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Otimização de PCR de transcrição reversa

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Qual é a quantidade ideal de RNA para usar na RT? e quanto cDNA usar então para o PCR?

Fiz RT com uma solução de RNA de 0,36 ug / ul. Então, para o meu PCR, usei 1 µl do cDNA obtido e usei 25 ciclos porque esperava ver uma diferença entre um nível endógeno e uma superexpressão. No entanto, não detectei nenhuma banda na altura esperada de 500 bp, mas uma banda difusa de 100 bp. O que pode representar esses 100 bp? dímero de primer? Mudei para 35 ciclos e usei a mesma quantidade de cDNA ou adicionei 3 vezes mais cDNA. Em ambos os casos, obtive bandas na altura esperada (mas mais fortes quando coloco mais cDNA) e ainda bandas grandes a 100 bp.


Também vejo grandes bandas difusas em torno de 100pb. Eles são mais prováveis Contaminação de RNA. Para se livrar deles, digira seus produtos RT-PCR com RNAse-H. Mas se você só precisa visualizar sua banda de interesse, e as bandas difusas não estão atrapalhando, não deve ser um problema.

Eu normalmente coloco de 1 a 2 µg de RNA em minha reação de RT-PCR usando o kit Invitrogen Superscript III para um volume total de 20 µl. Após a reação, eu uso 1/10 do volume desse (2 ul) para aplicações downstream (PCR). Isso geralmente me dá bons resultados.

Para otimizar o RT-PCR para detecção de um alvo específico, considere o uso de primers específicos de genes (certifique-se de usar apenas primers anti-sense) em seu RT-PCR em vez de oligo-dT ou hexâmeros aleatórios. Isso enriquece seu destino ao usá-los para aplicativos downstream. Quando você usa GSPs, porém, certifique-se de executar uma reação paralela com primers de controle (ou seja, beta actina) para provar que sua reação de RT-PCR está funcionando.


Não existe uma "quantidade ideal" única de RNA. Eu sugeriria que você fizesse uma curva de titulação para determinar a melhor quantidade para seu ensaio específico. A banda a 100 bp pode ser uma amplificação não específica. Você pode tentar aumentar ligeiramente a temperatura de recozimento para ver se isso remove (ou reduz) a banda inferior. Alternativamente, você pode considerar um conjunto de primers diferente ou até mesmo um PCR aninhado. Além disso, ainda é possível que você procure uma alternativa de emenda nessa banda. Seus primers abrangem mais de um exon?


Projeto e otimização de uma nova PCR linear após a exponencial de transcrição reversa para a detecção do vírus da febre aftosa

Mira: Um novo ensaio molecular para a detecção do vírus da febre aftosa (FMDV) foi desenvolvido usando a reação em cadeia da polimerase linear após a exponencial (LATE-PCR).

Métodos e resultados: Experimentos piloto usando alvos de DNA sintético demonstraram a capacidade do LATE-PCR para quantificar a concentração inicial do alvo por meio da detecção de endpoint. Um protocolo de duas etapas envolvendo a transcrição reversa (RT) seguida por LATE-PCR foi então usado para confirmar a capacidade do ensaio em detectar o RNA do FMDV. Finalmente, RT e LATE-PCR foram combinados em um ensaio duplex de uma etapa para co-amplificação de um segmento de RNA FMDV e um controle interno composto por um RNA blindado. Nessa forma, cada um dos primers em excesso na mistura de reação hibridiza com seus respectivos alvos de RNA durante uma curta pré-incubação, em seguida, gera fitas de cDNA durante uma etapa de RT de 3 min a 60 ° C, e o cDNA resultante é amplificado por LATE -PCR sem processamento de amostra intermediário.

Conclusões: O ensaio RT-LATE-PCR gera sinais fluorescentes no ponto final que são proporcionais ao número inicial de alvos de RNA e pode detectar uma gama de variantes de sequência usando uma única sonda tolerante a incompatibilidade.

Significado e impacto do estudo: Além de oferecer melhorias em relação aos atuais ensaios de diagnóstico molecular baseados em laboratório para FMDV, este novo ensaio é compatível com um novo dispositivo portátil ('ponto de atendimento'), o BioSeeq II, projetado para o diagnóstico rápido de febre aftosa no campo .

© 2009 os autores. Compilação do jornal © 2009 The Society for Applied Microbiology.


Conteúdo

A técnica combinada de RT-PCR e qPCR foi descrita como RT-PCR quantitativa [3] ou RT-PCR em tempo real [4] (às vezes até chamada de RT-PCR quantitativa em tempo real [5]), foi abreviada de várias maneiras como qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] e rRT-PCR. [9] Para evitar confusão, as seguintes abreviações serão usadas de forma consistente ao longo deste artigo:

Técnica Abreviação
Reação em cadeia da polimerase PCR
Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa RT-PCR
Reação em cadeia da polimerase em tempo real qPCR
Técnica combinada RT-PCR / qPCR qRT-PCR

Nem todos os autores, especialmente os anteriores, usam essa convenção e o leitor deve ser cauteloso ao seguir os links. RT-PCR tem sido usado para indicar PCR em tempo real (qPCR) e PCR de transcrição reversa (RT-PCR).

Desde a sua introdução em 1977, Northern blot tem sido usado extensivamente para quantificação de RNA, apesar de suas deficiências: (a) técnica demorada, (b) requer uma grande quantidade de RNA para detecção e (c) quantitativamente impreciso na baixa abundância de Conteúdo de RNA. [10] [11] No entanto, desde sua invenção por Kary Mullis em 1983, a RT PCR substituiu o Northern blot como o método de escolha para detecção e quantificação de RNA. [12]

RT-PCR cresceu para se tornar a tecnologia de referência para a detecção e / ou comparação de níveis de RNA por várias razões: (a) não requer processamento pós-PCR, (b) uma ampla gama (& gt10 7 vezes) de abundância de RNA pode ser medido e (c) fornece uma visão dos dados qualitativos e quantitativos. [5] Devido à sua simplicidade, especificidade e sensibilidade, o RT-PCR é usado em uma ampla gama de aplicações, desde experimentos simples como quantificação de células de levedura em vinho até usos mais complexos como ferramentas de diagnóstico para a detecção de agentes infecciosos, como a gripe aviária vírus e SARS-CoV-2. [13] [14] [15]

Em RT-PCR, o modelo de RNA é primeiro convertido em um DNA complementar (cDNA) usando uma transcriptase reversa (RT). O cDNA é então usado como um modelo para amplificação exponencial usando PCR. O uso de RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA revolucionou o estudo da expressão gênica das seguintes formas importantes:

  • Tornou teoricamente possível detectar as transcrições de praticamente qualquer gene [16]
  • Habilitou a amplificação da amostra e eliminou a necessidade de abundante material inicial necessário ao usar a análise de Northern blot [17] [18]
  • Tolerância fornecida para a degradação de RNA, desde que o RNA que abrange o primer esteja intacto [17]

RT-PCR em uma etapa vs Edição de RT-PCR em duas etapas

A quantificação de mRNA usando RT-PCR pode ser alcançada como uma reação de uma ou duas etapas. A diferença entre as duas abordagens está no número de tubos usados ​​ao realizar o procedimento. A reação em duas etapas requer que a reação da transcriptase reversa e a amplificação por PCR sejam realizadas em tubos separados. A desvantagem da abordagem em duas etapas é a suscetibilidade à contaminação devido ao manuseio mais frequente da amostra. [19] Por outro lado, toda a reação, desde a síntese de cDNA até a amplificação por PCR, ocorre em um único tubo na abordagem de uma etapa. A abordagem de uma etapa é pensada para minimizar a variação experimental, contendo todas as reações enzimáticas em um único ambiente. Elimina as etapas de pipetagem do produto de cDNA, que exige muito trabalho e pode ser contaminado, para a reação de PCR. O uso adicional de polimerases tolerantes a inibidores, intensificadores de polimerase com uma condição de RT-PCR de uma etapa otimizada, suporta a transcrição reversa do RNA de amostras não purificadas ou brutas, como sangue total e soro. [20] [21] No entanto, os modelos de RNA iniciais são propensos à degradação na abordagem de uma etapa e o uso dessa abordagem não é recomendado quando ensaios repetidos da mesma amostra são necessários. Além disso, a abordagem de uma etapa é relatada como menos precisa em comparação com a abordagem de duas etapas. É também o método preferido de análise ao usar corantes de ligação de DNA, como SYBR Green, uma vez que a eliminação de dímeros de primer pode ser alcançada por meio de uma simples mudança na temperatura de fusão. No entanto, a abordagem de uma etapa é uma solução relativamente conveniente para a detecção rápida de RNA alvo diretamente no biosenseamento. [ citação necessária ]

RT-PCR de ponto final vs RT-PCR em tempo real Editar

A quantificação de produtos RT-PCR pode ser amplamente dividida em duas categorias: ponto final e tempo real. [22] O uso de RT-PCR de ponto final é preferido para medir mudanças na expressão gênica em um pequeno número de amostras, mas o RT-PCR em tempo real tornou-se o método padrão ouro para validar resultados quantitativos obtidos a partir de análises de array ou expressão gênica mudanças em escala global. [23]

Edição de RT-PCR de ponto final

As abordagens de medição de RT-PCR de ponto final requerem a detecção de níveis de expressão gênica pelo uso de corantes fluorescentes como brometo de etídio, [24] [25] marcação P32 de produtos de PCR usando phosphorimager, [26] ou por contagem de cintilação. [18] O ponto final RT-PCR é comumente obtido usando três métodos diferentes: relativo, competitivo e comparativo. [27] [28]

RT-PCR Relativo Quantificações relativas de RT-PCR envolvem a co-amplificação de um controle interno simultaneamente com o gene de interesse. O controle interno é usado para normalizar as amostras. Uma vez normalizado, uma comparação direta de abundâncias transcritas relativas em várias amostras de mRNA pode ser feita. Uma precaução a ser observada é que o controle interno deve ser escolhido de forma que não seja afetado pelo tratamento experimental. O nível de expressão deve ser constante em todas as amostras e com o mRNA de interesse para que os resultados sejam precisos e significativos. Como a quantificação dos resultados é analisada pela comparação da faixa linear da amplificação do alvo e do controle, é crucial levar em consideração a concentração inicial das moléculas alvo e sua taxa de amplificação antes de iniciar a análise. Os resultados da análise são expressos como as razões do sinal do gene para o sinal de controle interno, cujos valores podem então ser usados ​​para a comparação entre as amostras na estimativa da expressão relativa do RNA alvo. [25] [28] [29] RT-PCR competitivo A técnica de RT-PCR competitiva é usada para quantificação absoluta. Envolve o uso de um RNA “competidor” sintético que pode ser distinguido do RNA alvo por uma pequena diferença no tamanho ou na sequência. É importante que o desenho do RNA sintético seja idêntico na sequência, mas ligeiramente mais curto do que o RNA alvo para resultados precisos. Uma vez desenhado e sintetizado, uma quantidade conhecida do RNA competidor é adicionada às amostras experimentais e é co-amplificada com o alvo usando RT-PCR. Em seguida, uma curva de concentração do RNA competidor é produzida e é usada para comparar os sinais de RT-PCR produzidos a partir dos transcritos endógenos para determinar a quantidade de alvo presente na amostra. [28] [30] RT-PCR comparativo O RT-PCR comparativo é semelhante ao RT-PCR competitivo em que o RNA alvo compete por reagentes de amplificação em uma única reação com um padrão interno de sequência não relacionada. Assim que a reação estiver completa, os resultados são comparados a uma curva padrão externa para determinar a concentração de RNA alvo. Em comparação com os métodos de quantificação relativa e competitiva, o RT-PCR comparativo é considerado o método mais conveniente de usar, uma vez que não requer que o investigador realize um experimento piloto em RT-PCR relativo, a faixa de amplificação exponencial do mRNA deve ser predeterminado e em RT-PCR competitivo, um RNA competidor sintético deve ser sintetizado. [28] [31] [32] [33] [34]

Edição RT-PCR em tempo real

O surgimento de novas técnicas de marcação de DNA fluorescente nos últimos anos permitiu a análise e detecção de produtos de PCR em tempo real e, consequentemente, levou à adoção generalizada de RT-PCR em tempo real para a análise da expressão gênica. O RT-PCR em tempo real não é apenas agora o método de escolha para quantificação da expressão gênica, mas também o método preferido para obter resultados de análises de array e expressões gênicas em escala global. Atualmente, existem quatro sondas de DNA fluorescentes diferentes disponíveis para a detecção de RT-PCR em tempo real de produtos de PCR: SYBR Green, TaqMan, faróis moleculares e sondas de escorpião. Todas essas sondas permitem a detecção de produtos de PCR gerando um sinal fluorescente. Enquanto o corante SYBR Green emite seu sinal fluorescente simplesmente ligando-se ao DNA de fita dupla em solução, a geração de fluorescência das sondas TaqMan, faróis moleculares e escorpiões dependem do acoplamento de Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) da molécula do corante e uma fração supressora para os substratos de oligonucleotídeo. [35]

SYBR Green Quando o SYBR Green se liga ao DNA de fita dupla dos produtos de PCR, ele emitirá luz durante a excitação. A intensidade da fluorescência aumenta à medida que os produtos de PCR se acumulam. Esta técnica é fácil de usar, uma vez que o projeto de sondas não é necessário devido à falta de especificidade de sua ligação. No entanto, uma vez que o corante não discrimina o DNA de fita dupla dos produtos de PCR e os dos dímeros de primer, a superestimação da concentração alvo é um problema comum. Quando a quantificação precisa for uma necessidade absoluta, devem ser realizados ensaios adicionais para a validação dos resultados. No entanto, entre os métodos de detecção de produtos RT-PCR em tempo real, o SYBR Green é o mais econômico e fácil de usar. [22] [23]

Duas estratégias são comumente empregadas para quantificar os resultados obtidos por RT-PCR em tempo real: o método da curva padrão e o método do limiar comparativo. [40]

A amplificação exponencial via reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa fornece uma técnica altamente sensível na qual um número de cópias muito baixo de moléculas de RNA pode ser detectado. O RT-PCR é amplamente utilizado no diagnóstico de doenças genéticas e, semiquantitativamente, na determinação da abundância de diferentes moléculas de RNA específicas dentro de uma célula ou tecido como uma medida da expressão gênica.

Métodos de pesquisa Editar

O RT-PCR é comumente usado em métodos de pesquisa para medir a expressão gênica. Por exemplo, Lin et al. usou qRT-PCR para medir a expressão de genes Gal em células de levedura. Primeiro, Lin et al. projetou uma mutação de uma proteína suspeita de participar da regulação dos genes Gal. Esta mutação foi hipotetizada para abolir seletivamente a expressão de Gal. Para confirmar isso, os níveis de expressão gênica de células de levedura contendo esta mutação foram analisados ​​usando qRT-PCR. Os pesquisadores foram capazes de determinar conclusivamente que a mutação dessa proteína reguladora reduziu a expressão de Gal. [41] A análise de Northern blot é usada para estudar mais a expressão do gene do RNA.

Edição de inserção de gene

O RT-PCR também pode ser muito útil na inserção de genes eucarióticos em procariotos. Como a maioria dos genes eucarióticos contém íntrons, que estão presentes no genoma, mas não no mRNA maduro, o cDNA gerado a partir de uma reação de RT-PCR é a sequência de DNA exata (sem levar em consideração a natureza propensa a erros das transcriptases reversas) que seria traduzido diretamente em proteína após a transcrição. Quando esses genes são expressos em células procarióticas para a produção ou purificação de proteínas, o RNA produzido diretamente a partir da transcrição não precisa sofrer splicing, pois o transcrito contém apenas exons. (Procariontes, como E. coli, não possuem o mecanismo de splicing de mRNA dos eucariotos).

Diagnóstico de doenças genéticas Editar

O RT-PCR pode ser usado para diagnosticar doenças genéticas, como a síndrome de Lesch-Nyhan. Esta doença genética é causada por um mau funcionamento do gene HPRT1, que clinicamente leva ao cálculo urinário fatal de ácido úrico e a sintomas semelhantes aos da gota. [6] [ esclarecimento necessário ] Analisar uma mãe grávida e um feto para os níveis de expressão de mRNA de HPRT1 revelará se a mãe é portadora e se o feto provavelmente desenvolverá a síndrome de Lesch-Nyhan. [42]

Edição de detecção de câncer

Os cientistas estão trabalhando em maneiras de usar RT-PCR na detecção do câncer para ajudar a melhorar o prognóstico e monitorar a resposta à terapia. As células tumorais circulantes produzem transcritos de mRNA exclusivos, dependendo do tipo de câncer. O objetivo é determinar quais transcritos de mRNA servem como os melhores biomarcadores para um determinado tipo de célula cancerosa e, em seguida, analisar seus níveis de expressão com RT-PCR. [43]

O RT-PCR é comumente usado no estudo de genomas de vírus cujos genomas são compostos de RNA, como o Influenzavírus A, retrovírus como HIV e SARS-CoV-2. [44]

Apesar de suas principais vantagens, o RT-PCR apresenta desvantagens. O crescimento exponencial do DNA complementar transcrito reverso (cDNA) durante os múltiplos ciclos de PCR produz uma quantificação de ponto final imprecisa devido à dificuldade em manter a linearidade. [45] A fim de fornecer detecção e quantificação precisas do conteúdo de RNA em uma amostra, o qRT-PCR foi desenvolvido usando a modificação baseada em fluorescência para monitorar os produtos de amplificação durante cada ciclo de PCR. A extrema sensibilidade da técnica pode ser uma faca de dois gumes, pois mesmo a mais leve contaminação de DNA pode levar a resultados indesejáveis. [46] Um método simples para eliminação de resultados falsos positivos é incluir âncoras, ou marcadores, na região 5 'de um primer específico de gene. [47] Além disso, o planejamento e o projeto de estudos de quantificação podem ser tecnicamente desafiadores devido à existência de numerosas fontes de variação, incluindo concentração de modelo e eficiência de amplificação. [31] A adição de uma quantidade conhecida de RNA em uma amostra, adicionando uma série de diluições de RNA gerando uma curva padrão e adicionando uma amostra sem cópia de modelo (sem cDNA) pode ser usada como controle.

O RT-PCR pode ser realizado pelo protocolo RT-PCR em uma etapa ou pelo protocolo RT-PCR em duas etapas.

Edição RT-PCR de uma etapa

A RT-PCR de uma etapa tem como alvo o mRNA (até 6 kb) para a transcrição reversa seguida pela amplificação por PCR em um único tubo de ensaio. É importante observar que o uso de RNA intacto de alta qualidade e um iniciador específico para sequência produzirá os melhores resultados.

Assim que um kit RT-PCR de uma etapa com uma mistura de transcriptase reversa, Taq DNA polimerase e uma polimerase de revisão for selecionado e todos os materiais e equipamentos necessários forem obtidos, uma mistura de reação deve ser preparada. A mistura de reação inclui dNTPs, primers, modelo de RNA, enzimas necessárias e uma solução tampão. A mistura de reação é adicionada a um tubo de PCR para cada reação, seguido pelo modelo de RNA. Os tubos PCR são então colocados em um termociclador para iniciar o ciclo. No primeiro ciclo, ocorre a síntese de cDNA. O segundo ciclo é a desnaturação inicial em que a transcriptase reversa é inativada. Os restantes 40-50 ciclos são a amplificação, que inclui desnaturação, recozimento e alongamento. Quando a amplificação estiver completa, os produtos de RT-PCR podem ser analisados ​​com eletroforese em gel. [48] ​​[49]

(Manual de Aplicações de PCR e Biotools)

Edição de RT-PCR de duas etapas

O RT-PCR em duas etapas, como o nome indica, ocorre em duas etapas. Primeiro a transcrição reversa e depois a PCR. Este método é mais sensível do que o método de uma etapa. Os kits também são úteis para RT-PCR de duas etapas. Assim como no PCR de uma etapa, use apenas RNA intacto de alta qualidade para obter os melhores resultados. O primer para PCR em duas etapas não precisa ser específico para a sequência.

Etapa um Editar

Em primeiro lugar, combine o RNA modelo, o primer, a mistura de dNTP e a água sem nuclease em um tubo de PCR. Em seguida, adicione um inibidor de RNase e transcriptase reversa ao tubo de PCR. Em seguida, coloque o tubo de PCR em um termociclador para um ciclo em que

ocorre emparelhamento, extensão e inativação da transcriptase reversa. Finalmente, prossiga diretamente para a etapa dois, que é PCR, ou armazene o produto no gelo até que a PCR possa ser realizada.

Etapa dois Editar

Adicionar master mix que contém buffer, dNTP mix, MgCl2, Taq polimerase e água sem nuclease para cada tubo de PCR. Em seguida, adicione o primer necessário aos tubos. Em seguida, coloque os tubos PCR em um termociclador por 30 ciclos do programa de amplificação. Isso inclui: desnaturação, recozimento e alongamento. Os produtos da RT-PCR podem ser analisados ​​por eletroforese em gel. [50]

O ensaio quantitativo de RT-PCR é considerado o padrão ouro para medir o número de cópias de alvos de cDNA específicos em uma amostra, mas é pouco padronizado. [51] Como resultado, embora existam inúmeras publicações utilizando a técnica, muitas fornecem detalhes experimentais inadequados e usam análise de dados inadequada para tirar conclusões inadequadas. Devido à variabilidade inerente na qualidade de quaisquer dados quantitativos de PCR, não apenas os revisores têm dificuldade em avaliar esses manuscritos, mas os estudos também se tornam impossíveis de replicar. [52] Reconhecendo a necessidade de padronização do relato de condições experimentais, as diretrizes de informações mínimas para publicação de experimentos quantitativos de PCR em tempo real (MIQE, pronuncia-se mykee) foram publicadas por um consórcio internacional de cientistas acadêmicos. As diretrizes do MIQE descrevem as informações mínimas necessárias para avaliar experimentos de PCR quantitativos que devem ser exigidos para publicação para encorajar uma melhor prática experimental e garantir a relevância, precisão, interpretação correta e repetibilidade dos dados quantitativos de PCR. [53]

Além das diretrizes de relatório, o MIQE enfatiza a necessidade de padronizar a nomenclatura associada ao PCR quantitativo para evitar confusão, por exemplo, a abreviatura qPCR deve ser usada para PCR quantitativo em tempo real e RT-qPCR deve ser usado para transcrição reversa-qPCR, e os genes usados ​​para normalização devem ser referidos como genes de referência em vez de genes de manutenção. Também propõe que termos derivados comercialmente como sondas TaqMan não devem ser usados, mas em vez disso referidos como sondas de hidrólise. Além disso, é proposto que o ciclo de quantificação (Cq) seja usado para descrever o ciclo de PCR usado para quantificação em vez do ciclo de limiar (Ct), ponto de cruzamento (Cp) e ponto de decolagem (TOP), que se referem ao mesmo valor, mas foram cunhado por diferentes fabricantes de instrumentos de tempo real. [51]

A diretriz consiste nos seguintes elementos: 1) projeto experimental, 2) amostra, 3) extração de ácido nucleico, 4) transcrição reversa, 5) informação do alvo qPCR, 6) oligonucleotídeos, 7) protocolo, 8) validação e 9) dados análise. Itens específicos dentro de cada elemento carregam um rótulo de E (essencial) ou D (desejável). Aqueles rotulados como E são considerados críticos e indispensáveis, enquanto aqueles rotulados como D são considerados periféricos, mas importantes para as melhores práticas. [53]


A otimização da PCR de transcrição reversa quantitativa para verificação de dados de cDNA microarray

A análise de cDNA microarray é altamente útil para monitorar mudanças em todo o genoma na expressão gênica que ocorrem em processos biológicos. Os padrões atuais exigem que as observações de microarranjos sejam verificadas por quantitativos (Q) -PCR ou outras técnicas. Poucos estudos otimizaram o Q-PCR para verificação de resultados de microarray. O estudo atual avaliou várias variáveis ​​que afetam a fidelidade do Q-PCR, incluindo métodos de extração de RNA, enriquecimento de mRNA, primers para transcrição reversa e métodos de detecção de amplificação de cDNA. Também foi avaliada a escolha do gene de referência no qual outras alterações de expressão gênica são baseadas. O RNA para a proteína ribossomal S28 mostrou-se ideal para esse propósito, com variação mínima na expressão entre linhagens de células isogênicas resistentes a drogas. Também descobrimos que os primers oligo (dT) foram superiores aos hexâmeros aleatórios e que o RNA extraído pelo método RNeasy deu amplificação do gene S28 consistente sem a necessidade de enriquecimento de mRNA, particularmente quando sondas TaqMan foram usadas. No entanto, a sensibilidade foi suficientemente alta com SYBR Green I que foi o método preferido e menos caro para detecção de produto de amplificação, mesmo para transcritos de baixa abundância. Usando o método ideal, 91-95% das diferenças na expressão gênica identificadas entre as linhas celulares por análise de cDNA microarray puderam ser confirmadas por Q-PCR, significativamente superior aos métodos descritos anteriormente.


Otimizando seu PCR

O PCR às vezes pode exigir a otimização das condições de reação para obter um resultado bem-sucedido. Saiba como otimizar as condições de PCR para seus experimentos usando as perguntas frequentes abaixo.

Ao otimizar as condições de PCR, quais condições são particularmente importantes?

Etapa inicial de desnaturação

O pré-aquecimento às vezes é necessário para desnaturar modelos complexos (por exemplo, DNA genômico) 94 e degC por 1 min é suficiente para a desnaturação. O tratamento com calor excessivo pode levar à inativação da enzima.

  • Para Terra PCR Direct Polymerase Mix, que é usado para amplificação por PCR direta de tecido sem extração e purificação de DNA, é necessário pré-aquecimento a 98 e degC por 2 min.
  • Para Takara LA Taq DNA polimerases e Advantage GC2 DNA polimerases, uma etapa inicial de desnaturação é necessária.
  • As enzimas PrimeSTAR não requerem pré-aquecimento para ativação enzimática.

Condições de desnaturação

As condições de desnaturação devem ser selecionadas considerando o modelo do termociclador que será usado. Uma diretriz geral é 94 & ndash95 & degC por 30 seg ou 98 & degC por 10 seg.

Se estiver usando uma enzima resistente ao calor, como uma das polimerases PrimeSTAR, recomendamos uma etapa de desnaturação de curta duração e alta temperatura (ou seja, 5 & ndash10 seg a 98 & degC).

A desnaturação a uma temperatura excessivamente alta ou por muito tempo pode resultar na perda da atividade enzimática e / ou danos aos modelos longos.

Condições de recozimento

A etapa de recozimento deve ser ajustada para cada conjunto de primer, a temperatura de recozimento depende diretamente do Tm de primers. Usar temperaturas de recozimento que são muito baixas pode resultar em malpriming e amplificação inespecífica, levando a baixos rendimentos do produto desejado.

A eficiência e a especificidade da amplificação podem ser melhoradas ajustando a temperatura de recozimento de acordo com o T do primerm ou realizando PCR em duas etapas.

  • Para Taq enzimas, o tempo de recozimento recomendado é de 30 segundos.
  • As enzimas da série PrimeSTAR têm excelente eficiência de priming. Portanto, é importante usar um tempo de recozimento curto de 5 & ndash15 seg. Tempos de recozimento excessivamente longos podem levar à amplificação não específica induzida por mispriming.
  • Ao amplificar sequências curtas menores que 1 kb, um protocolo de PCR de três etapas é recomendado. Para alvos ricos em GC ou amplificações de sequências longas (& gt10 kb), um protocolo de PCR de duas etapas é recomendado.

Etapa de extensão

Em geral, um tempo de extensão de 1 min / kb é recomendado. Ao usar as enzimas de alta velocidade SpeedSTAR HS DNA Polymerase ou SapphireAmp Fast PCR Master Mix, use uma taxa de reação de 10 s / kb de produto amplificado (ou seja, 10 s para um produto de 1 kb, 20 s para um produto de 2 kb , etc.).

PrimeSTAR Max DNA Polymerase e PrimeSTAR GXL DNA Polymerase contêm um fator de alongamento proprietário e permitem reações de alta velocidade a 5 & ndash20 s / kb. Se usar essas enzimas com amostras contendo molde em excesso, um tempo de alongamento de 1 min / kb deve ser usado.

Devo usar um protocolo de PCR de três ou duas etapas?

A PCR de três etapas inclui etapas de desnaturação, anelamento e extensão. Este tipo de protocolo deve ser usado quando o Tm dos primers é inferior à temperatura de extensão ou é inferior a 68 & degC.

Se a temperatura de fusão do primer (Tm) está perto da temperatura de extensão (72 e degC) ou alguns graus mais baixa, considere o uso de um protocolo de PCR de duas etapas que inclui uma etapa de desnaturação e uma etapa combinada de anelamento / extensão. Com este protocolo, a temperatura de recozimento não deve exceder a temperatura de extensão.

Qual extensão de temperatura devo usar, 68 ° C ou 72 ° C?

Uma temperatura de extensão de 68 ° C é preferida para PCR de duas etapas e ao amplificar modelos mais longos (& gt4 kb). Esta temperatura de extensão mais baixa melhora drasticamente os rendimentos de produtos de amplificação mais longos, reduzindo a taxa de depurinação que influencia a amplificação.

72 & degC deve ser usado como a temperatura de extensão ao realizar PCR padrão de três etapas e para amplificação de fragmentos curtos (& lt4 kb).

Qual é a quantidade ideal de molde de DNA que deve ser usada para PCR?

A quantidade ideal de modelo necessária depende da complexidade do modelo e do número de cópias da sequência alvo. Aproximadamente 10 4 cópias da sequência de DNA alvo são necessárias para detectar o produto de amplificação em 25 e 30 ciclos de PCR.

  • Normalmente, 1 µg de DNA genômico humano contém 3,04 x 10 5 moléculas de DNA. Para a maioria das aplicações de PCR, 30 & ndash100 ng de DNA genômico humano é suficiente. Alvos de alta cópia, como genes de manutenção, requerem apenas 10 ng de modelo. Os valores dos modelos para modelos de maior complexidade variam entre 10 ng e 500 ng.
  • Normalmente, 1 & microg de E. coli o DNA genômico contém 2 x 10 8 moléculas de DNA, portanto, a quantidade recomendada de molde é entre 100 pg e 1 ng.
  • Normalmente, 1 µg de DNA lambda contém 1,9 x 10 10 moléculas de DNA, portanto, a entrada do modelo pode ser tão pequena quanto 100 pg.
  • A quantidade de molde de cDNA depende do número de cópias do alvo. A entrada de cDNA é tipicamente descrita em termos de entrada de RNA equivalente. A quantidade de cDNA em uma reação de PCR pode ser tão pequena quanto 10 pg (equivalente de RNA).

É importante notar que nem todas as polimerases podem tolerar quantidades excessivas de molde. Para amostras contendo molde em excesso (até 1 µg), recomendamos PrimeSTAR GXL DNA Polymerase.

Quais são os fatores críticos para a amplificação de alvos genômicos longos?

Qualidade do modelo

A integridade do DNA é crítica para a amplificação de alvos longos. Danos no DNA, como quebra do DNA durante o isolamento ou depurinação do DNA em temperaturas elevadas e baixo pH, resultam em uma quantidade maior de produtos parciais e diminuição do rendimento geral. Danos ao DNA também podem ocorrer em condições ácidas, portanto, evite usar água para ressuspender os modelos de DNA. O DNA é mais estável em pH 7 e ndash8 ou em soluções tamponadas.

Condições de PCR

  • O tempo de desnaturação deve ser mínimo para diminuir os eventos de depurinação.
  • Use o touchdown PCR para iniciar em uma temperatura de recozimento mais alta e reduzir em dois graus por ciclo durante vários ciclos.
  • Projetar primers com temperaturas de fusão (Tm) acima de 68 e degC.

Polimerases PCR

Oferecemos várias PCR polimerases otimizadas para PCR de longo alcance. Takara LA Taq DNA polimerase, TaKaRa LA Taq Polimerase com tampão GC e PrimeSTAR GXL DNA Polimerase são recomendados dependendo do conteúdo GC e do tamanho do (s) alvo (s).

Como posso determinar se um modelo é rico em GC?

A proporção de GC varia em todo o genoma. Os modelos com conteúdo de GC & gt65% são considerados ricos em GC. As regiões ricas em GC do genoma estão principalmente concentradas em regiões regulatórias, incluindo promotores, potencializadores e elementos cis-reguladores. Tratos ricos em GC tendem a formar repetições invertidas, ou estruturas em gancho, que podem não derreter durante a etapa de recozimento da PCR. Portanto, a amplificação de modelos ricos em GC é impedida pela separação ineficiente das duas fitas de DNA. Isso resulta em amplicons truncados devido ao término prematuro da extensão da polimerase.

Quais são os fatores críticos para a amplificação de modelos ricos em GC?

Condições de PCR

  • Use temperaturas de desnaturação mais altas (por exemplo, 98 & degC em oposição a 94 & degC ou 95 & degC) para permitir a desnaturação completa do molde.
  • Mantenha os tempos de recozimento para modelos ricos em GC o mais curto possível.
  • Use primers com um T mais altom (>68°C), because annealing can occur at a higher temperature.

PCR polymerases

Use a polymerase optimized for amplification of GC-rich sequences. To find an enzyme, visit our selection guide.

Can DMSO be added to improve amplification of GC-rich templates?

We have heard from customers that improved amplification of GC-rich templates was obtained by adding DMSO to reactions using PrimeSTAR MAX DNA Polymerase or CloneAmp HiFi PCR Premix. The recommended concentration of DMSO is between 2.5% and 5%.

How can I optimize PCR conditions for AT-rich templates?

Some templates may have long AT-rich stretches that are hard to amplify under standard reaction conditions. o Plasmodium falciparum genome is about 80% AT, and regions flanking genes are often AT rich.

Polymerases recommended for GC-rich templates, such as EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR master mixes, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, are also suitable for AT-rich templates.

The advantage of having AT-rich templates is that a lower extension temperature can be used. For certain templates with AT content >80&ndash85%, the extension temperature can be lowered from 72°C to 65&ndash60°C. DNA replication at this reduced temperature appears to be reliable (Su et al. 1996).

References

Su, X. Z., et al. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574&ndash1575 (1996).

What is the role of magnesium in PCR, and what is the optimal concentration?

Magnesium is a required cofactor for thermostable DNA polymerases and is important for successful amplification. Without adequate free Mg 2+ , PCR polymerases are not active. In contrast, excess free Mg 2+ reduces enzyme fidelity and may increase nonspecific amplification. A number of factors can affect the amount of free Mg 2+ in a reaction, including DNA template concentration, chelating agents in the sample (e.g., EDTA or citrate), dNTP concentration, and the presence of proteins.

  • Some polymerases (e.g., Takara Ex Taq DNA polymerases and Takara LA Taq DNA polymerases) are supplied with a magnesium-free reaction buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2. For these enzymes, you can optimize the Mg 2+ concentration for each reaction. and Advantage 2 DNA polymerases are magnesium-tolerant polymerases that are supplied with buffers containing 3.5 mM of MgCl2.
  • The final concentration of Mg 2+ for PrimeSTAR GXL DNA Polymerase and PrimeSTAR MAX DNA Polymerase reactions is 1 mM this concentration increases fidelity for these enzymes.

What is the role of salt in PCR reactions?

Successful PCR requires that the DNA duplex separates during the denaturation step and that primers anneal to the denatured DNA. Salt neutralizes the negative charges on the phosphate backbone of DNA, stabilizing double-stranded DNA by offsetting negative charges that would otherwise repel one another. Potassium chloride (KCl) is normally used in PCR amplifications at a final concentration of 50 mM. To improve amplification of DNA fragments, especially fragments between 100 and 1,000 bp, a KCl concentration of 70&ndash100 mM is recommended. For amplification of longer products, a lower salt concentration appears to be more effective, whereas amplification of shorter products occurs optimally with higher salt concentrations. This effect is likely because high salt concentration preferentially permits denaturation of short DNA molecules over long DNA molecules.

It is important to note that a salt concentration above 50 mM can inhibit Taq polymerases.

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Process:

  • Preparação de amostra
  • Selection of primers
  • Reaction preparation
  • RT-PCR cyclic condition
  • Strand synthesis

Sample preparation:

Instead of DNA, RNA is extracted for the RT-PCR. For extracting the RNA use ready to use RNA extraction kits, it performs better and the yield of the extraction is even good.

We have to extract RNA, not DNA. Care must be taken while extraction as RNase present on every possible surface in a lab. RNase is an enzyme cleaves RNA. Here we are extracting total RNA, not mRNA for gene expression study.

Use ready to use RNA extraction kit to avoid problems in extraction. So use total RNA instead of the only mRNA.

Selection of primers:

1. Random primers:

Random primers are short single-stranded sequences of hexamers or octamers. The random primer binds at the complementary random location on the RNA. It can bind to many types of RNA (tRNA, rRNA or mRNA) and synthesizes the cDNA.

It is used in the RT-PCR particularly for the templates having a huge secondary structure. Random hexamer provides high yield cDNA. However, it can produce truncated cDNA.

The randoms primers work finely for prokaryotic DNA, rRNA, rRNA, and other smaller RNAs. But as it can’t bind to poly-A tail, it is less preferred for eukaryotic RNA amplification.

Smaller fragments of RNA can be easily amplified using randoms primers. 2 to 5 μM concentration of random primers is enough for RT-PCR. Higher concentration can make the reaction ineffective. The hexamer bindings on RNA are shown into the figure below.

2.Oligo (dT) primers:

The oligo (dT) primers are specially designed to amplify the mRNA. As we know that the mRNA has a poly-A tail, the oligo (dT) primers only bind to the poly-A tail of mRNA. Hence it is used to amplify entire mDNA into cDNA. It can even amplify smaller mRNAs as well.

The oligo (dT) primers are 12 to 18 nucleotide long single-stranded DNA which contains one additional nucleotide at the 3′ end to anchor the binding. The anchored (dT) primers prevent the primer slippage and primer denaturation from the poly-A tail.

However, the oligo (dT) primers can not synthesize RNA other than mRNA because the tRNAs, rRNAs, and micro RNA do not have the poly-A tail. 2 to 4 μM concentration of oligo (dT) primers are enough for RT-PCR, usually.

oligo (dT) primer binding on the template mRNA is shown into the figure below,

3.Sequence-specific primers:

The sequence-specific primers are commonly utilized in one-step RT-PCR to amplify a gene of interest. The sequences in the sequence-specific primers are complementary to the sequence of our interest therefore, it can’t amplify other gene regions.

Furthermore, it can only amplify a specific region, a large amount of primary template is need to perform RT-PCR using this type of primers. Due to its high sequence specificity, it is preferred more in gene expression studies.

The sequence-specific primers synthesize only certain regions from the RNA, therefore less amount is recommended to achieve success in the reaction. 0.5 to 1.5 μM concentration is enough for the RT-qPCR.

Observação: If sequence-specific primers and oligo (dT) primers both are used in a single reaction, use the only 1μM each primer.

The figure above shows the specificity of the sequence-specific primers, as it can only bind to the mRNA and cannot binds to gDNA.


Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part A

Justin M. Thomas , . Jordan L. Meier , in Methods in Enzymology , 2019

2.3.2 Reverse transcription of borohydride-treated RNA

Reverse transcription of sodium borohydride-treated ac4c results in partial incorporation of adenosine in the cDNA strand opposite the reduced ac4C. It should also be noted that reduced ac4C results in partial termination of reverse transcription at or adjacent to its location, often referred to as RT-stops ( Fig. 4 A). Of the reverse transcriptase enzymes screened by our lab TGIRT-III RT (Ingex) produces the highest proportion of full-length to stop product, as well as the most robust C-to-T signature of the RT enzymes screened by our lab ( Fig. 4 B). The following protocol describes the use of TGIRT RT for sequence-defined cDNA generation, which we have used to profile ac4C in model substrates and human 18S rRNA ( Thomas et al., 2018 ).

Dilute RNA from Section 2.2.2 to 100 pg/μL in water for use as template.

Perform TGIRT RT reactions. We typically carry out RT in 20 μL volumes in PCR tubes. Exemplary protocol: combine 4 μL 5 × TGIRT reaction buffer with 200 pg (2 μL) of template, 4 pM DNA primer, 2 μL 50 mM MgCl2 and sufficient ultra-pure water to bring the mixture to 17 μL. Note 1: TGIRT reactions are incubated at 57 °C, higher than many other commercially available reverse transcription enzymes. Therefore, it is essential to design the reverse transcription primer to form a stable duplex with the target sequence at this temperature. Note 2: Fluorophore or radiolabeled primers can be substituted at this step to assess RT stop via primer extension assay ( Fig. 4 )

Heat to 75 °C for 3 min and placed on ice for 1 min to anneal the primer and RNA.

After cooling, add 0.5 μL TGIRT-III, 0.5 μL Rnasin Plus and 100 μL 100 mM DTT. Incubate 20 min at room temperature. Initiate the reverse transcription reaction by adding 1 μL of optimized dNTP mix. In optimization studies we have found that decreasing the dGTP concentration from 500 to 250 μM increases the sensitivity of C-to-T misincorporation. Incubate the reaction for one hour at 57 °C and proceed to PCR amplification step ( Section 2.3.3 ).

Note on additional controls: We recommend performing a reverse transcription reaction in the absence of template to ensure the reagents being used are free from contaminating RNA/DNA. It is also essential to include control reactions that lack RT enzyme for each biological replicate, which allows confirmation that the PCR reaction ( Section 2.3.3 ) is amplifying only cDNA generated through reverse transcription and not contaminating gDNA from other sources.


Materiais e métodos

Sample collection

The study was approved by the Institutional Human Ethics Committee of All India Institute of Medical Sciences, Bhopal with the waiver of consent as per the “National Ethical Guidelines for Biomedical and Health Research” from Indian Council of Medical Research, a government body which makes and enforces policies of medical research in India. As per the guidelines, a waiver of consent may be granted by institutional ethics committee if the research is done on anonymized biological samples and/or the primary purpose of the research is refinement and improvement of the public health programs. As our study met both these criteria it the waiver of consent was granted. The study was conducted in 2 phases (a) pooled testing of simulated 5-sample pools, and (b) comparative evaluation of individualized and 4-sample pooled testing strategies. Nasopharyngeal and/or oropharyngeal swabs samples from COVID-19 suspects were collected by trained healthcare workers in Viral Transport Medium (VTM) and transported at 2–8°C to the Regional Virology Laboratory, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal. All samples used in this study were anonymized before being accessed by the research team. For the first phase of the study archived samples were used as described below, while the second phase was undertaken on freshly collected samples.

Simulated pooling of retrospective samples

In order to find out the relative performance of 5-sample pools comprising of varying proportions of positive and negative samples, we randomly chose 50 anonymized positive and 415 negative samples from our departmental repository collected between first week of April and second week of May 2020. These samples were accessed on May 20–27, 2020 for the experiments. We used a web-based random number generator to create simulated pools of different constitutions with positive and negative samples as depicted in Table 1 by mixing 200 μl of each sample in a microfuge tube.

Prospective consecutive pooling

For this part of the study, aliquots of 1000 consecutive samples were anonymized and processed parallelly for individualized and pooled testing in a blinded manner. To evaluate the sensitivity of pooled analysis in two different prevalence settings, 500 samples were collected in June 2020 (scenario 1) and another 500 in August 2020 (scenario 2) from the same geographical region. A total of 250 pools of 4 anonymized consecutive samples each (125 each in June and August 2020) were thus created by mixing 200 μl of each sample and tested for SARS-CoV-2 along with individual samples as described earlier [15].

RRT-PCR for COVID-19 diagnosis

RNA from the simulated pools and the samples of scenario 1 were extracted using MGI kit (BGI Biotechnology, Wuhan, China) as per the manufacturer’s protocol and subjected to COVID-19 diagnosis using Lab Gun® fluorescent rRT-PCR diagnostic kit (Lab Genomics, Suwon-si, Republic of Korea). RNA from samples collected in scenario 2 were extracted using Hi-Media Viral RNA extraction kit (Hi-Media) and rRT-PCR assays were performed using Meril Diagnostic (Vapi, India) and 3B BlackBio Biotech (Bhopal, India) as per the kit protocol.

Calculation of reduction in cost and turnaround time for COVID-19 rRT-PCR test

For calculating the expenditure of rRT-PCR test, cost of nucleic acid extraction kits RT-PCR kits and other laboratory consumables were taken in the account. In a single 96 well PCR plate 93 samples and three controls were run and total time to taken for one run was 6.5 h which included time for sample aliquoting, RNA extraction and performing the PCR.

Estatisticas

The quantification of agreement and bias between the individual Ct value and pool Ct value was determined by Bland-Altman (BA) plot. X-axis of BA plot represented mean Ct value of individual sample and pool while Y-axis represented difference in individual and pool Ct value. We estimated the agreement interval at 95% confidence interval (CI) and each x-y paired observation was colored as per the number of rRT-PCR positive sample(s) in the pool. The ‘BlandAltmanLeh’ and ‘ggplot2’ package with base R software was used to draw the plot.

In the next step the Kendell’s tau coefficient between individual Ct value and pooled Ct value was determined. The reason for choosing Kendell’s tau over other correlation measure (Pearson or Spearman measure) was influenced by the construct of the study where the estimated probability of agreeability (concordance) between the paired individual and pooled Ct value is a major concern. Kendell’s tau, being a distribution-free (independent) non-parametric quantile base measure, seems more robust in this scenario. We used ‘ggpubr’ in R for this purpose. In order to visualize the effect of number of RT-PCR positive samples in 4- and 5-sample pools on Ct value separately, we created the best fit line for nested subgroup as per number of positive samples in both 4-sample and 5-sample pools.


3. Methods

3.1. Isolation of Total RNA

Obtaining high quality and intact RNA is the first and often the most critical step in performing RT-PCR and real-time PCR. RNA is easily degraded since RNase is very hard to inactivate. Several precautions need to be taken to prevent RNA from degradation. People should always wear a clean lab coat, disposable gloves, and change gloves frequently. The bench should be clean. Any aqueous solutions, tubes, and pipettes used for the procedure should be sterile and RNAse-free. To avoid contaminating your sample with RNases, do not talk while processing RNA extraction.

Currently, there are a number of RNA isolation kits commercially available. Although it is convenient, time-saving, and avoids contact with phenol/chloroform using commercially available kits, those kits using silica-membrane spin columns may not be ideal for studies of insoluble nanoparticle since the nanoparticles may clog the membrane pore of the spin column. Therefore, it is important to choose the right reagents or kits for total RNA isolation according to different experiments and specific characteristics of different nanoparticles. In our laboratory, we use TRI Reagent to isolate total RNA for nanoparticle studies. TRI Reagent is a mixture of guanidine thiocyanate and phenol in a monophase solution, which can effectively dissolve DNA, RNA, and protein after homogenization or lysis of tissue samples. It performs well with large or small amounts of tissue or cells. Here, we describe the procedures for isolating total RNA using TRI Reagent according to the manufacturer's instructions (1).

3.1.1. Preparação de amostra

Lyse or homogenize the sample (see Notes 1𠄳).

Tissue (see Note 4): homogenize tissue samples in TRI Reagent (1 ml per 50� mg of tissue) in an appropriate homogenizer (see Notes 5 and 6). The volume of the tissue should not exceed 10% of the volume of the TRI Reagent.

Monolayer cells: lyse cells directly on the culture dish or plate (see Notes 7 and 8). Use 1 ml of the TRI Reagent per 10 cm 2 of glass culture plate surface area. After addition of the reagent, the cell lysate should be passed several times through a pipette to form a homogenous lysate (see Note 9).

Suspension cells: isolate cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min and then lyse in TRI Reagent by repeated pipetting. One milliliter of the reagent is sufficient to lyse 5� × 10 6 animal, plant, or yeast cells, or 10 7 bacterial cells (see Notes 10 and 11).

In order to minimize the possibility of DNA contamination in the RNA extracted by TRI Reagent, after homogenization, centrifuge the homogenate at 12,000 × g for 10 min at 2𠄸ଌ to remove the insoluble material (extracellular membranes, polysaccharides, and high molecular mass DNA). The supernatant contains RNA and protein. If the sample had a high fat content, there will be a layer of fatty material on the surface of the aqueous phase that should be removed. Transfer the clear supernatant to a fresh tube.

To ensure complete dissociation of nucleoprotein complexes, allow samples to stand for 5 min at room temperature.

Add 0.2 ml of chloroform (see Note 12) per ml of TRI Reagent used. Cover the sample tightly, shake vigorously for 15 s, and allow to stand for 2� min at room temperature.

Centrifuge the resulting mixture at 12,000 × g for 15 min at 2𠄸ଌ.

3.1.2. RNA Isolation

Transfer the colorless upper aqueous phase to a fresh tube and add 0.5 ml of isopropanol per ml of TRI Reagent used in Subheading 3.1.1, step 1 and mix. Allow the sample to stand for 5� min at room temperature (see Note 13).

Centrifuge at 12,000 × g for 10 min at 2𠄸ଌ. The RNA precipitate will form a pellet on the side and bottom of the tube.

Remove the supernatant and wash the RNA pellet by adding a minimum of 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRI Reagent used in sample preparation (see step 1 of Subheading 3.1.1). Vortex the sample and then centrifuge at 7,500 × g for 5 min at 2𠄸ଌ (see Notes 14 and 15).

Briefly dry the RNA pellet for 5� min by air-drying or under a vacuum (see Note 16). Add an appropriate volume of molecular grade water to the RNA pellet. To facilitate dissolution, mix by repeated pipetting with a micropipette at 55�ଌ for 10� min (see Note 17).

Measure the concentration of total RNA: in a sterile and RNase-free tube, add 48 μl of molecular grade and nuclease-free water and 2 μl of total RNA from step 3 to make a total volume of 50 μl. Mix well.

Measure the absorbance at 260 and 280 nm with a Spectrophotometer (DU 730 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (see Notes 18�). 1UMA260 unit/ml = 40 μg/ml.

3.2. Reverse Transcription

Reverse transcription involves the synthesis of DNA from RNA by using an RNA-dependent DNA polymerase, the reverse of normal transcription, which is from RNA to DNA. Although there are many kits commercially available for RT, the reverse transcriptase used in those kits usually is M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus or AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus. M-MLV reverse transcriptase is the preferred reverse transcriptase in cDNA synthesis for long messenger RNA (mRNA) templates (ϥ kb) because the RNase H activity of M-MLV reverse transcriptase is weaker than the commonly used AMV reverse transcriptase (2). Since M-MLV reverse transcriptase is less processive than AMV reverse transcriptase, therefore, more units of the M-MLV enzyme are required to generate the same amount of cDNA as in the AMV reaction (2). The following are the basic procedures for RT using M-MLV reverse transcriptase according to the manufacturer's instruction (2).

Preheat a water bath to 70ଌ.

In a sterile RNase-free 0.2 ml PCR tube, add 2 μl of Oligo (dT)18 primer (0.5 μg/μl) and 2 μg of total RNA in a total volume of 15 μl with molecular grade and nuclease-free water (total volume is 17 μl).

Put the PCR tubes which contain the primer and total RNA in a plastic PCR rack (see Note 22), then put the rack in the 70ଌ water bath for 5 min to melt secondary structures within the template.

Cool the samples immediately by putting the tubes on ice to prevent secondary structures from reforming.

In a new sterile RNase-free 0.5 ml tube, mix the following reagents according to the number of samples. Each reaction should contain: 1 μl M-MLV reverse transcriptase, 1.25 μl of 10 mM dNTP, 0.75 μl Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, and 5 μl of 5× M-MLV reaction buffer (see Notes 23 and 24). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Spin the PCR tubes from step 4 briefly to collect the solution at the bottom of the tube and put the tubes back onto the PCR rack.

Add 8 μl of the above mixture (step 5) into each PCR tube, mix gently by flicking the tube, then spin briefly. The total volume in the PCR tube should now be 25 μl.

Put the PCR tubes on to a thermal cycler and incubate at 42ଌ for 60 min (see Note 25), at 94ଌ for 5 min, then keep at 4ଌ (see Note 26).

When finished, the samples can be stored at �ଌ for later PCR experiments.

3.3. Polymerase Chain Reaction

Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase. There are many DNA polymerases commercially available. Although their efficiency may be different, they are suitable for regular RT-PCR to determine the expression level of mRNA. Some experiments which will use PCR products for cloning purposes, especially those for cloning of promoter region with high G-C content, need to use high fidelity DNA polymerase. The PCR is commonly carried out in a reaction volume of 10� μl in small reaction tubes (0.2𠄰.5 ml volumes) in a thermal cycler. The following is an example of a PCR performed in our laboratory.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM each primer, 0.5 μl of 10 mM dNTP, 5 μl of 5× Green GoTaq Buffer, 0.25 μl GoTaq DNA polymerase (5 U/μl), and 16.25 μl of nuclease-free water (total 24 μl) (see Notes 27�). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each PCR tube, add 24 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each PCR tube. Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Put the PCR tube onto a thermal cycler.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for PCR (see Notes 30�), then run.

Separate the PCR products by agarose gel electrophoresis and visualize with ethidium bromide (see Notes 35�).

After separation on an agarose gel, PCR products are visualized by Gel Doc XR ( Fig. 1 ) and analyzed by Quantity One.

mRNA expression level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) by RT-PCR. Total RNA was extracted from human monocytes U937 by using TRI Reagent and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). PCR was performed on a thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf) by using GoTaq DNA polymerase (Promega). The PCR products were separated on 1% agarose gel. Housekeeping gene GAPDH was used as internal control. M, 100 bp DNA Ladder (Fisher) (1) cells without any treatment were used as control (2) cells were treated with 5.0 μg/ml of cobalt nanoparticles for 24 h.

To semi-quantify the expression level of mRNA, intensities of target gene products are normalized to that of housekeeping gene to obtain the relative densities.

3.4. Real-Time PCR

Traditional PCR uses agarose gel for detection of PCR amplification at the final phase or endpoint of the PCR (plateau). However, real-time PCR allows for the detection of PCR amplification in the exponential growth phase of the reaction. Theoretically, there is a quantitative relationship between the amount of starting target sample and the amount of PCR product at any given cycle number. Real-time PCR detects the accumulation of amplicon during the reaction. The data is then measured at the exponential phase of the PCR, which makes quantitation of DNA and RNA easier and more precise than traditional methods. There are two methods, which are often used in the laboratory. One is the 5′ nuclease assay in which an oligonucleotide called a TaqMan® Probe is added to the PCR reagent master mix. This probe is designed to anneal to a specific sequence of template between the forward and reverse primers and is also designed with a high-energy dye termed a Reporter at the 5′ end, and a low-energy molecule termed a Quencher at the 3′ end. When this probe is intact and excited by a light source, the Reporter dye's emission is suppressed by the Quencher dye as a result of the close proximity of the dyes. When the probe is cleaved by the 5′ nuclease activity of the enzyme, the distance between the Reporter and the Quencher increases causing the transfer of energy to stop. The fluorescent emissions of the reporter increase and the quencher decrease. An increase in Reporter fluorescent signal is directly proportional to the number of amplicons generated. Another real-time PCR method is by using SYBR Green Dye, which can bind the minor groove of any double-stranded DNA molecule. When SYBR Green dye binds to double-stranded DNA, the intensity of the fluorescent emissions increases. As more double-stranded amplicons are produced, SYBR Green dye signal will increase. The following is an example of real-time PCR by using iQ™ SYBR Green Supermix and performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

Thaw all components used in step 2 at room temperature. Mix vigorously, and centrifuge to collect contents to the bottom of the tubes, then put the tubes on ice.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM of each primer, 10 μl of 2× iQ™ SYBR Green Supermix, and 7 μl of nuclease-free water (total 19 μl) (see Notes 38 and 39). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each well of 96-well PCR plate, add 19 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each well (see Note 40). Cover the plate with Microseal® 𠇋” Film (see Note 41).

Mix gently by flicking the tube, then spin the plate briefly.

Put the PCR plate in an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for real-time PCR, then run (see Notes 42�).

Analyze the data. If using SYBR Green, there should be only one peak in the melting curve ( Fig. 2 ) (see Note 45).

Real-time PCR for rabbit IL-1β. Rabbit ear skin wound tissues were used for total RNA isolation by TRI Reagent (Sigma) and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). Real-time PCR was performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad) by using 2× iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). (uma) The amplification curves (b) the melting curves. Single peak in the melting curve represents that only the real target gene is amplified (c) the PCR standard curve (Color figure online).

In our laboratory, the relative expression level of each gene is calculated as fold dilution (see Note 46) by using a standard curve for each gene. Standard curves are obtained by real-time PCR using 3, 1, and 1 μl of 10-, 100-, and 1,000-fold dilution, respectively, of cDNA obtained from sample without any treatments (see Note 47). The expression level of each gene is then normalized to the relative expression level of housekeeping gene in the same sample.


Applications and Advantages RT-PCR

Applications: The reverse transcriptase PCR analysis is used in many bio-molecular analyses.

RT-PCR is the Golden Standard test for detecting viral infections, including HIV, HPV, SARS, COVID-19 coronavirus, etc.

Diagnosis and identification of microbial diseases

RT-PCR measures viral load and expression in infections

It determines tissue-specific gene expression and measures tissue-specific mutant alleles.

Applied in cancer therapy to monitor response and prognosis to therapy

Gene therapy and gene insertion studies apply RT-PCR techniques

A simple, rapid, cost-effective, and easy to use analysis

Quantitative and qualitative analysis can be done

Requires a smaller amount of sample

Complex electrophoresis after PCR processing is not necessary

Greater specificity and sensitivity


Assista o vídeo: Reverse Transcription PCR (Agosto 2022).