acabei de lhe dar uma ferramenta perfeita para isso. Eu dei todas essas endonucleases de restrição, certo? Qual é o problema disso?

    Bem, vamos pensar sobre o genoma humano. O genoma humano é de 3 bilhões de pares de bases. E um site EcoR1 se parece com este-- GAATTC. Portanto, tem seis nucleotídeos de comprimento. E se você pensar em apenas uma sequência aleatória de 3 bilhões de pares de bases, você obteria essa sequência aleatoriamente uma em cada quatro até a sexta vez. Então, isso vai ser uma a cada 4.096 vezes.

    Então, se você obtiver isso no DNA 1 aleatório a cada aproximadamente 4.000 vezes, se você o usar para clivar o genoma humano, ele irá clivar centenas de milhares de lugares no genoma humano. Portanto, precisamos de muito mais especificidade se quisermos selecionar, digamos, um determinado gene que tenha um alelo causador de doença e tentar corrigi-lo. Porque se usarmos uma endonuclease de restrição, simplesmente fragmentaremos o genoma inteiro, e isso seria ruim.

    Portanto, especificidade é o nome do jogo aqui. Isso não é específico e precisamos de uma ferramenta mais específica. E essa ferramenta vai ser CRISPR-Cas9. E o que CRISPR-Cas9 é, é essencialmente uma endonuclease guiada por RNA. Portanto, é guiado por RNA e é uma endonuclease.

    Enzimas de restrição, certo, elas não têm nada a ver com o RNA. Eles não usam RNA para reconhecer a sequência de nucleotídeos. É apenas uma proteína, e a proteína reconhece a sequência de nucleotídeos. No CRISPR-Cas9, você tem uma endonuclease, que é Cas9. Vamos aumentar isso.

    Então a endonuclease é a - a Cas9 é a proteína. Essa é a endonuclease. Mas a seleção de um alvo depende de uma molécula de RNA à qual está ligado, certo? Portanto, a especificidade vem, pelo menos em parte, do que é conhecido como RNA guia, ou RNA guia único. Isso é o que é mais usado na edição do genoma.

    Portanto, este guia de RNA basicamente permite que esta enzima encontre uma sequência específica. E o RNA guia tem 20 nucleotídeos, ou procura homologia para uma sequência de pares de bases de 20 nucleotídeos. Então você pode ver que estamos indo muito melhor do que o motivo de reconhecimento de seis pares de bases. Temos 20 nucleotídeos. E existem outros componentes do sistema que aumentam a especificidade.

    Então você tem seu Cas9 em azul, que é a endonuclease, seu RNA, o RNA guia, em preto, e o modelo aqui está em cinza. E o que você vê é esse tipo de RNA exibindo complementaridade com essa sequência alvo. E somente se houver complementaridade entre o RNA e o alvo essa endonuclease será ativada e clivar neste local. Portanto, o RNA está servindo como um cão-guia para esta endonuclease para guiá-la a um determinado local para se clivar.

    A ideia, então, é se você deseja editar o genoma - e por que as pessoas estão tão animadas com isso hoje em dia é que agora você tem um sistema que pode permitir a geração de uma quebra de fita dupla em um local específico do genoma . E se você puder fazer isso, então se você fornecer DNA de um doador que talvez tenha uma sequência diferente - se você considerar um alelo de doença, certo? Digamos que você saiba que existe um gene que, quando existe um certo alelo, causa uma forma hereditária de doença.

    Você poderia então pegar DNA de um doador de um indivíduo não afetado e tirar células do indivíduo afetado e cortar o locus que é problemático e obter um reparo do alelo defeituoso usando um alelo normal do gene. E isso basicamente resgataria a função desse gene se ele fosse reintroduzido no paciente, certo? Você vê mais ou menos como isso funciona?

    Portanto, este é um tipo muito amplo e geral de estrutura conceitual de como isso pode acontecer. Digamos que você tenha um indivíduo com um distúrbio do sangue, digamos, anemia falciforme ou talassemia beta. Essas são doenças hereditárias do sangue, que levam à anemia. Você pode remover células, e o que pode ser o melhor são as células-tronco de um paciente. E você poderia então pegar essas células-tronco e usar CRISPR-Cas9 in vitro em cultura de células para editar as células desse indivíduo para reparar o defeito genético.

    E você poderia então reintroduzi-los ao paciente, onde se fossem células-tronco, eles ocupariam novamente o nicho de células-tronco e produziriam células sanguíneas funcionais que, então, essencialmente curariam o indivíduo da doença. É assim que os cientistas estão pensando sobre o uso do sistema hoje em dia. E isso ainda não foi realmente bem sucedido, mas existem vários testes clínicos em andamento, nos quais as pessoas estão tentando mostrar que isso pode ser usado para tratar doenças genéticas humanas.

    Então, no próximo ano, vocês vão ouvir mais sobre isso, quase sem dúvida, à medida que começarmos a ouvir os resultados de alguns desses pacientes. Existem preocupações sobre isso também. Eu não quero exagerar. Certamente existem preocupações. Não sabemos se isso vai funcionar. Quer dizer, as pessoas falam sobre esse tipo de coisa desde que eu era estudante há 20 anos. Mas eu sinto que estamos ficando - estamos muito mais avançados agora, e as ferramentas estão mais avançadas. E então eu sinto que estamos chegando a um ponto em que há uma chance muito maior de que isso tenha sucesso hoje em dia do que era há 20 anos.

    Só quero apontar de onde esse sistema - como foi descoberto e de onde veio. E gosto disso como exemplo. Assim como para os genes das moscas que definem as principais vias de sinalização, essa é uma descoberta que veio de pesquisas fundamentais sobre, basicamente, a ecologia das bactérias. Portanto, esse sistema CRISPR-Cas9 evoluiu essencialmente em bactérias como uma forma de corrida armamentista entre as bactérias e seus predadores, os bacteriófagos, que são vírus que infectam as bactérias.

    Portanto, esta é uma corrida armamentista entre as bactérias e seus predadores cruéis, o bacteriófago. E o que é CRISPR, de onde essas enzimas e esse sistema evoluíram, é uma forma de sistema imunológico adaptativo para bactérias, que é bastante selvagem por si só. Portanto, CRISPR é um sistema imunológico adaptativo para bactérias. Se você ainda não tomou a vacina contra a gripe, deveria tomá-la. Falaremos sobre imunidade humana no final do semestre.

    Mas é aqui que a imunidade bacteriana meio que - estou tentando entrar. Então, a maneira como isso funciona nas bactérias - o que CRISPR significa é Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Então você pode ver que graças a Deus eles deram uma sigla. Caso contrário, não estaria recebendo tanto burburinho, porque ninguém pode dizer isso.

    E então de onde veio esse CRISPR está nos cromossomos bacterianos de muitas bactérias, há esses agrupamentos de repetições palindrômicas curtas intercaladas, e as repetições são interrompidas por espaçadores. E o que os pesquisadores descobriram são que esses espaçadores têm similaridade de sequência e identidade com as sequências de bacteriófagos. Portanto, cada uma dessas sequências coloridas aqui tem algum tipo de complementaridade com algum tipo de bacteriófago.

    E então, quando um fago infecta uma bactéria, ou alguma bactéria, o que acontece é que existe um sistema para reconhecer aquele elemento genético estranho, pegar um pedaço dele e inseri-lo no genoma. E isso serve como uma memória para a bactéria lembrar que foi infectada por aquele fago específico. E então, mais tarde, o que a bactéria faz é transcrever essa região e formar esses RNAs maduros que são conhecidos como CRISPR, onde você pode ver que há alguma sequência que reconheceria um elemento genético estranho.

    Portanto, no futuro, se esse fago surgisse novamente, o que aconteceria é que um desses RNAs CRISPR reconheceria o elemento genético estranho por meio da complementaridade do par de bases e saberia cortá-lo. E depois que o alvo é cortado, ele é degradado pela célula bacteriana. Portanto, esta é uma forma de as bactérias se lembrarem dos vírus que as infectaram e de ter um mecanismo de defesa contra eles. Portanto, é um sistema muito legal.

    Você sabe, o que também é legal sobre esse sistema é que ele é um sistema imunológico adaptativo, semelhante a como reconhecemos patógenos estranhos. O que é diferente nisso é que é hereditário. É incorporado ao genoma. E quanto mais fago os descendentes dessa bactéria veem, mais dessas repetições você vê. Portanto, este é um sistema imunológico hereditário, que, infelizmente, não temos.

    Portanto, você ainda deve tomar sua vacina contra a gripe. Falaremos sobre vacinação mais tarde. Tenha alguns bons dias e vejo você na sexta-feira.


    Resumo

    A clonagem de montagem está cada vez mais substituindo os métodos convencionais de clonagem dependente de enzima de restrição e DNA-ligase por razões de eficiência e desempenho. Aqui, descrevemos o AQUA (uma montagem rápida avançada), uma abordagem de clonagem de montagem simples e versátil. Demonstramos a aplicabilidade e versatilidade da clonagem AQUA em aplicações de prova de princípio selecionadas, incluindo inserção direcionada, mutagênese pontual direcionada ao local e exclusão e clonagem combinatória. Além disso, mostramos o único pote de novo montagem de múltiplos fragmentos de DNA em um único plasmídeo circular que codifica uma operação de lógica booleana A NIMPLY B complexa regulada por luz e quimicamente. AQUA Cloning arneses intrínsecos na Vivo processamento de fragmentos lineares de DNA com regiões curtas de homologia de 16 a 32 bp mediado por Escherichia coli. Não requer kits, enzimas ou preparações de reagentes e é o protocolo de clonagem de montagem mais simples até o momento.

    Citação: Beyer HM, Gonschorek P, Samodelov SL, Meier M, Weber W, Zurbriggen MD (2015) AQUA Cloning: A Versatile and Simple Enzyme-Free Cloning Approach. PLoS ONE 10 (9): e0137652. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137652

    Editor: Dipankar Chatterji, Instituto Indiano de Ciência, ÍNDIA

    Recebido: 22 de maio de 2015 Aceitaram: 20 de agosto de 2015 Publicados: 11 de setembro de 2015

    Direito autoral: © 2015 Beyer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados

    Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão no documento e nos arquivos de informações de apoio.

    Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Iniciação e Rede (FIV) da Helmholtz Association dentro da Helmholtz Initiative on Synthetic Biology [SO-078], o Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia [FP7 / 2007-2013] / ERC [259043] -CompBioMat, a iniciativa de excelência dos governos federal e estaduais alemães [EXC 294-BIOSS, GSC 4-SGBM], a bolsa de pesquisa da Fundação Alexander von Humboldt nº 1141629 e a Fundação de pesquisa alemã (bolsa de Emmy-Noether ME3823 / 1-1).

    Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.


    Problema de subclonagem - (21 / jul / 2008)

    Estou tendo um problema que me atrapalhou por 2 semanas. Estou tentando criar um vetor de expressão clonando fragmentos de DNA de 2,7 kb, extraídos de um plasmídeo por dupla digestão enzimática, em um plasmídeo de estrutura de 7 kb, também digerido com as mesmas duas enzimas de restrição. este plasmídeo de base está conferindo resistência à canamicina. o plasmídeo resultante foi transformado em DH5alfa E. coli por choque quente e semeado em LB suplementado com 50ug / ml de canamicina. Infelizmente, não havia colônia. Eu tentei o experimento várias vezes e obtive os resultados.

    Notas:
    1-Após dupla digestão, extraí os fragmentos de desejo do gel. Mas depois da ligadura não consegui ver nenhuma banda.
    2 procedimentos: dupla digestão de cerca de 500 ng de plasmídeos. purificado por eletroforese em gel. elude em 10 ul e ligação de 3 ul de plasmídeo com 1 ul de inserção em um total de 10 ul. Transformação de 2

    10 ul de reação de ligação em DH5alfa.
    Qualquer ajuda seria apreciada.

    Verifique a competência de suas células. É suspeito que você não tenha colônias - eu esperaria pelo menos algum histórico de seu plasmídeo de backbone não cortado ou religado.

    Você também pode estar danificando seu DNA durante a visualização do gel. Certifique-se de usar UV de onda longa ou luz azul para transiluminação e minimizar a exposição aos raios UV.

    Seu tampão de ligadura também pode estar morto. Novamente, uma reação de controle diria a você.

    Obrigado pelo conselho. Vou verificar esses pontos e contar os resultados.

    Eu concordo com fago sobre controles. Eu adicionaria um extra.
    Você diz que purifica com gel, mas não vê nenhuma faixa após a ligadura. Você verifica sua purificação por gel antes da ligadura. Eu sei que é uma dor e estou supondo que você está usando um kit e eles devem funcionar, mas pode valer a pena executar 1ul de seu inserto e vetor digerido e purificado apenas para verificar novamente. Isso também permitirá que você verifique as quantidades (aproximadamente) para configurar as ligaduras.

    Tive um problema semelhante recentemente, quando tentei cortar a inserção de um plasmídeo, purificar em gel e depois clonar e não consegui fazer funcionar.

    Então eu usei PCR para amplificar minha inserção (primers flanqueando meus locais de digestão), digerida, enzima de restrição inativada, então tratada com proteinase k e sds limpei isso e pronto, minha inserção foi na primeira vez.

    Como regra geral, tento evitar a purificação de gel se possível, algumas pessoas parecem estar bem com isso, mas acho que há algum vodu envolvido & # 33

    Posso postar um método mais detalhado se você estiver interessado

    Caros,
    obrigado pela sua cooperação. Na verdade, purifiquei o vetor de backbone e a inserção por eletroforese em gel. Em seguida, as bandas desejadas foram extraídas por kit. após a extração corro 2ul de cada banda para verificar a validade da extração do gel e foi perfeito.
    Ontem, verifiquei as células competentes e o meio e não houve problema & # 12288 em ambos.
    Eu realmente gostaria de amplificar meu fragmento (insert) como stevo gentilmente sugeriu, mas não sei se está ok ou não, pois o sequenciamento do insert é importante para mim e estou com medo de alguma mutação durante a PCR.

    Aqui eu tenho uma pergunta. Eu sei que o brometo de etídio afetaria o DNA, mas você acha que é a origem do meu problema saber que executo DNA em gel com brometo de etídio?
    Obrigado por você novamente e continuarei verificando meu experimento usando mais controles como todos vocês sugeriram. Mais detalhes são bem-vindos.

    Por anos, nós adicionamos guanosina aos géis de agarose dos quais iremos extirpar um fragmento. Ele atua como um protetor UV (veja aqui).

    PCR é perfeitamente adequado para o trabalho de clonagem - basta usar uma enzima de alta fidelidade (como meu favorito, Phusion de Finnzymes)

    Quais enzimas você está usando e por quanto tempo você digeriu o vetor e insere? Muito tempo com algumas enzimas pode prejudicar a ligadura.


    Fragmento de DNA clonado - pelo menos tentando - Biologia

    O DNA recombinante é o DNA que foi criado artificialmente. O DNA de duas ou mais fontes é incorporado em uma única molécula recombinante.

    • Trate o DNA de ambas as fontes com a mesma endonuclease de restrição (BamHI neste caso).
    • BamHI corta o mesmo local em ambas as moléculas

    Para ser útil, a molécula recombinante deve ser replicada muitas vezes para fornecer material para análise, sequenciamento, etc. A produção de muitas cópias idênticas da mesma molécula recombinante é chamada de clonagem. A clonagem pode ser feita in vitro, por um processo denominado reação em cadeia da polimerase (PCR). Aqui, no entanto, examinaremos como a clonagem é feita in vivo.

    • procariotos unicelulares como E. coli
    • eucariotos unicelulares como levedura e
    • em células de mamíferos cultivadas em cultura de tecidos.

    Em todos os casos, o DNA recombinante deve ser absorvido pela célula de uma forma em que possa ser replicado e expresso. Isso é conseguido incorporando o DNA em um vetor. Vários vírus (bacterianos e de células de mamíferos) podem servir como vetores. Mas aqui vamos examinar um exemplo de clonagem usando E. coli como hospedeiro e um plasmídeo como vetor.

    • são pequenos (alguns milhares de pares de bases)
    • geralmente carregam apenas um ou alguns genes
    • são circulares
    • têm uma única origem de replicação

    Os plasmídeos são replicados pela mesma máquina que replica o cromossomo bacteriano. Alguns plasmídeos são copiados aproximadamente na mesma taxa que o cromossomo, de modo que uma única célula pode ter apenas uma única cópia do plasmídeo. Outros plasmídeos são copiados em uma taxa alta e uma única célula pode ter 50 ou mais deles.

    Genes em plasmídeos com alto número de cópias são geralmente expressos em níveis elevados. Na natureza, esses genes frequentemente codificam proteínas (por exemplo, enzimas) que protegem a bactéria de um ou mais antibióticos.

    Os plasmídeos entram na célula bacteriana com relativa facilidade. Isso ocorre na natureza e pode ser responsável pela rápida disseminação da resistência aos antibióticos em hospitais e em outros lugares. Os plasmídeos podem ser introduzidos deliberadamente em bactérias no laboratório, transformando a célula com os genes que chegam.

    • 4539 pares de bases
    • uma única origem de replicação
    • um gene (amp r) que confere resistência ao antibiótico ampicilina (um parente da penicilina)
    • uma única ocorrência da sequência
    • um fragmento de 3755 pares de bases carregando tanto o gene amp r quanto a origem de replicação
    • um fragmento de 784 pares de bases
    • ambos os fragmentos têm extremidades pegajosas
    • 4207 pares de base
    • uma única origem de replicação
    • um gene (kan r) que confere resistência ao antibiótico canamicina.
    • um único site cortado por BamHI
    • um único site cortado por HindIII
    • um fragmento de 2332 pares de bases
    • um fragmento de 1875 pares de bases com o gene kan r (mas sem origem de replicação)
    • ambos os fragmentos têm extremidades pegajosas

    Se você remover as duas enzimas de restrição e fornecer as condições para que a DNA ligase faça seu trabalho, os pedaços desses plasmídeos podem se juntar novamente (graças à complementaridade de suas extremidades adesivas).

    A mistura dos fragmentos pKAN e pAMP fornece várias (pelo menos 10) possibilidades de moléculas reunidas. Alguns deles não produzirão plasmídeos funcionais (moléculas com duas ou sem origem de replicação não podem funcionar).

    • o fragmento de pAMP de 3755 pb (com amp r e uma origem de replicação) com o
    • Fragmento pKAN de 1875 pb (com kan r)

    Seladas com DNA ligase, essas moléculas são plasmídeos funcionais capazes de conferir resistência à ampicilina e à canamicina. Eles são moléculas de DNA recombinante.

    Uma vez que o pAMP contribuiu com a origem de replicação, que permite à molécula funcionar como um plasmídeo, o pAMP é denominado vector.

    • Uma suspensão de E. coli é tratada com a mistura de moléculas de DNA religadas.
    • A suspensão é espalhada na superfície do ágar contendo ampicilina e canamicina.
    • No dia seguinte, algumas células - resistentes a ambos os antibióticos - terão crescido em colônias visíveis contendo bilhões de células transformadas.
    • Cada colônia representa um clone de células transformadas.

    No entanto, E. coli pode ser transformada simultaneamente por mais de um plasmídeo, portanto, devemos demonstrar que as células transformadas adquiriram o plasmídeo recombinante.

    A eletroforese do DNA de colônias duplamente resistentes (clones) conta a história.

    • O DNA de plasmídeo de células que adquiriram sua resistência de um plasmídeo recombinante mostra apenas as bandas 3755-pb e 1875-pb (Clone 1, faixa 3).
    • O clone 2 (pista 4) foi transformado simultaneamente por pAMP e pKAN religados. (Não podemos dizer se ele pegou a molécula recombinante também.)
    • O clone 3 (pista 5) foi transformado pela molécula recombinante, bem como por um pKAN intacto.

    Se tratarmos qualquer outra amostra de DNA, por exemplo, de células humanas, com EcoRI, serão formados fragmentos com as mesmas extremidades pegajosas. Misturado com o plasmídeo tratado com EcoRI e DNA ligase, um pequeno número de moléculas humanas será incorporado ao plasmídeo que pode então ser usado para transformar E. coli.

    Mas como detectar aqueles clones de E. coli que foram transformados por um plasmídeo carregando um pedaço de DNA humano?

    A chave é que o sítio EcoRI está dentro do gene kan r, então, quando um pedaço de DNA humano é inserido lá, a função do gene é destruída.

    Todas as células de E. coli transformadas pelo vetor, transportando ou não DNA humano, podem crescer na presença de ampicilina. Mas as células de E. coli transformadas por um plasmídeo contendo DNA humano serão incapazes de crescer na presença de canamicina.

    • Espalhe uma suspensão de E. coli tratada em ágar contendo apenas ampicilina
    • crescer durante a noite
    • com um palito de dente esterilizado, transfira uma pequena quantidade de cada colônia para um local identificado no ágar contendo canamicina
    • (faça o mesmo com outra placa de ampicilina)
    • Incubar durante a noite

    Todos os clones que continuam a crescer em ampicilina, mas não crescem em canamicina (aqui, clones 2, 5 e 8) foram transformados com um pedaço de DNA humano.


    Assista o vídeo: Clonagem de DNA e DNA recombinante. Biotecnologia. Biologia. Khan Academy (Agosto 2022).