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12.18: Ribossomos - Biologia

12.18: Ribossomos - Biologia



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A síntese de proteínas consome mais energia da célula do que qualquer outro processo metabólico. Cada aminoácido individual possui um grupo amino (NH2) e um grupo carboxil (COOH). Essa reação é catalisada por ribossomos e gera uma molécula de água.

Máquinas de síntese de proteínas

Além do modelo de mRNA, muitas moléculas e macromoléculas contribuem para o processo de tradução. A composição de cada componente pode variar entre as espécies; por exemplo, os ribossomos podem consistir em diferentes números de rRNAs e polipeptídeos, dependendo do organismo. No entanto, as estruturas e funções gerais da maquinaria de síntese de proteínas são comparáveis ​​das bactérias às células humanas. A tradução requer a entrada de um modelo de mRNA, ribossomos, tRNAs e vários fatores enzimáticos.

Polissomos

Mesmo antes de um mRNA ser traduzido, uma célula deve investir energia para construir cada um de seus ribossomos. No E. coli, existem entre 10.000 e 70.000 ribossomos presentes em cada célula em um determinado momento. Um ribossomo é uma macromolécula complexa composta de rRNAs estruturais e catalíticos e muitos polipeptídeos distintos. Em eucariotos, o nucléolo é completamente especializado para a síntese e montagem de rRNAs.

Os ribossomos existem no citoplasma em procariotos e no citoplasma e no retículo endoplasmático rugoso em eucariotos. As mitocôndrias e os cloroplastos também têm seus próprios ribossomos na matriz e no estroma, que se parecem mais com os ribossomos procarióticos (e têm sensibilidades semelhantes às drogas) do que os ribossomos logo fora de suas membranas externas no citoplasma. Os ribossomos se dissociam em subunidades grandes e pequenas quando não estão sintetizando proteínas e se reassociam durante o início da tradução. coli, a subunidade pequena é descrita como 30S e a subunidade grande é 50S, para um total de 70S (lembre-se de que as unidades de Svedberg não são aditivas). Os ribossomos de mamíferos têm uma pequena subunidade 40S e uma grande subunidade 60S, para um total de 80S. A subunidade pequena é responsável pela ligação ao molde de mRNA, enquanto a subunidade grande se liga sequencialmente aos tRNAs. Cada molécula de mRNA é traduzida simultaneamente por muitos ribossomos, todos sintetizando proteínas na mesma direção: lendo o mRNA de 5 'para 3' e sintetizando o polipeptídeo do terminal N para o terminal C. A estrutura completa do mRNA / poli-ribossomo é chamada de polissomo.

TRNAs

Os tRNAs são moléculas de RNA estruturais que foram transcritas de genes pela RNA polimerase III. Dependendo da espécie, 40 a 60 tipos de tRNAs existem no citoplasma. Servindo como adaptadores, tRNAs específicos se ligam a sequências no molde de mRNA e adicionam o aminoácido correspondente à cadeia polipeptídica. Portanto, os tRNAs são as moléculas que realmente “traduzem” a linguagem do RNA para a linguagem das proteínas.

Dos 64 códons de mRNA possíveis - ou combinações triplas de A, U, G e C - três especificam a terminação da síntese de proteínas e 61 especificam a adição de aminoácidos à cadeia polipeptídica. Destes 61, um códon (AUG) também codifica o início da tradução. Cada anticódon de tRNA pode emparelhar com um dos códons de mRNA e adicionar um aminoácido ou terminar a tradução, de acordo com o código genético. Por exemplo, se a sequência CUA ocorresse em um molde de mRNA no quadro de leitura adequado, ela se ligaria a um tRNA que expressa a sequência complementar, GAU, que estaria ligada ao aminoácido leucina.

Como moléculas adaptadoras de tradução, é surpreendente que os tRNAs possam caber tanta especificidade em um pacote tão pequeno. Considere que os tRNAs precisam interagir com três fatores:

  1. Eles devem ser reconhecidos pela aminoacil sintetase correta.
  2. Eles devem ser reconhecidos pelos ribossomos.
  3. Eles devem se ligar à sequência correta no mRNA.

Aminoacil ARNt sintetases

O processo de síntese do pré-tRNA pela RNA polimerase III cria apenas a porção de RNA da molécula adaptadora. O aminoácido correspondente deve ser adicionado posteriormente, uma vez que o tRNA é processado e exportado para o citoplasma. Através do processo de “carregamento” do tRNA, cada molécula de tRNA é ligada ao seu aminoácido correto por um grupo de enzimas chamadas aminoacil tRNA sintetases. Pelo menos um tipo de aminoacil tRNA sintetase existe para cada um dos 20 aminoácidos; o número exato de aminoacil tRNA sintetases varia por espécie. Essas enzimas primeiro se ligam e hidrolisam ATP para catalisar uma ligação de alta energia entre um aminoácido e monofosfato de adenosina (AMP); uma molécula de pirofosfato é expelida nesta reação. O aminoácido ativado é então transferido para o tRNA e o AMP é liberado.


A persistência de narnavírus ambigramáticos requer a tradução do quadro de leitura aberto reverso

Narnavírus são vírus de RNA detectados em diversos fungos, plantas, protistas, artrópodes e nematóides. Embora inicialmente descritos como vírus simples não segmentados de gene único que codificam RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), um subconjunto de narnavírus referido como "ambigramático" abriga uma configuração genômica única que consiste em estruturas de leitura aberta sobrepostas (ORFs) codificadas em fitas opostas . A análise filogenética apóia a seleção para manter essa organização incomum do genoma, mas faltam investigações funcionais. Aqui, estabelecemos o Culex narnavirus 1 (CxNV1) que infecta o mosquito como um modelo para investigar o papel funcional de ORFs sobrepostos na replicação de narnavírus. No CxNV1, uma ORF reversa sem homologia com proteínas conhecidas cobre quase todo o segmento de 3,2 kb que codifica o RdRp. Além disso, duas novas ORFs opostas e quase completamente sobrepostas são encontradas no segundo segmento putativo do CxNV1, o RNA "Robin" de 0,8 kb. Desenvolvemos um sistema para lançar o CxNV1 em uma linhagem de células de mosquito ingênua e, em seguida, mostramos que o RdRp funcional é necessário para a persistência de ambos os segmentos, e uma ORF reversa intacta é necessária no segmento RdRp para a persistência. A espectrometria de massa de células infectadas com CxNV1 persistentemente forneceu evidências para a tradução desta ORF reversa. Finalmente, o perfil do ribossomo produziu um padrão impressionante de pegadas para todas as quatro fitas de RNA do CxNV1 que eram distintas dos ribossomos de tradução ativa no mRNA do hospedeiro ou vírus de RNA coinfetantes. Tomados em conjunto, esses dados levantam a possibilidade de que o próprio processo de tradução seja importante para a persistência de narnavírus ambigramáticos, potencialmente protegendo o RNA viral com ribossomos, sugerindo assim uma tática viral até então não descrita para replicação e transmissão.

IMPORTÂNCIA Fundamental para a nossa compreensão dos vírus de RNA é a descrição de quais fitas de RNA são transmitidas como o genoma viral, em relação a quais codificam as proteínas virais. Os narnavírus ambigramáticos quebram o molde. Esses vírus, encontrados amplamente em fungos, plantas e insetos, têm a característica única de dois genes sobrepostos codificados em fitas opostas, compreendendo quase todo o comprimento do genoma viral. Essa extensa sobreposição não é vista em outros vírus de RNA e vem ao custo de flexibilidade evolutiva reduzida na sequência. O presente estudo é motivado por investigar os benefícios que equilibram esse custo. Mostramos pela primeira vez um requisito funcional para a configuração ambigramática do genoma em Culex narnavirus 1, o que sugere um modelo de como a tradução de ambas as fitas pode beneficiar este vírus. Nosso trabalho destaca um novo projeto para a persistência viral, distinto das estratégias definidas por definições canônicas da fita de codificação.


Links de ubiquitina suavizados para transporte intraflagelar para regular a sinalização de hedgehog

Na ausência do ligante hedgehog, o patched-1 (Ptch1) localiza-se nos cílios e evita o acúmulo ciliar e a ativação do smoothened (Smo). Após a ligação do ligante, Ptch1 é removido dos cílios, Smo é desreprimido e se acumula nos cílios, onde ativa a sinalização. Os mecanismos que regulam esses movimentos dinâmicos não são bem compreendidos, mas defeitos nos componentes de transporte intraflagelar, incluindo Ift27 e o BBSome, fazem com que Smo se acumule nos cílios sem ativação da via. Descobrimos que, na ausência de ativação da via induzida por ligante, Smo é ubiquitinado e removido dos cílios, e esse processo é dependente dos componentes Ift27 e BBSome. A ativação da sinalização de hedgehog diminui a ubiquitinação de Smo e a remoção ciliar, resultando em seu acúmulo. O bloqueio da ubiquitinação de Smo por um inibidor da ligase E1 ou pela mutação de dois resíduos de lisina na alça intracelular três faz com que Smo se acumule de forma aberrante nos cílios sem ativação da via. Esses dados fornecem um mecanismo para controlar o nível ciliar de Smo durante a sinalização de hedgehog, regulando o estado de ubiquitinação do receptor.

Resumo A sinalização de ouriço envolve o movimento dinâmico de receptores e efetores para dentro e para fora dos cílios. Descobrimos que a dinâmica de Smo é regulada por ubiquitinação, que regula sua interação com o sistema de transporte intraflagelar para controlar os níveis ciliares deste receptor.


12.18: Ribossomos - Biologia

Para você que não entende:
Leia as instruções, está tudo contado lá!

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Foi bom, mas muito fácil. Eu acho que você deveria mostrar as instruções quando o jogador clicar em "jogar", você sabe, você mostra as instruções e um botão para jogar o jogo abaixo.

E você não deve dar pontos por comer moléculas com pac-man

Eu amo isso! Maneira de tornar a educação divertida! Foi para um projeto ou apenas algo que você fez para se divertir? Porque seria um projeto de biologia matador!

Tanto por projeto quanto por diversão, na verdade. Também tirei uma boa nota!
Legal que gostou! Obrigado!

Eu pensei que estava tudo bem e não é tão complicado se você apenas ler todas as instruções.

Bom conceito, mas você torna isso muito difícil com o limite de anticódons que você pode ter quando, mesmo quando você preenche a tela com eles, eles não correspondem ao códon certo que está prestes a matá-lo. Boa ideia, só precisa de alguns consertos.

Parece que deu muito trabalho, mas não consegui descobrir como jogá-lo. Parece que você precisa de conhecimento prático de rna para jogar este jogo.

Você ao menos sabe o que são RNA?
Leia as instruções, por favor. É um jogo, você joga de acordo com as instruções.
Espero ter irritado você :)


Parte 2: Vigilância de mRNA pelo Ribossomo

00: 00: 07,22 Oi. Meu nome é Rachel Green
00: 00: 09.14 e estou na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins
00: 00: 12.01 e no Howard Hughes Medical Institute.
00: 00: 14.12 O que vou compartilhar com vocês hoje
00: 00: 15.20 é uma história do meu próprio laboratório
00: 00: 17.06 com foco em como o ribossomo,
00: 00: 18,21 em células eucarióticas,
00: 00: 19.29 identifica RNAs mensageiros ruins
00: 00: 21,24 para desencadear uma série de eventos na célula
00: 00: 24.15 que levam à degradação do produto proteico incompleto,
00: 00: 27.15 ao decaimento do RNA mensageiro,
00: 00: 29.01 e para a reciclagem do complexo ribossômico.
00: 00: 33.02 Então, quais defeitos de RNA mensageiro
00: 00: 35.02 na célula que você gostaria de monitorar?
00: 00: 36,28 Qual poderia ser o problema
00: 00: 39.00 com um determinado RNA mensageiro em uma célula eucariótica?
00: 00: 42.03 Como lembramos ao aprender sobre o processamento de mRNA,
00: 00: 44.04 sabemos que RNAs mensageiros eucarióticos
00: 00: 46.06 saem do núcleo com uma tampa
00: 00: 48.01 no seu 5 'final
00: 00: 49,08 e com uma cauda poliA na extremidade 3 ',
00: 00: 51.20 e estas são assinaturas-chave em um RNA mensageiro em células eucarióticas
00: 00: 55.08 que diz a um ribossomo
00: 00: 57.02 que esta é uma boa mensagem
00: 00: 58.13 e que este deve ser traduzido.
00: 01: 00.12 Além disso, sabemos que os RNAs mensageiros típicos
00: 01: 02.05 tem um códon de início
00: 01: 03.18 que sinaliza o início de um quadro de leitura aberto
00: 01: 05.21 e um códon de parada
00: 01: 07.24 que significa o fim de um quadro de leitura aberto,
00: 01: 09.26 e o ​​que a célula gostaria de fazer
00: 01: 11.13 começa no início e vai até o fim
00: 01: 13.07 e faça uma proteína completa.
00: 01: 15.03 Então, o que pode dar errado?
00: 01: 16.05 Bem, pode haver muitos eventos acontecendo
00: 01: 18,24 em processamento de RNA ou com mutações
00: 01: 21.01 que resultaria em um RNA mensageiro
00: 01: 22,22 que pode não ser o ideal.
00: 01: 24.20 Um exemplo que muitos de vocês podem ter ouvido falar
00: 01: 26.18 é, por exemplo, se um RNA mensageiro
00: 01: 28.22 contém um códon de terminação prematuro.
00: 01: 30,12 Ou seja, em vez de
00: 01: 32.10 tendo apenas um códon de parada no final do quadro de leitura aberto,
00: 01: 34.14 eles, por mutação de algum outro processo
00: 01: 36,22 - talvez um processo de emenda -
00: 01: 38.04 eles têm um códon de terminação que surge
00: 01: 40,28 no início do quadro de leitura aberto.
00: 01: 42.06 Incrivelmente, células eucarióticas
00: 01: 43.21 tem um mecanismo no lugar
00: 01: 45.19 para determinar se um códon de terminação
00: 01: 47.01 é o códon de terminação correto ou o códon de terminação errado.
00: 01: 50.24 E eles acionam essa sequência de eventos
00: 01: 52.08 que leva ao decaimento do RNA mensageiro.
00: 01: 54,27 Outro exemplo de um possível problema
00: 01: 57,12 com o RNA mensageiro
00: 01: 58.20 seria um RNA mensageiro clivado endonucleoliticamente.
00: 02: 00.12 Se o RNA mensageiro pegou uma clivagem
00: 02: 02.14 no meio de,
00: 02: 03.26 o ribossomo nunca alcançaria um códon de parada no final,
00: 02: 06.12 e o ribossomo ficaria preso
00: 02: 07.29 na ausência de um códon de parada
00: 02: 09.08 e a capacidade de promover o processo normal de rescisão.
00: 02: 11,27 Então, este é um RNA mensageiro
00: 02: 13.08 que a célula gostaria de se livrar e não usar novamente.
00: 02: 15.15 Ele também gostaria de se livrar daquele produto polipeptídico incompleto.
00: 02: 19.25 Um exemplo final que você pode imaginar pode acontecer
00: 02: 22,27 é que o RNA mensageiro pode não ter realmente um códon de parada,
00: 02: 25.25 através de algum evento de splicing incorreto ou alguma mutação,
00: 02: 28.02 e, nesse caso, o ribossomo
00: 02: 29.14 pode realmente percorrer todo o caminho
00: 02: 32.16 a região 3 'não traduzida desse gene
00: 02: 35.06 e encontrar uma cauda poliA.
00: 02: 37.02 PolyA codifica lisina,
00: 02: 38.16 e o ​​que está para acontecer
00: 02: 40.04 é que o ribossomo sente que está produzindo lisina-lisina-lisina-lisina,
00: 02: 42,27 e desencadeia um processo de
00: 02: 47,22 decadência e resgate na célula
00: 02: 49.08 que chamamos de decadência contínua.
00: 02: 50.21 Então, Nonsense-Mediated Decay,
00: 02: 51,27 No-Go Decay,
00: 02: 53.00 e decadência contínua
00: 02: 54.14 são provavelmente três processos relacionados
00: 02: 56.01 que são todos direcionados
00: 02: 57,26 em manter sob controle na célula u
00: 02: 59,12 RNAs mensageiros produtivos,
00: 03: 01.04 livrando-se dos RNAs mensageiros,
00: 03: 02.19 degradando o produto proteico,
00: 03: 04.02 e resgatando os ribossomos
00: 03: 05.20 para eventos de tradução subsequentes,
00: 03: 07.04 e é sobre isso que o foco da palestra de hoje será.
00: 03: 10.06 Então, como nos tornamos interessados
00: 03: 11,18 nestes processos de decadência,
00: 03: 13.20 de vigilância de mRNA?
00: 03: 14,27 Ficamos interessados
00: 03: 16,27 porque notamos na literatura
00: 03: 18.16 uma observação interessante.
00: 03: 19,28 Por vários anos,
00: 03: 21.11 estudamos o processo de rescisão
00: 03: 24.25 em sistemas eucarióticos,
00: 03: 26.17 em que um códon de parada é reconhecido
00: 03: 28.20 por fatores de terminação em células eucarióticas
00: 03: 31.02 para liberar a cadeia polipeptídica em crescimento.
00: 03: 32.27 E estudamos esses fatores
00: 03: 34.04 e como funcionam bioquimicamente
00: 03: 35,16 por vários anos.
00: 03: 37.20 Houve uma publicação que saiu do laboratório de Roy Parker, no entanto,
00: 03: 40.06 onde o laboratório de Roy foi colocado em um RNA mensageiro em levedura
00: 03: 43.06 uma estrutura de haste-loop longa
00: 03: 44,26 - tinha 34 pares de base de comprimento, esta haste -
00: 03: 48.08 e na verdade era uma estrutura tão grande
00: 03: 49.28 que nenhum ribossomo poderia passar por ele facilmente.
00: 03: 53.10 E o que o laboratório de Roy observou
00: 03: 55.08 foi que este RNA mensageiro
00: 03: 58.00 foi direcionado para decadência na célula eucariótica
00: 03: 59,22 em um processo que ele chamou de No-Go-Decay,
00: 04: 01.12 porque o ribossomo não consegue passar,
00: 04: 03.19 mas a observação principal neste estudo
00: 04: 06.06 foi que esse processo de decaimento do mRNA
00: 04: 07.21 era dependente de duas proteínas,
00: 04: 09.05 Dom34 e Hbs1,
00: 04: 11.24 que se revelaram homólogos
00: 04: 13,26 dos fatores de terminação eucariótica
00: 04: 16,06 eRF1 e eRF3
00: 04: 17,24 que estávamos estudando,
00: 04: 19.08 e estávamos estudando bioquimicamente.
00: 04: 21.08 Então, este parecia ser um insight importante,
00: 04: 22,16 porque o que sugeria
00: 04: 24.06 foi o reconhecimento de um RNA mensageiro ruim
00: 04: 26.10 é, na verdade, impulsionado pelo ribossomo, como você pode suspeitar,
00: 04: 28.09 porque o ribossomo deve ser a enzima,
00: 04: 31,15 ou o catalisador, ou a macromolécula,
00: 04: 34.10 que decide se uma mensagem é boa ou não.
00: 04: 36.00 Parecia uma ideia muito lógica
00: 04: 37.12 que o ribossomo é o que determina
00: 04: 39.08 se um RNA mensageiro é bom ou ruim.
00: 04: 40,22 Devo traduzir ou não?
00: 04: 43,16 E foi aí que o nosso trabalho começou.
00: 04: 46.12 Sabíamos que Dom34 era um homólogo de eRF1
00: 04: 48.10 e isso é destacado por esta visão estrutural aqui.
00: 04: 50.18 Havia estruturas conhecidas de eRF1 e Dom34.
00: 04: 53,24 eRF1, no reconhecimento de códons de parada,
00: 04: 55.16 tem um motivo de reconhecimento de códon aqui
00: 04: 57.21 chamado de domínio NIKS,
00: 04: 59.21 e no topo, interagindo com a grande subunidade do ribossomo,
00: 05: 02.17 é um motivo tri-aminoácido, um motivo GGQ,
00: 05: 06.01 que é responsável pela catálise da liberação do peptídeo.
00: 05: 09.17 Vemos que Dom34 tem domínios semelhantes.
00: 05: 12.08 Este domínio está claramente relacionado a este domínio
00: 05: 14,16 - você pode ver isso em termos de planilhas beta
00: 05: 16.01 e as hélices alfa.
00: 05: 18.02 No entanto, está faltando este domínio com o motivo GGQ
00: 05: 20.18 que seria responsável pela liberação da cadeia polipeptídica em crescimento.
00: 05: 24.06 Vemos que também há
00: 05: 25.29 sem motivo de reconhecimento de códon,
00: 05: 27.10 mas a outra característica que eles têm em comum
00: 05: 29.10 é que eles têm este domínio, aqui,
00: 05: 30.29 que é conhecido por interagir com as GTPases
00: 05: 33.05 que são essenciais para a etapa de rescisão.
00: 05: 35.08 Então, este foi o nosso ponto de partida.
00: 05: 36.29 Tínhamos uma proteína que parecia
00: 05: 38.26 estava relacionado a um fator de rescisão,
00: 05: 40.08 e suspeitamos que devemos envolver o ribossomo,
00: 05: 42.08 e tínhamos as ferramentas bioquímicas
00: 05: 44.00 que queríamos usar para fazer perguntas
00: 05: 46.00 sobre o que Dom34 pode fazer
00: 05: 47.20 a fim de provocar a decadência do RNA mensageiro
00: 05: 49.20 que o laboratório de Roy Parker observou.
00: 05: 52.20 Então, com essas ideias em mente,
00: 05: 53.28 o que fizemos foi incorporar Dom34 e Hbs1,
00: 05: 57.20 estes homólogos dos fatores de terminação,
00: 05: 59.19 para o que estava em nosso laboratório,
00: 06: 02.08 que é um sistema de tradução reconstituído in vitro
00: 06: 05.07 da levedura Saccharomyces cerevisiae.
00: 06: 09.15 Em nosso laboratório, no freezer,
00: 06: 11.00, purificamos os componentes do ribossomo,
00: 06: 12.24 as subunidades pequenas e grandes do ribossomo.
00: 06: 14,17 Tínhamos tRNAs, RNAs mensageiros,
00: 06: 17.11, tivemos cinco fatores-chave de iniciação
00: 06: 19.04 que o laboratório de John Lorisher mostrou ser essencial
00: 06: 21.07 para iniciação in vitro
00: 06: 23.17 em um códon AUG
00: 06: 24.26 e obter esse tRNA iniciador no ribossomo,
00: 06: 27.17 tínhamos fatores de alongamento,
00: 06: 28.20 tivemos fatores de rescisão,
00: 06: 29.28 e a essa lista adicionamos Dom34 e Hbs1.
00: 06: 33.19 O que esse sistema reconstituído nos permite fazer
00: 06: 35.28 é formar complexos de ribossomo
00: 06: 38.02 com vários RNAs mensageiros
00: 06: 39.18 especificando vários peptídeos
00: 06: 44.24 e outras etapas no sistema de tradução.
00: 06: 46.12 Podemos colocar, por exemplo,
00: 06: 47.21 um códon de parada no sítio de aminoacil do ribossomo
00: 06: 49,15 para ser reconhecido por um fator,
00: 06: 50.16 ou podemos colocar um códon sentido,
00: 06: 52.05 e podemos acompanhar a atividade desses complexos.
00: 06: 55.07 Aqui está uma bola azul
00: 06: 56,28 para a cadeia polipeptídica em crescimento,
00: 06: 58.02 que significa que podemos rotular
00: 07: 00.08 os substratos de tRNA,
00: 07: 01.14 podemos rotular os tRNAs,
00: 07: 02.20 podemos rotular os aminoácidos,
00: 07: 04.03 podemos rotular os RNAs mensageiros,
00: 07: 05.10 podemos rotular os ribossomos,
00: 07: 07.03 e podemos seguir o destino de vários componentes do sistema
00: 07: 09.29 para perguntar sobre reações bioquímicas.
00: 07: 12,22 E foi isso que fizemos,
00: 07: 14,24 e vou mostrar um exemplo
00: 07: 16.08 de uma reação bioquímica que realizamos
00: 07: 18.04 para aprender algo
00: 07: 19.26 sobre a função Dom34 e Hbs1,
00: 07: 22.06 entendendo que esses fatores
00: 07: 23.23 realmente tinha acabado de ser implicado na decadência do mRNA
00: 07: 25.17 e, realmente, não era conhecido
00: 07: 27.15 o que eles podem fazer no ribossomo.
00: 07: 28,28 Então, o que fizemos neste caso
00: 07: 30.16 é que usamos nosso sistema bioquímico
00: 07: 31.28 para reconstituir dois complexos de ribossomos diferentes.
00: 07: 34.08 Para o da esquerda,
00: 07: 37.00 o que fizemos foi formar um complexo,
00: 07: 38.20 um dipeptidil-tRNA,
00: 07: 39.21 onde temos dois aminoácidos em um tRNA no sítio P
00: 07: 42.06 - chegamos lá iniciando e alongando
00: 07: 44,28 para uma rodada de síntese de proteínas -
00: 07: 46.18 e no site A colocamos um códon de parada,
00: 07: 48,03 mas acaba não importando.
00: 07: 49,15 E neste complexo
00: 07: 51.14 vemos que o aminoácido está marcado.
00: 07: 52,24 Então, no metionil-tRNA,
00: 07: 54.02 a metionina carrega um rótulo radioativo.
00: 07: 56.17 Formamos um complexo semelhante do outro lado, aqui,
00: 07: 59.05 mas, neste caso, o próprio tRNA
00: 08: 01.01 é marcado radioativamente
00: 08: 02.08 e podemos seguir o tRNA
00: 08: 03,24 em vez dos aminoácidos.
00: 08: 06.20 Neste caso,
00: 08: 07.28 o que fizemos foi pegar esses complexos,
00: 08: 09.06 estes grandes complexos marcados com ribossomas
00: 08: 10.22 com etiquetas em locais diferentes,
00: 08: 12.24 e os aplicamos em um gel nativo.
00: 08: 14,16 Um gel nativo permite que eles corram
00: 08: 16.10 mais ou menos intacta
00: 08: 17.12 com todos os seus componentes lá.
00: 08: 18.28 E perguntamos para onde foi a gravadora.
00: 08: 21.02 Então, no topo do gel,
00: 08: 22.12; o complexo de ribossomo intacto é executado
00: 08: 23,26 aqui na posição 80S.
00: 08: 26.10 E o que vemos é que, na ausência de quaisquer fatores
00: 08: 28.19 ele funciona como um grande complexo 80S.
00: 08: 30,27 No entanto, quando adicionamos eRF1 e eRF3
00: 08: 32.20 - os fatores de rescisão conhecidos -
00: 08: 34.08 exatamente o que esperaríamos que acontecesse,
00: 08: 36.13 que é, no caso aqui
00: 08: 38,27 onde estamos seguindo o peptídeo,
00: 08: 40.06 liberamos o peptídeo,
00: 08: 41,24 o dipeptídeo Met-Phe.
00: 08: 44.08 Considerando que, à direita aqui,
00: 08: 45.15 onde temos um tRNA que foi rotulado,
00: 08: 46.28 o que acontece é que o tRNA é gerado aqui
00: 08: 50.01 - este é um tRNA desacilado
00: 08: 51.12 sem os aminoácidos.
00: 08: 53.14 Então, este é o produto lançado com fatores de rescisão.
00: 08: 56.04 Em seguida, perguntamos o que aconteceu
00: 08: 57,23 quando adicionamos Dom34 e Hbs1,
00: 08: 59.04 esses fatores que parecem desempenhar um papel
00: 09: 00.26 na vigilância de mRNA,
00: 09: 02.03 mas não sabemos o que eles fazem no ribossomo,
00: 09: 03.19 e vimos o aparecimento de uma banda diferente,
00: 09: 05.21 aqui - não uma banda de peptídeo -
00: 09: 07.23 e uma banda diferente, aqui
00: 09: 09.10 - não é uma banda de tRNA desacilada.
00: 09: 11,28 E o que raciocinamos na época
00: 09: 14,16 quando vimos uma banda que era comum
00: 09: 15,26 para esses dois complexos diferentes,
00: 09: 18.06, mas diferente do resultado
00: 09: 20,14 da reação com eRF1 e eRF3
00: 09: 22,28 é que raciocinamos que poderia ser um peptidil-tRNA.
00: 09: 25.04 Isso de fato o que estava acontecendo
00: 09: 26.26 foi aquele Dom34 e Hbs1,
00: 09: 28.05 ao interagir com esses complexos de ribossomos,
00: 09: 29,27 estava realmente resultando no lançamento
00: 09: 32.07 de todo o complexo peptidil-tRNA,
00: 09: 34.12 e pudemos confirmar que
00: 09: 36.04 ao adicionar um reagente diferente conhecido como peptidil hidrolase,
00: 09: 38.12 que libera, então, peptídeo livre
00: 09: 40,12 ou tRNA livre.
00: 09: 41.22 Portanto, esta foi uma reação bioquímica fundamental
00: 09: 43,28 que usamos para identificar
00: 09: 46.10 uma nova atividade para as proteínas Dom34 e Hbs1,
00: 09: 49,22 e esta atividade sugerida
00: 09: 52.22 aquela parte do que essas proteínas estavam fazendo
00: 09: 54.08 é que eles estavam reconhecendo ribossomos
00: 09: 55.16 e eles estavam facilitando algum evento desestabilizador
00: 09: 58,24 que levou ao lançamento
00: 10: 00.12 de um peptidil-tRNA do ribossomo.
00: 10: 03.01 Então, este foi o início de uma história bioquímica
00: 10: 05.05 e esta é uma espécie de resumo da história.
00: 10: 07.21 O que descobrimos ao longo do tempo
00: 10: 09.03 era um complexo de ribossomo,
00: 10: 11.04 quando apresentado com Dom34 e Hbs1.
00: 10: 13.18 o que, na verdade, Dom34 e Hbs1 fizeram
00: 10: 16.10 foi efetivamente separado das subunidades ribossomais.
00: 10: 19.00 O peptidil-tRNA tendeu a particionar com a subunidade grande,
00: 10: 22,06 dependendo do comprimento da cadeia polipeptídica.
00: 10: 25.06 O que descobrimos foi que esta reação de Dom34 e Hbs1
00: 10: 27,26 era independente do códon.
00: 10: 29,12 Isso era consistente com a estrutura
00: 10: 31.08 que mostrei vários slides atrás
00: 10: 33.04 onde não há domínio de reconhecimento de códon nesta proteína, Dom34.
00: 10: 36.25 Vimos que o peptídeo não foi liberado do tRNA.
00: 10: 39.02 Isso é consistente com o fato de que a proteína Dom34
00: 10: 42.12 não tem o motivo GGQ que é responsável por essa atividade
00: 10: 45,24 em fatores de rescisão.
00: 10: 48.04 E um pouco à parte é que essas proteínas
00: 10: 50.10 prefere dividir subunidades
00: 10: 52.18 quando o modelo de RNA mensageiro, aqui, tende a ser curto.
00: 10: 55.08 Então, se o RNA mensageiro é curto
00: 10: 56,26 da extremidade 3 '
00: 10: 58.24 entrando na parede do ribossomo,
00: 11: 00.16, descobrimos que, na verdade, esse era um substrato bioquímico preferido
00: 11: 03.02 para essas proteínas.
00: 11: 05.03 Então, como tudo isso faz sentido
00: 11: 06.19 dado o que sabíamos sobre Dom34 e Hbs1
00: 11: 08.19 no processo do chamado No-Go-Decay?
00: 11: 11,08 Bem, no mesmo período de tempo
00: 11: 13.06 que estávamos realizando reações bioquímicas
00: 11: 14.26 havia uma série de laboratórios estudando isso in vivo,
00: 11: 17.02 e eles trouxeram vários insights importantes,
00: 11: 19.02 em particular, o laboratório de Toshi Inada.
00: 11: 20.27 E combinava com os modelos que ele apresentou,
00: 11: 22.16 que é a ideia é que o ribossomo fica preso
00: 11: 24.22 em um determinado lugar em um RNA mensageiro,
00: 11: 27.08 talvez, por exemplo, uma grande estrutura stem-loop.
00: 11: 30.18 Há uma clivagem endonucleolítica que realmente acontece
00: 11: 32,26 atrás do ribossomo,
00: 11: 34.06 e isso foi documentado no laboratório de Toshi,
00: 11: 36.14 levando a um RNA mensageiro clivado endonucleoliticamente.
00: 11: 39,24 E dado que existem muitos ribossomos
00: 11: 42.22 em qualquer RNA mensageiro,
00: 11: 43.29 o que isso significa são todos os ribossomos
00: 11: 45.16 que vêm por trás desse local de clivagem endonucleolítica
00: 11: 48.02 encontram essa extremidade clivada endonucleoliticamente,
00: 11: 51.18 e que esses seriam alvos ideais para essas proteínas,
00: 11: 53,17 Dom34 e Hbs1.
00: 11: 55.02 Na ausência desses fatores,
00: 11: 56.25 o ribossomo está preso na mensagem
00: 11: 58,22 sem como sair.
00: 12: 00.06 E o que esses fatores podem permitir
00: 12: 03.02 é para a reciclagem desses complexos de ribossomo
00: 12: 04.24 em RNAs mensageiros defeituosos,
00: 12: 06.12 levando à reação de reciclagem
00: 12: 08.04 e a reutilização desses ribossomos.
00: 12: 11.08 Então, nossos dados bioquímicos se encaixam perfeitamente
00: 12: 14.07 com outros resultados em campo
00: 12: 15.20 que ocorriam em células intactas.
00: 12: 17.25 E então esses foram os nossos pensamentos,
00: 12: 19.19 e então gostaríamos de fazer uma pergunta mais geral.
00: 12: 22.02 Conhecendo a atividade bioquímica dessas proteínas,
00: 12: 24.18 e sabendo um pouco sobre como essas proteínas
00: 12: 26.15 se comportou com repórteres em várias células,
00: 12: 29.29 queríamos fazer perguntas sobre
00: 12: 32.04 o significado biológico geral
00: 12: 33.21 de uma resposta de resgate.
00: 12: 35.04 Quais RNAs mensageiros são tipicamente direcionados em uma célula?
00: 12: 37.07 Is é o mesmo em condições de tipo selvagem
00: 12: 39.20 ou em condições de estresse?
00: 12: 41.04 E como podemos pensar nisso?
00: 12: 43.08 Sabíamos desde o início que Dom34
00: 12: 45.02 é um gene que não é essencial na levedura,
00: 12: 47.14 mas sabemos que é essencial em eucariotos superiores.
00: 12: 49,26 O gene é chamado Pelota em eucariotos superiores
00: 12: 52.01 e é um embrionário letal em ratos.
00: 12: 55.14 Portanto, é um gene importante em eucariotos superiores.
00: 12: 58.08 Sabíamos, no entanto, que a deleção de Dom34 na levedura
00: 13: 01.19 era sintético com uma variedade de coisas diferentes
00: 13: 04.06 incluindo, por exemplo,
00: 13: 05.26 a deleção de um gene de proteína ribossomal.
00: 13: 07.12 E sabe-se que quando você exclui um gene de proteína ribossômica,
00: 13: 10.01 por exemplo, uma cópia de um gene de proteína ribossomal,
00: 13: 12.24 que há insuficiências de ribossomo na célula,
00: 13: 15,22 porque a biogênese não é realmente capaz de acompanhar
00: 13: 17,24 com o que precisa fazer.
00: 13: 19.06 E então a ideia pode ser que
00: 13: 21.02 se você excluir um fator de resgate para ribossomos,
00: 13: 23.06 e coloque-o junto com um defeito da biogênese do ribossomo,
00: 13: 26,27 que é quando as células realmente ficam doentes,
00: 13: 28.17 e isso explicaria a letalidade sintética.
00: 13: 31.02 E então a pergunta que realmente queríamos fazer a seguir
00: 13: 33.04 foi, "O que podem os alvos celulares
00: 13: 35,23 para a função de Dom34 e resgate de Dom34? "
00: 13: 38.10 Tivemos sorte porque na época
00: 13: 40.16 estávamos pensando sobre essas ideias
00: 13: 41.29 havia uma nova abordagem que acabava de entrar online
00: 13: 43.23 do laboratório de Jonathan Weissman
00: 13: 45.07 e foi desenvolvido por Nick Ingolia,
00: 13: 46,23 um pós-doutorado em seu laboratório.
00: 13: 48.05 Era um método conhecido como perfil de ribossomo
00: 13: 49.22 que permite olhar sistematicamente
00: 13: 52.03 na ocupação de todos os ribossomos em uma célula
00: 13: 54.19 em seus vários modelos de mRNA.
00: 13: 56.26 E raciocinamos que
00: 13: 58,22 se Dom34 fosse uma proteína que desempenhava uma função,
00: 14: 01.04 em células de levedura, por exemplo,
00: 14: 02.26 se tivéssemos uma cepa do tipo selvagem e uma cepa knockout,
00: 14: 04.29 podemos perguntar
00: 14: 06.27 qual é o papel do Dom34 nas células de levedura
00: 14: 08.12 perguntando onde os ribossomos se acumulam
00: 14: 10.21 em cepas sem essa proteína.
00: 14: 13.11 Então, a ideia básica por trás do perfil do ribossomo
00: 14: 15.19 é que você pode tirar todos os ribossomos
00: 14: 17.13 que estão em RNAs mensageiros em uma célula,
00: 14: 18.28 e você pode isolar esses RNAs mensageiros
00: 14: 20.14 com ribossomos ligados a eles.
00: 14: 21,29 Ao usar uma nuclease,
00: 14: 23.19 você pode digerir todo o RNA mensageiro gratuito,
00: 14: 25.22 deixando apenas um pouco de RNA mensageiro
00: 14: 27.29 que é protegido por um ribossomo,
00: 14: 29,24 e aquele bit de mRNA protegido
00: 14: 31,26 tem cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
00: 14: 34.18 Você pode então isolar aquele RNA mensageiro de 30 ou mais nucleotídeos
00: 14: 38.19 de todos os ribossomos da célula,
00: 14: 40.10 você pode enviá-lo para o sequenciamento de alto nível.
00: 14: 43.20 Você obtém centenas de milhões de leituras
00: 14: 45.14 de pegadas de ribossomo da célula
00: 14: 47.01 e você pode perguntar qual a ocupação
00: 14: 48.22 - a ocupação global de ribossomos nas mensagens -
00: 14: 51.08 está em uma célula.
00: 14: 53.20 Você normalmente acopla este experimento
00: 14: 54.19 com um experimento de mRNA seq,
00: 14: 56.08 onde você fragmenta aleatoriamente todos os RNAs mensageiros em uma célula
00: 14: 59.08 apenas para ter certeza de que você pode explicar os preconceitos de clonagem
00: 15: 01.14 e outros artefatos potenciais de uma célula,
00: 15: 03.16 e então você também pode perguntar
00: 15: 05.11 com que eficiência um ribossomo ocupa um determinado RNA mensageiro
00: 15: 07.20 porque você sabe quanto de cada RNA mensageiro está presente
00: 15: 10.12 e você sabe quantas pegadas de ribossomo você tem.
00: 15: 13,24 Então, esse foi o experimento que imaginamos usando
00: 15: 16.10 para perguntar sobre o papel in vivo
00: 15: 18.12 para fatores de resgate.
00: 15: 20.02 Começamos como todo mundo,
00: 15: 21.18 enviando algumas amostras e perguntando se o sistema funciona bem,
00: 15: 24.08 e isso me dá uma oportunidade
00: 15: 25,24 para mostrar como é esse tipo de dado.
00: 15: 27,26 O que fizemos foi submetido,
00: 15: 30.16 de levedura de tipo selvagem e de levedura mutante Dom34
00: 15: 32,19 - falta Dom34 -
00: 15: 34.06 pegadas de ribossomos e dados de mRNA-seq.
00: 15: 36,26 A primeira coisa que você pode fazer com esses dados
00: 15: 38,24 é que você pode perguntar como eles se alinham aos quadros de leitura.
00: 15: 41.14 E você pode ver, de forma muito simples,
00: 15: 42,29 neste painel na parte superior,
00: 15: 45.07 que se tirar as pegadas do ribossomo
00: 15: 46.29 eles mapeiam predominantemente para um único quadro de leitura
00: 15: 50,05 em todos os quadros de leitura abertos,
00: 15: 52.22 sugerindo que os ribossomos
00: 15: 54.11 estão movendo três nucleotídeos ao mesmo tempo
00: 15: 56.22 em um modelo de RNA mensageiro,
00: 15: 58.08 e que esta metodologia é capaz de capturar
00: 16: 00.22 aquele movimento de três nucleotídeos.
00: 16: 02.04 Há uma periodicidade na assinatura da pegada.
00: 16: 05.20 Por outro lado, você pode olhar para os dados de mRNA-seq
00: 16: 07.28 e veja se as leituras são distribuídas para todos os três frames,
00: 16: 11.12 porque o ribossomo não impõe nenhuma periodicidade
00: 16: 13.02 nesses frames
00: 16: 14.20 e, portanto, eles se distribuem igualmente por todos os quadros de leitura.
00: 16: 16.10 Então isso sugeriu que estávamos capturando
00: 16: 18.04 algo relevante para a tradução
00: 16: 20.14 e três movimentos de nucleotídeos ao longo de um molde de RNA mensageiro.
00: 16: 23.12 Você pode ver que isso também é verdade ao longo dos quadros de leitura abertos
00: 16: 26.18 se você alinhar todos os códons iniciais,
00: 16: 28,22 aqui, para o início do gene,
00: 16: 31.16 e você alinha todos os códons de parada
00: 16: 33.04 e você faz o que chamamos de um gene médio ou análise de metagênio.
00: 16: 36.14 em primeiro lugar, o que você pode ver é que o mRNA-seq lê,
00: 16: 39,04 em verde,
00: 16: 40.22 distribuir ao longo do quadro de leitura aberto,
00: 16: 42.11, bem como nas regiões não traduzidas do gene, aqui,
00: 16: 45,06 e na extremidade 3 'do gene.
00: 16: 47,04 Então, essas regiões se distribuem ao longo da mensagem.
00: 16: 49.07 Em contraste, as pegadas do ribossomo
00: 16: 51.05 distribuir apenas ao longo do quadro de leitura aberto,
00: 16: 53.07 começando em 'start' e terminando em 'stop'.
00: 16: 56.03 E, de fato, nesses dados aqui,
00: 16: 57.23 você pode ver que a periodicidade de três nucleotídeos está surgindo.
00: 16: 59.23 Então, nos sentimos muito confiantes
00: 17: 01.14 que este era um método que pode nos dar alguma assinatura da atividade do ribossomo
00: 17: 04.14 na célula
00: 17: 06.01 que pode nos dizer algo novo sobre a função
00: 17: 08.01 desses fatores de resgate.
00: 17: 10.04 Direi que adicionamos outro pequeno toque
00: 17: 12.14 a esses estudos para estender o tipo de análise
00: 17: 15.14 que as pegadas de ribossomo de comprimento total
00: 17: 17.28 pode nos permitir pensar.
00: 17: 19,23 O que pensamos é que,
00: 17: 21.25 se houvesse grandes impedimentos na célula que impedissem os ribossomos
00: 17: 23,29 de passar,
00: 17: 25.22 pode haver não apenas um ribossomo empilhado em um RNA mensageiro,
00h17: 27,20, mas duas.
00: 17: 29.02 Então, nós chamamos isso de disomes, e você pode, na verdade.
00: 17: 30,26 após o tratamento com RNAse, vemos este traço preto aqui.
00: 17: 33.04 podemos ver um pouco de um pico residual de disome
00: 17: 35.00 e então isolamos esse pico também,
00: 17: 36.24 raciocinando que o grande estande na cela
00: 17: 40.04 que foram um problema e podem estar sujeitos a resgate
00: 17: 42.02 pode ser enriquecido nesse pico.
00: 17: 43.23 Também fomos generosos ao cortar nossos fragmentos de mRNA de um gel
00: 17: 47,21 porque sabíamos que poderíamos.
00: 17: 49.05 com base na atividade bioquímica de Dom34 e Hbs1,
00: 17: 52.08 raciocinamos que pegadas curtas de mRNA
00: 17: 55.17 também pode ser tendencioso
00: 17: 58,28 em sua preferência pela enzima Dom34,
00: 18: 00.28 porque sabemos que Dom34 gosta de modelos curtos de RNA mensageiro.
00: 18: 03.15 Então, nós isolamos pegadas mais curtas e mais longas também,
00: 18: 06.02 então fomos generosos ao cortar nossos fragmentos de um gel.
00: 18: 08,27 Então, como são esses dados?
00: 18: 11.08 Se tomarmos, de uma cepa de tipo selvagem
00: 18: 13,11 ou uma cepa delta Dom34.
00: 18: 14,19 se pegarmos essas pegadas,
00: 18: 16.12 nós os enviamos para sequenciamento de alto rendimento,
00: 18: 18.08 e pergunte qual é o comprimento médio
00: 18: 20.25 dos fragmentos que você obtém, por exemplo,
00: 18: 22,27 de um único ribossomo, de um pico de monossomo,
00: 18: 25.26 como são esses fragmentos?
00: 18: 27.11 Podemos ver a distribuição, aqui,
00: 18: 28.25 onde olhamos o comprimento de leitura no eixo x
00: 18: 31.02 e olhamos para a fração de leituras com comprimento de leitura no eixo y,
00: 18: 36.07 o que vemos é que a maioria das nossas leituras
00: 18: 39.01 estão neste intervalo de 28-30 nucleotídeos de comprimento.
00: 18: 40.23 Esse foi o comprimento do fragmento original estudado pelo laboratório Weissman,
00: 18: 43.14 e isso é o que pensamos ser um ribossomo completo
00: 18: 45.06 com um RNA mensageiro de comprimento total ligado a ele.
00: 18: 48.04 Na verdade, vemos um pequeno pico, aqui,
00: 18: 49,26 com 21 nucleotídeos de comprimento.
00: 18: 51.08 Este é um fragmento que foi caracterizado
00: 18: 53.01 por Liana Lareau,
00: 18: 54.28 e o que ela identificou como
00: 18: 56.20 provavelmente representa um estado de rotação ou catraca do ribossomo
00: 18: 59.08 no processo de translocação ao longo de um RNA mensageiro,
00: 19: 03.05 e isso não será o foco de nenhuma discussão aqui.
00: 19: 05.20 Finalmente, os fragmentos nos quais estávamos mais interessados
00: 19: 08.08 são esses fragmentos truncados aqui
00: 19: 10.20 que atinge o pico em torno de 16 nucleotídeos de comprimento,
00: 19: 12.12 e nós acreditamos,
00: 19: 14.08 e vou mostrar-lhe evidências para apoiar isso,
00: 19: 15.28 que estes são fragmentos curtos de RNA mensageiro
00: 19: 17.20 ligado a ribossomos que correram para o final de um modelo de RNA mensageiro,
00: 19: 20.28 e, portanto, há apenas 16 nucleotídeos lá,
00: 19: 22,26, mas esses são os alvos principais
00: 19: 25.04 de ação Dom34 na célula.
00: 19: 27,24 Então, como são os dados?
00: 19: 29.09 Você obtém 100 milhões de leituras de sequenciamento
00: 19: 30.20 de um tipo selvagem e cepa mutante
00: 19: 32.08 e você pergunta, como eles se distribuem ao longo do seu transcriptoma?
00: 19: 34.13 Como eles se distribuem ao longo de um RNA mensageiro?
00: 19: 36.02 Então, podemos olhar para um gene abundante,
00: 19: 37,27 aqui, PGK1.
00: 19: 39.04 É apenas um gene de variedade de jardim.
00: 19: 40.29 Podemos ver que o ribossomo lê
00: 19: 43.09 distribuir ao longo de seu comprimento,
00: 19: 44.27 do início ao fim do quadro de leitura aberto,
00: 19: 47.14 e o que vemos é que em uma cepa de nocaute (KO) Dom34
00: 19: 51.02 o padrão é realmente muito equivalente.
00: 19: 52.24 É assim que se parecem os dados típicos de perfil de ribossomo.
00: 19: 55.02 É saltitante.
00: 19: 56.18 Incluído neste salto
00: 19: 58.08 é provavelmente uma pausa natural dos ribossomos,
00: 19: 59.18, bem como vieses de sequenciamento,
00: 20: 01.06 e preconceitos de clonagem,
00: 20: 02.26 e vieses de amplificação.
00: 20: 04.12 Mas o que você pode ver é em termos do que estávamos interessados ​​em saber
00: 20: 07.19 está neste gene específico
00: 20: 09.15 não houve nenhuma interrupção óbvia.
00: 20: 10.29 não havia pausas óbvias neste gene,
00: 20: 12,29 ou problemas, que levaram à ação do Dom34.
00: 20: 15.09 Não havia pilhas de ribossomos
00: 20: 16,26 na ausência de Dom34 que se acumulou.
00: 20: 19,24 Como vimos esses dados,
00: 20: 21.00 começamos a nos preocupar se realmente tínhamos as ferramentas no lugar, no entanto,
00: 20: 23.20 para observar uma pausa significativa,
00: 20: 25,29 e então fizemos um belo truque.
00: 20: 27.07 Colocamos um análogo da histidina na levedura
00: 20: 29.18 conhecido como 3-AT - 3-aminotriazol -
00: 20: 31.05 que na verdade bloqueia a biossíntese de histidina
00: 20: 34.09 e permite que você realmente.
00: 20: 36.18 você é deficiente em histidina na célula
00: 20: 38.20 e então previmos que haveria pausas,
00: 20: 40.06 ribossomos empilhados em códons de histidina
00: 20: 42,26 em todo o genoma.
00: 20: 44.16 E de fato foi exatamente isso que vimos.
00: 20: 46.08 Em um tipo selvagem ou em uma cepa knockout Dom34,
00: 20: 47.22 de repente você vê pilhas de ribossomos
00: 20: 50.14 exatamente onde há códons de histidina
00: 20: 52.04 em todos os genes do genoma.
00: 20: 54.12 Então, este foi um indicador muito bom para nós
00: 20: 56.15 que entendemos algo sobre as funções do ribossomo
00: 20: 59,23 - os ribossomos devem pausar nos códons de histidina na ausência de histidina -
00: 21: 02.29 e realmente, como antecipamos,
00: 21: 05.00 Dom34 não responde à privação geral de aminoácidos,
00: 21: 08.19 e não previmos que seria,
00: 21: 09.29, mas nos deu uma ideia do tipo de resultado
00: 21: 11.28 que esses dados poderiam render
00: 21: 13,28 - que pudéssemos entender algo sobre pausar
00: 21: 15,22 e podemos ser capazes de decifrar algo
00: 21: 17,21 sobre a função Dom34.
00: 21: 19.29 Então, com essas ferramentas em mãos,
00: 21: 21.10 começamos a olhar mais globalmente para o nosso transcriptoma
00: 21: 23.01 e pergunte, havia algum gene
00: 21: 25.02 em que houve um aumento do número de leituras
00: 21: 26,24 na cepa de deleção Dom34 em relação a uma cepa de tipo selvagem.
00: 21: 30.01 A maneira como você pode fazer este experimento
00: 21: 31,22 é que você pode fazer todas as leituras em um determinado gene
00: 21: 33,23 e você pode plotá-lo
00: 21: 36.00 - o número de leituras por mRNA-seq
00: 21: 38.16 no nocaute contra a cepa do tipo selvagem,
00: 21: 40.14 e coloque-o no eixo x,
00: 21: 42.04 ou a diferença no número de pegadas ribossômicas
00: 21: 44.04 em um determinado gene na cepa knockout versus a cepa do tipo selvagem -
00: 21: 48.01 e o que você pode ver é um padrão muito desinteressante
00: 21: 50.02 da perspectiva de um experimento de alto rendimento,
00: 21: 51.19 onde quase todos os nossos genes
00: 21: 53.21 não têm diferenças de padrão interessantes.
00: 21: 55.09 Eles saem todos em torno de uma,
00: 21: 56.26 o que significa em um tipo selvagem e uma cepa knockout
00: 21: 59.11 temos aproximadamente o mesmo número de leituras.
00: 22: 01.18 Ambos por mRNA-seq,
00: 22: 03.07 então Dom34 talvez não seja um fator de decaimento,
00: 22: 05.26 e também está na ocupação pelos ribossomos.
00: 22: 09.06 Há uma exceção,
00: 22: 10,26 Vou voltar ao assunto.
00: 22: 12.02 É um gene conhecido como Hac1.
00: 22: 13.26 É um fator de transcrição que é realmente muito interessante
00: 22: 15.14 e acabou sendo nosso grande positivo
00: 22: 17.05 que nos disse, nós pensamos,
00: 22: 19.02 como Dom34 funciona na célula.
00: 22: 21.07 Vou mostrar outro enredo semelhante, no entanto,
00: 22: 24.01 que nos mostrou algo novo e emocionante
00: 22: 25.25 sobre a função Dom34 na célula,
00: 22: 27.28 e teve a ver com aquelas leituras curtas.
00: 22: 30.13 Então, na verdade, no slide anterior
00: 22: 32.01 o que eu estava focando eram as leituras completas
00: 22: 33.27 que são gerados no mutante de deleção Dom34,
00: 22: 35.18 lê o ribossomo padrão de 30 nucleotídeos.
00: 22: 40.18 E na verdade é isso que é mostrado aqui no eixo x,
00: 22: 42.21 ou seja, se olharmos para um tipo selvagem
00: 22: 44,18 ou um nocaute Dom34 contra uma cepa do tipo selvagem,
00: 22: 46.16 que a leitura longa e completa
00: 22: 48.21 são praticamente os mesmos em todos os genes do genoma.
00: 22: 51.04 Não há diferenças na distribuição deles.
00: 22: 56.02 No entanto, se olharmos especificamente para as leituras curtas,
00: 22: 57,22 a leitura do nucleotídeo 15-18
00: 22: 59,16 no Dom34 versus a cepa do tipo selvagem,
00: 23: 01.28 esta distribuição se inclina dramaticamente,
00: 23: 03.24 sugerindo que em uma cepa knockout Dom34
00: 23: 06.18 ocupação do ribossomo nesses fragmentos de curto-mer
00: 23: 10.06 é significativamente enriquecido,
00: 23: 12.18 consistente com a ideia de que Dom34
00: 23: 14.22 é especificamente responsável
00: 23: 16.18 para limpar os ribossomos em circunstâncias normais,
00: 23: 18.14 e quando Dom34 está faltando
00: 23: 20.25 você está realmente enriquecido nessas leituras de curta duração
00: 23: 22,26 na cepa knockout Dom34.
00: 23: 24.23 Então, essa foi uma ideia empolgante
00: 23: 26.08 e era consistente com a nossa bioquímica
00: 23: 27,26 e as ideias que tivemos ao entrar neste projeto.
00: 23: 30,12 Então, nós próximos, na verdade.
00: 23: 33.08 o que quero mostrar a seguir
00: 23: 34.22 é o que aprendemos sobre o gene HAC1
00: 23: 36.26 e nossa maior ocupação de ribossomo
00: 23: 38,14 na cepa knockout Dom34,
00: 23: 40.02 porque acaba sendo muito claro,
00: 23: 42.26 efeito positivo de Dom34 em levedura,
00: 23: 44.18 e nos diz algo sobre a função Dom34.
00: 23: 47.03 Mas, primeiro, preciso falar um pouco sobre o gene HAC1.
00: 23: 50,08 O gene HAC1.
00: 23: 54.16 codifica um fator de transcrição que está envolvido na resposta da proteína desdobrada
00: 23: 56.20 que foi amplamente estudado pelo laboratório de Peter Walter,
00: 23: 59.17 e na levedura verifica-se que é o único gene
00: 24: 02.19 que nas células de levedura é exportado do núcleo
00: 24: 05.16 com um íntron intacto - não é dividido pelo spliceossomo no núcleo.
00: 24: 08.29 Na verdade, está emendado no citoplasma
00: 24: 11.25 por uma endonuclease, uma via não canônica,
00: 24: 15.03 que é conhecido como IRE1,
00: 24: 16,23 especificamente quando IRE1 endonuclease
00: 24: 18.25 é ativado por proteínas não dobradas
00: 24: 21.03 no retículo endoplasmático.
00: 24: 23.01 Então, o que isso significa é que no citoplasma das células de levedura
00: 24: 25.24 é um gene não dividido
00: 24: 27.26 que se parece com isto, o gene HAC1,
00: 24: 29.16 com um códon de início e um códon de parada.
00: 24: 31.01 E está à espera de uma assinatura
00: 24: 32.24 para ser clivado por este caminho de emenda incomum.
00: 24: 36.29 Mas o que sabemos é de fato
00: 24: 39.19 que há alguma emenda constitutiva
00: 24: 41.09 que acontece no local de splice 5 ',
00: 24: 42.22 e sabemos que é improdutivo porque isso foi documentado,
00: 24: 44.28 e sabemos que existe uma certa quantidade deste tipo de
00: 24: 47.15 RNA mensageiro truncado sentado na célula
00: 24: 49,05 mesmo em células normais.
00: 24: 51.04 E para nós isso parecia ser um substrato No-Go.
00: 24: 54.04 É um quadro de leitura aberto
00: 24: 55,22 que termina sem um códon de parada
00: 24: 57.08 e pode precisar ser resgatado por Dom34.
00: 24: 59.14 E de fato isso é verdade.
00: 25: 01.17 Podemos olhar nossos dados de perfil de ribossomo
00: 25: 03.18 alinhado especificamente ao longo do gene HAC1,
00: 25: 05.22 e vemos na parte inferior de cada conjunto de dois,
00: 25: 08.18 aqui, o tipo selvagem lê
00: 25: 10,20 e as pegadas dos ribossomos do tipo selvagem,
00: 25: 12.14 e acima deles as pegadas de nocaute do Dom34,
00: 25: 14,26 e o ​​que você vê é que
00: 25: 17.05 tanto para as leituras disome
00: 25: 18.18 - então, aqueles picos que isolamos para dois ribossomos em uma fileira -
00: 25: 20,29, bem como as leituras curtas
00: 25: 24.10 - as leituras de 16 meros de um único pico monossômico,
00: 25: 26,28 então apenas um ribossomo -
00: 25: 29.08 vemos que somos significativamente enriquecidos na cepa de deleção Dom34
00: 25: 32,12 em relação à cepa do tipo selvagem,
00: 25: 34.20 consistente com a ideia
00: 25: 36.16 que os ribossomos de fato
00: 25: 38.15 são empilhados nesta junção clivada endonucleoliticamente,
00: 25: 40.04 então estamos perdendo o intron, agora,
00: 25: 41.21 porque isso é clivado endonucleoliticamente.
00: 25: 43.09 Os ribossomos estão presos.
00: 25: 45,03 Em circunstâncias normais,
00: 25: 47.02 são liberados por Dom34,
00: 25: 49,06 e em uma cepa delta-Dom34
00: 25: 51.19 você acumula ribossomos nessas posições.
00: 25: 53.22 Então, esta foi uma bela assinatura
00: 25: 55,26 da função desta proteína na célula.
00: 25: 57,28 Além disso, quando olhamos, na verdade,
00: 25: 59.20 a montante desse conjunto de ribossomas em pausa,
00: 26: 01.02 vimos outra assinatura de atividade Dom34 na célula
00: 26: 04.20 que parecia muito semelhante:
00: 26: 06.10 um conjunto de leituras curtas no delta Dom34
00: 26: 09.05 e um conjunto de leituras de pico de disome no delta Dom34,
00: 26: 12.21 consistente com a ideia de que de fato
00: 26: 15.05 quando o ribossomo é pausado nesta primeira posição,
00: 26: 17.01 através de uma clivagem endonucleolítica normal por IRE1,
00: 26: 20.12 há outro decote,
00: 26: 22.20 presumivelmente pela endonuclease
00: 26: 24.14 que normalmente está envolvido neste processo chamado No-Go-Decay,
00: 26: 27.02 é uma segunda clivagem endonucleolítica
00: 26: 30.04 que leva a outro conjunto de ribossomos
00: 26: 32.16 empilhados que são eliminados por este sistema.
00: 26: 35.16 Então, isso foi, para nós,
00: 26: 37.06 um belo exemplo do que Dom34 faz na célula
00: 26: 39.13 neste único gene,
00: 26: 41,07 e em retrospecto
00: 26: 43,10 achamos que isso pode ser consistente
00: 26: 45.02 com a ideia de que em células normais
00: 26: 46.27 há muito poucos alvos Dom34
00: 26: 48.19 que são crises,
00: 26: 50.08 que são grandes, grandes alvos sobre os quais Dom34 precisa agir.
00: 26: 52.27 Mas forneceu evidências para o modelo,
00: 26: 54.16 que é quando os ribossomos pausam,
00: 26: 57.01 clivagens endonucleolíticas acontecem,
00: 26: 59.00 e quando essas clivagens endonucleolíticas acontecem
00: 27: 00.24 este sistema entra e resgata os ribossomos,
00: 27: 03.19 e na ausência deste sistema
00: 27: 05.05 você acumula pilhas de ribossomos.
00: 27: 07.01 Então, era realmente um conjunto de dados muito consistente
00: 27: 09.08 para o modelo para No-Go-Decay,
00: 27: 11.12 e para o que os ribossomos fazem em uma crise.
00: 27: 13.19 Simplesmente não nos fornecia muitos alvos.
00: 27: 16,28 Tudo bem, vou contar outra história, agora,
00: 27: 18.28 que está relacionado
00: 27: 20,26 e tem a ver com o papel de Dom34.
00: 27: 22.11 Dom34 também foi implicado
00: 27: 24.10 nesta via Non-Stop-Decay
00: 27: 26.13 que descrevi nos dois primeiros slides.
00: 27: 28.29 Non-Stop-Decay, como mencionei,
00: 27: 30.26 é o que acontece quando o ribossomo encontra
00: 27: 33.16 uma cauda poliA e traduz poli-lisina.
00: 27: 36.00 E a ideia é que a polilisina se comunique com o ribossomo,
00: 27: 38.19 através do túnel de saída,
00: 27: 40.07 e diz: "Isto é um problema.
00: 27: 41.19 Precisamos parar aqui e resgatar esses ribossomos,
00: 27: 43.18 degradam a mensagem,
00: 27: 45.06 e degradar o produto proteico,
00: 27: 46.20 porque a polilisina não faz sentido. "
00: 27: 48.14 E então o modelo é bastante semelhante,
00: 27: 49.28 que é, em vez de entrar em um loop de haste aqui,
00: 27: 51.20 como no estudo de Roy Parker,
00: 27: 53.08 os ribossomos correm para uma cauda poliA,
00: 27: 55.24 clivagem endonucleolítica acontece,
00: 27: 57.10 e isso foi documentado,
00: 27: 59.00 então novamente os ribossomos remanescentes serão eliminados
00: 28: 02.00 por essas proteínas Dom34 e Hbs1,
00: 28: 04.11 e não temos certeza do que pode acontecer com esses ribossomos.
00: 28: 07.01 Mas o que queríamos saber era:
00: 28: 08.23 havia alguma evidência desse tipo de atividade
00: 28: 11.00 em nossas células de levedura
00: 28: 12.09 que poderíamos decifrar a partir dos dados Dom34 que existiam.
00: 28: 15.29 O que vou dizer primeiro é que
00: 28: 18.03 podemos realmente ter uma ideia do que as lisinas iteradas na célula fazem
00: 28: 22.08 aos ribossomos que os encontram,
00: 28: 24.02 e podemos fazer isso observando todos os ribossomos no genoma da levedura,
00: 28: 27.08 ou no transcriptoma de levedura,
00: 28: 28.22 e podemos realmente fazer uma espécie de gene médio
00: 28: 30.20 ou análises de metagene
00: 28: 32.08 onde pegamos lisinas simples e as alinhamos,
00: 28: 35.01 ou genes que têm duas lisinas em sequência
00: 28: 37.01 e alinhe-os juntos,
00: 28: 39,02 ou três, ou, ou cinco, e assim por diante.
00: 28: 42.02 E você pode ver imediatamente
00: 28: 44.02 o que foi descrito no nível de uma análise do genoma,
00: 28: 46.08 que são várias lisinas em sequência
00: 28: 48.24 na verdade fazem o ribossomo gaguejar um pouco
00: 28: 51.10 - você tem picos maiores aqui,
00: 28: 52.24 os ribossomos estão presos -
00: 28: 54.09 e esse tipo de propagação ao longo do comprimento
00: 28: 56.18 do trato de poli-lisina.
00: 28: 58.05 Então, isso está usando dados de perfil de ribossomos
00: 29: 01.14 para fazer perguntas sobre a ocupação do ribossomo,
00: 29: 03.16 que são consistentes com a ideia
00: 29: 05.10 que a polilisina é um problema.
00: 29: 06.26 Devo dizer, porém,
00: 29: 08.14 que essas polilisinas estão no meio dos genes
00: 29: 09.28 - são apenas lisinas codificadoras normais.
00: 29: 12.20 Então, tínhamos outra maneira que pensamos que poderíamos procurar
00: 29: 16.12 o que acontece quando os ribossomos encontram polilisina,
00: 29: 18.15 e isso foi manipulando as células de levedura
00: 29: 20.09 de uma forma especial,
00: 29: 22.17 e vou falar sobre isso neste experimento, aqui.
00: 29: 24,23 Então, o que você pode ver, por exemplo,
00: 29: 26.13 é se tomarmos um gene individual -
00: 29: 28.23 este gene é conhecido como ENT5,
00: 29: 30.15 é apenas um gene de levedura médio -
00: 29: 31.28 e podemos ver em um tipo selvagem e uma cepa nocaute Dom34.
00: 29: 34.14 são leituras de comprimento médio,
00: 29: 35.28 estes são os 30-mer lê que o laboratório de Jonathan Weissman
00: 29: 37.26 originalmente caracterizado,
00: 29: 39.08 e o que vemos é o que esperamos,
00: 29: 40.24 que é a leitura do ribossomo no quadro de leitura aberto,
00: 29: 43,06 mas não no 3'UTR
00: 29: 44.28 e não na cauda poliA,
00: 29: 46.09 e isso faz sentido porque este é um gene normal
00: 29: 48.10 com um códon de parada normal
00: 29: 49,27 e os ribossomos reconhecem o códon de parada.
00: 29: 51.18 Mas a experiência que fizemos
00: 29: 53.01 é que realmente inserimos em uma cepa de levedura
00: 29: 55.03 um tRNA supressor,
00: 29: 56.22 e o que tRNAs supressores fazem
00: 29: 58.12 é que eles não reconhecem códons de parada
00: 30: 00.14 e eles lêem códons de parada,
00: 30: 02.24 permitindo que os códons de parada sejam contornados
00: 30: 04.20 em algum nível,
00: 30: 06.08 e, portanto, tradução para o 3'UTR
00: 30: 08.16 e, em genes que não possuem outro códon de parada no 3'UTR,
00: 30: 10,29 na cauda poliA.
00: 30: 13.18 E então o que vemos aqui.
00: 30: 15.02 estas são leituras completas que estamos vendo agora.
00: 30: 16.25 se colocarmos um tRNA supressor
00: 30: 18.19 em uma cepa de levedura e observe este mesmo gene,
00: 30: 22.02 lemos o códon de parada, aqui,
00: 30: 24.15, acumulamos leituras de ribossomos no 3'UTR,
00: 30: 28.13, mas melhoramos as leituras do ribossomo
00: 30: 30,21 no mutante Dom34.
00: 30: 32.14 Portanto, esta é a evidência de que
00: 30: 34.10 quando você lê um códon de parada
00: 30: 35,28 e leia na 3'UTR
00: 30: 37.16 e na cauda poliA,
00: 30: 39.02 esses ribossomos, em circunstâncias normais.
00: 30: 40.29 isto fica bem em cima do polyA.
00: 30: 42.18 seria liberado por Dom34.
00: 30: 44.28 E na sua ausência, temos uma grande pilha,
00: 30: 47.13 então isso é algo que Dom34 definitivamente faz nas células.
00: 30: 51.05 Ficamos ainda mais satisfeitos, no entanto,
00: 30: 52,28 quando olhamos para o short-mer
00: 30: 54.14 para ver sinais desta clivagem endonucleolítica
00: 30: 56.10 que havia sido proposto para leitura em polilisina.
00: 30: 59.11 Vemos isso aqui quando olhamos, novamente,
00: 31: 01.10 na mesma cepa com o tRNA supressor de nonsense
00: 31: 03.18 e o ribossomo de comprimento total lê
00: 31: 05.20 sentado bem aqui na junção da cauda poliA.
00: 31: 09.11 Vemos, atrás dessa assinatura.
00: 31: 11.02 vemos leituras amarelas
00: 31: 12,15 - essas são leituras mais curtas. Estes são RNAs mensageiros que são truncados
00: 31: 16.10 e o ribossomo correu até o fim desse RNA mensageiro,
00: 31: 18,28 e eles seguem, de fato,
00: 31: 20.21 este pico cinza porque a clivagem endonucleolítica,
00: 31: 23.19 pensamos, e foi mostrado,
00: 31: 24,27 acontece atrás do ribossomo que está na frente.
00: 31: 27.06 Então, este ribossomo encontra cauda poliA,
00: 31: 30.00 ele luta com isso de alguma forma,
00: 31: 31.18 o ribossomo lê isso como um problema,
00: 31: 33.08 clivagem endonucleolítica acontece por trás disso,
00: 31: 36.06 e você obtém um acúmulo de leituras.
00: 31: 38.12 Novamente, identificando um papel claro para Dom34
00: 31: 41.20 quando você lê na cauda poliA.
00: 31: 44.02 Isso acontece mais ou menos.
00: 31: 46.16 e se olharmos para isso de uma forma mais global?
00: 31: 48.04 Bem, podemos tomar este tipo de assinatura
00: 31: 50.01 e podemos fazer isso de uma forma mais global ou metagênica,
00: 31: 54.00 onde alinhamos, aqui, em 0,
00: 31: 55.25 a junção com a cauda poliA.
00: 31: 58.08 E lá estão eles,
00: 32: 00.02 essas são as leituras de 30 nucleotídeos cinza.
00: 32: 01.12 Alinhamos todas as caudas poliA juntas
00: 32: 03.01 em todos os genes
00: 32: 04.16 que têm códons sem sentido que são suprimidos
00: 32: 06.04 pelo tRNA supressor.
00: 32: 07.18 O que vemos é a pilha de leituras em cinza bem aqui
00: 32: 10.04 - estes são os ribossomos lendo na cauda poliA -
00: 32: 12,22 e aqui está a pilha de ribossomos
00: 32: 15.01 atrás nos RNAs mensageiros truncados
00: 32: 17.00 que são o resultado do ribossomo
00: 32: 19.19 lendo esta cauda poliA.
00: 32: 20,27 É um atraso de 29 nucleotídeos
00: 32: 23,05 e isso é consistente com o espaçamento
00: 32: 24.24 que seria de esperar de um ribossomo preso na frente
00: 32: 26,22 e uma endonuclease vindo por trás.
00: 32: 28.20 Portanto, esta é uma visão global do que
00: 32: 31.12 a chamada Non-Stop-Decay parece.
00: 32: 33.14 Os ribossomos são uma assinatura para nós
00: 32: 35.24 identificando o Non-Stop-Decay
00: 32: 37,14 nesta cepa Dom34-delta.
00: 32: 40.06 Então, você pode argumentar,
00: 32: 41.19 que isso não é particularmente amplo
00: 32: 43,14 e de longo alcance
00: 32: 45.25 porque colocamos um tRNA supressor sem sentido
00: 32: 47,19 nesta cepa de levedura,
00: 32: 49.04 e isso talvez não seja um fenômeno geral.
00: 32: 50.19 Mas o que vou discutir
00: 32: 52.03 é que na verdade poliadenilação prematura
00: 32: 55.02 é um evento abundante e regular em células eucarióticas,
00: 32: 58,26 e a assinatura deste evento
00: 33: 00.28 é amplamente apagado por uma variedade de caminhos de controle de qualidade
00: 33: 04.18 que estão sempre ocorrendo,
00: 33: 06.10 fazendo a assinatura de poliadenilação prematura
00: 33: 08.22 invisível por experimentos normais.
00: 33: 11.04 E estes são dois exemplos disso.
00: 33: 12.22 RNA14 é um gene em levedura,
00: 33: 14,14 e YAP1,
00: 33: 16.14 que são conhecidos por serem poliadenilados prematuramente.
00: 33: 18.20 Resultados anteriores de Pelechano et al em 2013,
00: 33: 22.14 na verdade, usando métodos de sequenciamento de RNA,
00: 33: 24.01 identificou locais de poliadenilação prematuros
00: 33: 26.11 nesses dois genes.
00: 33: 27.21 E o que vemos é,
00: 33: 29,12 usando nossa cepa Dom34-delta
00: 33: 31.20 e procurando leituras em cinza e amarelo
00: 33: 33.20 - as leituras longas e as leituras curtas -
00: 33: 36.21 vemos uma assinatura clara
00: 33: 38.22 que os ribossomos estão presos neste gene
00: 33: 40.28 em RNAs mensageiros clivados endonucleoliticamente
00: 33: 43.08 que deve ser o resultado
00: 33: 46.00 da leitura do ribossomo em polilisina.
00: 33: 47.26 O que posso dizer é que, se olharmos amplamente para o fermento,
00: 33: 50.14 nestas cepas - a cepa Dom34-delta -
00: 33: 53.06 e use a aparência de tais leituras
00: 33: 55.20 no meio de quadros de leitura abertos
00: 33: 57.06 como uma assinatura deste processo
00: 33: 59,23 de Non-Stop-Decay acontecendo,
00: 34: 01.13 o que posso dizer é que é incrivelmente amplo.
00: 34: 03.17 Muitos, muitos, muitos genes que olhamos,
00: 34: 06.10 até 50% dos genes que olhamos,
00: 34: 08.02 têm pilhas de ribossomos no meio deles
00: 34: 10,22 se Dom34 for eliminado da célula,
00: 34: 12,26 sugerindo que isso é de fato
00: 34: 15.10 um evento muito regular que acontece nas células de levedura
00: 34: 17.26 e eu suspeito que isso vai acontecer em eucariotos superiores.
00: 34: 20.10 Então, vou voltar a este slide,
00: 34: 22.08 onde falei sobre a distribuição dos tamanhos dos fragmentos,
00: 34: 24.10 como uma forma de terminar e dizer a você
00: 34: 26.10 quão importante achamos que Dom34 pode ser na célula.
00: 34: 28.29 Então, eu mostrei a você no início
00: 34: 31.00 que se apenas, de uma forma imparcial,
00: 34: 32.22 corte uma grande fatia do gel
00: 34: 34.18 e pergunte quantos ribossomos estão em leituras de ribossomos de comprimento total
00: 34: 37,22 versus leituras curtas,
00: 34: 39.08 o que você pode ver aqui é que houve cerca de 5% das leituras,
00: 34: 42,23 talvez, que foram nesta área aqui embaixo,
00: 34: 44.13 se os somarmos em vários comprimentos.
00: 34: 46.16 Então, você pode dizer, esses são alvos Dom34 típicos.
00: 34: 48.24 São leituras curtas
00: 34: 50.16 e podem ser normalmente visados ​​pelo sistema Dom34.
00: 34: 53.15 E o que posso dizer é se nocautearmos Dom34.
00: 34: 55.29 esta é na verdade uma cepa do tipo selvagem
00: 34: 57.18 que estamos vendo aqui.
00: 34: 59.01 se eliminarmos Dom34, esse tamanho de pico dobra.
00: 35: 01.13 Então, pelo menos 5% das leituras nesse caso,
00: 35: 04.02 podemos dizer com segurança,
00: 35: 06.01 pode ser o resultado da ação Dom34 na célula,
00: 35: 08.26 sugerindo que de fato
00: 35: 10.16 há muitas leituras curtas na célula
00: 35: 12.16 e você pode imaginar que há short-mers
00: 35: 14.08 que resultam dos processos intermediários
00: 35: 16.01 de decadência exossômica de RNAs mensageiros,
00: 35: 19.20 e assim poderíamos argumentar que isso nos ajuda a entender
00: 35: 22.07 porque este gene é essencial em eucariotos superiores,
00: 35: 24.17 e suspeito que vamos aprender mais sobre isso em breve,
00: 35: 27.09 e não essencial na levedura,
00: 35: 29.02, mas que se torna essencial no caso em que os ribossomos são limitantes.
00: 35: 31.29 Então, acho que nos ajuda a entender
00: 35: 33.25 o papel in vivo de Dom34.
00: 35: 35.14 Desempenha um papel importante,
00: 35: 37.00 é por isso que é letal embrionária em eucariotos superiores,
00: 35: 38.26 e descobrimos esse papel
00: 35: 40.16 trabalhando em um sistema geneticamente manipulável
00: 35: 42.08 onde podemos realmente excluir o gene
00: 35: 44.06 e estude o processo em tempo real.
00: 35: 47.05 Então com isso vou parar e concluir
00: 35: 53.14 dizendo a você que espero que você tenha entendido
00: 35: 55.11 algo sobre a vigilância de mRNA em geral,
00: 35: 57.04 e acho que a mensagem para levar para casa
00: 35: 59.16 é realmente isso no centro
00: 36: 01.12 de qualquer processo de vigilância de mRNA
00: 36: 03.02 é o ribossomo.
00: 36: 04.17 O ribossomo lê os RNAs mensageiros
00: 36: 06.12 e suas propriedades do ribossomo
00: 36: 08.06 e a maquinaria ribossomal
00: 36: 09.23 que são responsáveis ​​por reconhecer e recrutar fatores
00: 36: 12,07 para entender
00: 36: 14.20 quando os RNAs mensageiros são defeituosos de alguma forma
00: 36: 16.01 e precisa ser direcionado para decadência
00: 36: 19,14 por vias normais,
00: 36: 20.26 que o produto proteico incompleto precisa ser direcionado para degradação,
00: 36: 23,27 e que os próprios ribossomos
00: 36: 25.20 precisam ser resgatados por um caminho independente do processo de rescisão normal,
00: 36: 29.08 para ser colocado de volta na piscina para a homeostase do ribossomo.
00: 36: 33.14 E com isso vou mencionar os principais jogadores no meu laboratório
00: 36: 35.26 quem fez o trabalho.
00: 36: 37.06 O primeiro trabalho bioquímico no laboratório
00: 36: 39.10 foi feito por Chris Shoemaker,
00: 36: 41.07 e todo o trabalho de perfil do ribossomo
00: 36: 42.20 foi realmente feito por Nick Guydosh,
00: 36: 44.22 um pós-doutorado recente no laboratório.
00: 36: 47.03 E também gostaria de agradecer às minhas fontes de financiamento
00: 36: 49.01 do NIH e do Howard Hughes Medical Institute.
00: 36: 51,13 Obrigado.

  • Parte 1: Síntese de proteínas: um evento molecular de alta fidelidade

Descoberta na biologia sintética, um passo mais perto de uma nova revolução industrial

Os cientistas relatam que desenvolveram um método que reduz o tempo necessário para fazer novas peças para fábricas biológicas microscópicas.

O método reduz o tempo de 2 dias para apenas 6 horas. Os cientistas, do Imperial College London, dizem que suas pesquisas os aproximam mais de um novo tipo de revolução industrial, onde peças para essas fábricas biológicas poderiam ser produzidas em massa. Essas fábricas têm uma grande variedade de aplicações, incluindo melhores tratamentos de administração de medicamentos para pacientes, melhorias na forma como os minerais são extraídos do subsolo e avanços na produção de biocombustíveis.

Bactérias inofensivas podem ser reprojetadas em fábricas microscópicas que podem melhorar a saúde do paciente

O professor Paul Freemont, codiretor do Centro de Biologia Sintética e Inovação do Imperial College London e principal co-investigador do estudo, que foi publicado hoje na revista Nucleic Acids Research, diz:

& ldquoAntes da revolução industrial, a maioria dos itens era feita à mão, o que significava que eram mais lentos de fabricar, mais caros de produzir e limitados em número. Estamos em uma conjuntura semelhante na biologia sintética, tendo que testar e construir cada parte do zero, o que é um processo longo e lento. Demonstramos em nosso estudo um novo método que pode ajudar a aumentar rapidamente a produção e o teste de peças biológicas. & Rdquo

Partes feitas de DNA são reprojetadas por cientistas e colocadas em células para fazer fábricas biológicas. No entanto, um grande gargalo na biologia sintética é a falta de peças para construir novos tipos de fábricas. Para construir peças usando o método atual demorado, os cientistas precisam reengenharia do DNA em uma célula e observar como ele funciona.Se funcionar de acordo com as especificações, os cientistas armazenam as especificações da peça em um catálogo.

Agora, os cientistas do Imperial College London desenvolveram um método muito mais rápido que elimina a necessidade de reprojetar uma célula toda vez que desejam fazer uma nova peça. A equipe afirma que seu trabalho pode levar a novas bibliotecas de componentes de prateleira que podem ser usados ​​para construir fábricas biológicas mais sofisticadas.

James Chappell, co-autor do estudo do Centro de Biologia Sintética e Inovação do Imperial College London, diz:

& ldquoUm dos principais objetivos da biologia sintética é encontrar uma maneira de industrializar nossos processos para que possamos produzir em massa essas fábricas biológicas da mesma forma que indústrias como os fabricantes de automóveis produzem veículos em massa em uma linha de fábrica. Isso poderia desbloquear o potencial desse campo da ciência e nos permitir desenvolver dispositivos muito mais sofisticados que poderiam ser usados ​​para melhorar muitas facetas da sociedade. De forma empolgante, nossa pesquisa nos leva um passo mais perto dessa realidade, proporcionando uma maneira rápida de desenvolver novas peças. & Rdquo

Quando uma célula é reprogramada, o DNA reprogramado na célula codifica uma mensagem que é transmitida por moléculas chamadas de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) para as fábricas de produção de células chamadas ribossomos. Os ribossomos traduzem a informação genética em um comando que instrui a célula a realizar funções. Por exemplo, os cientistas já podem reprojetar uma célula em uma fábrica de detectores de infecção, que produz uma proteína que detecta sinais químicos de bactérias patogênicas humanas e muda de cor para indicar sua presença.

No estudo, os pesquisadores Imperial demonstraram pela primeira vez que o mesmo método pode ser alcançado em um tubo de ensaio fora de uma célula. Isso envolve extrair das células o maquinário que produz o mRNA e as proteínas e fornecer a energia e os blocos de construção para ajudá-los a sobreviver em tubos de ensaio. A equipe então adiciona seu DNA reprogramado à solução e observa como ela funciona.

A vantagem desse método é que os cientistas podem desenvolver litros desse ambiente semelhante a uma célula para que vários DNAs reprogramados possam ser testados simultaneamente, o que acelera o processo de produção das peças.

A próxima etapa da pesquisa é expandir os tipos de peças e dispositivos que podem ser desenvolvidos com esse método. Também pretendem desenvolver um método com robôs para agilizar e automatizar todo o processo.

O professor Richard Kitney, codiretor do Centro de Biologia Sintética e Inovação do Imperial College London afirma: “A biologia sintética é vista pelo governo britânico como tendo o potencial de criar novas indústrias e empregos para o benefício da economia do Reino Unido. Este trabalho é parte de um programa de pesquisa mais amplo e importante dentro do Centro para desenvolver tecnologia que pode ser usada em uma variedade de aplicações industriais. & Rdquo


12.18: Ribossomos - Biologia

Como a variação genética afeta os traços fenotípicos, tanto no nível do organismo quanto no celular (incluindo uma ênfase na regulação do gene)? Quais são as vias moleculares da variação genética aos fenótipos celulares e orgânicos? Por que tanto do genoma contribui para a base genética de características complexas?

Nosso laboratório inclui pessoas treinadas em uma variedade de campos diferentes, usando abordagens computacionais e experimentais para resolver esses problemas. Freqüentemente, trabalhamos em problemas em que não existem métodos estatísticos prontos para uso. Assim, uma parte importante de nosso trabalho é desenvolver abordagens estatísticas e computacionais apropriadas que podem gerar novos insights sobre dados biológicos.

Links Úteis

Lab News

E bem-vindos aos nossos novos alunos de doutorado Alyssa Fortier e Roshni Patel e novos pós-doutorandos: Sahin Naqvi, Jeff Spence, Hakhamanesh Mostafavi e Clemens Weiss!

Poderia: Novos artigos incluem nosso trabalho mais recente sobre a compreensão da arquitetura genética de características complexas (o artigo "Omnigenic 2") com Xuanyao Liu e Yang Li: [Link] e nosso artigo com os laboratórios Criswell, Marson e Greenleaf sobre a estrutura da cromatina das células do sistema imunológico (liderado por Diego em nosso laboratório, com Michelle Nguyen e Anja Mezger): [Link] Parabéns a Diego, Xuanyao, Yang e o resto das equipes!

Janeiro: Bem-vindo ao Shaila Musharoff quem está se juntando a nós este mês!

Dezembro: Despedida para David e Emily! A falta deles será muito sentida. David iniciará seu próprio laboratório no NY Genome Center, e Emily está levando sua experiência em genômica para o mundo da consultoria.

9/18/2018. Resumo de notícias:

Ida e vinda:
Agosto: Bem-vindo aos nossos novos pós-doutorandos Jake Freimer e Yuval Simons!

Eilon conseguiu um emprego como um dos primeiros cientistas na nova empresa Insitro, fundada por Daphne Koller. Bon Voyage to Eilon!

Emily defendeu sua tese! Parabéns Emily! Ela ficará no laboratório até o final do ano para terminar os trabalhos.

Parabéns a Natalie e Ben, ambos ex-alunos de laboratório, em seu adorável casamento.

Julho: Aluna de laboratório Alexis Battle foi premiado com o primeiro mandato em Engenharia Biomédica na Johns Hopkins. Notícias maravilhosas!

Junho: Hannah M recebeu o prêmio Robert Baynard Textor do Departamento de Antropologia, por 'criatividade em antropologia'. Muito bem e merecido, Hannah!

Poderia: Arbel formou-se e mudou-se para uma posição de pós-doutorado no laboratório de Molly Przeworski em Columbia. Em agosto, ele e sua esposa Maya deram as boas-vindas a meninos gêmeos! Parabéns! Este é o terceiro par de gêmeos em laboratório nos últimos 7 anos. Este é um enriquecimento significativo?

JonathanA palestra plenária de PEQG sobre o modelo Omnigenic (com Evan, Yang e Xuanyao) está online aqui.

Marchar: Natalie formou-se e mudou-se para uma posição como cientista da equipe da Ancestry. Parabéns Natalie! Que saudades de você!

Janeiro: Kelley mudou-se para iniciar seu próprio laboratório no Departamento de Ciências do Genoma da Universidade de Washington. Estamos ansiosos para acompanhar seu progresso em Washington!

10/25/2017. Resumo de notícias:

Outubro: ASHG: Natalie deu uma palestra plenária bem recebida para 7.000 pessoas em seu projeto paralelo sobre a dinâmica de gênero da conferência e Nasa, Yang, Emily e David também fez apresentações de plataforma muito boas. Bom trabalho a todos!

Atualizar: Nasa ganhou ASHG's melhor conversa de estudante (para trabalhar com Melina Claussnitzer). Bem feito!!

Temos vários artigos publicados ou prestes a sair em periódicos: Eilon sobre o uso de cfDNA para medir a rejeição de transplante Yang e David em LeafCutter (emenda) Diego na estimativa de tipos de células que conduzem a características complexas Arbel no NAGC em duplicatas do gene Jessica em triclosan e microbiomas (trabalhando com o laboratório de Ami).

Parabéns a Ziyue no casamento dela!

Setembro: Yang e Xun passou a iniciar seus próprios laboratórios. Boa Viagem!!

Parabéns a Harold que recebeu uma prestigiosa bolsa de pós-doutorado Hannah Gray do HHMI.

Junho: Receber Nasa, Hannah e Margaret para o laboratório!

6/22/2017. Resumo de notícias dos últimos meses:

Junho: lançamento de nossa peça de perspectiva no 'onigênico'modelo de traços complexos, com os principais autores Evan Boyle e Yang Li [Link PDF]. Nosso artigo estimulou muita discussão nas mídias sociais e em outros lugares, incluindo o artigo de Ed Yong no Atlantic e nas notícias de Stanford.

Poderia: Parabéns a 3 de nossos pós-doutorandos que aceitaram cargos de professor assistente para o próximo ano acadêmico: Kelley Harris (U Washington, Genome Sciences), Yang Li (U Chicago, Medicina Genética), e Xun Lan (Tsinghua U, Ciências Médicas Básicas).

E Kelley também recebeu um prestigioso prêmio de transição de corpo docente por meio do programa CASI da Burroughs Wellcome Fund.

Natalie e Arbel recebeu bolsas de pós-graduação do CEHG. Bem feito! E Jonathan se tornará codiretor do CEHG a partir de junho.

DiegoO artigo de inferir tipos de células que causam doenças está em alta no bioRxiv.

Abril: Kelley teve um artigo muito bom com base nos resultados impressionantes de seu trabalho de doutorado: Evolução rápida do espectro de mutação humana, lançado este mês na eLife [Link].

Harold, Evan e David cada um tem novos documentos sobre seu trabalho com outros laboratórios: Sleuth [Harold] e Cas9 Binding [Evan] e ASE para detectar GxE [David].

Marchar: Anand mudou para um cargo de cientista de dados no Facebook. Sentiremos falta de sua incrível experiência técnica e contribuições informais para muitos projetos no laboratório! Bon Voyage, Anand!

Dezembro de 2016. Arbel e AnandO trabalho da empresa sobre como a mutação recorrente altera o espectro de frequência do local em grandes amostras foi publicado na PLOS Genetics: [Link]. Parabéns!

Natalie teve um artigo divertido no qual aplicou métodos computacionais para estudar a história da revista. Genética desde 1917 [Link]. [Gráfico de lapso de tempo das localizações do autor]

Novembro. Yair, Evan, e NatalieArtigo da SDS e adaptação poligênica: Detecção de adaptação humana durante os últimos 2.000 anos já foi lançado na Science [Link]. Parabéns!

9/20/2016. Bem-vindo ao Harold Pimentel que se juntou ao laboratório no mês passado!

Também, Eilon tem um artigo publicado na Nature Genetics mostrando interações trans (isto é, trans-eQTLs) entre os alelos da proteína MHC e a expressão de genes do receptor de células T. Com a ajuda de Leah Sibener e Chris Garcia, fomos capazes de interpretar isso em termos de interações físicas na estrutura da proteína [Link]

6/1/2016. Muitas notícias interessantes para relatar de abril e maio:

De Anil papel em usando dados de perfil de ribossomo para detectar novos quadros de leitura abertos agora está online em eLife [Link].

Xun's papel no evolução de duplicatas de genes foi publicado na Science [Link]. Isso recebeu muita atenção, inclusive em uma postagem no blog de Francis Collins.

De Yair, Evan e Natalie papel em adaptação poligênica muito recente já está disponível no bioRxiv [Link]. Isso chamou muita atenção, incluindo notícias na Nature e na Science.

Yair e Yang ambos deram palestras no Encontro de Biologia de Genomas da Cold Spring. Também foi ótimo ver palestras de ex-alunos de laboratório Alexis Battle, Joe Pickrell e Dan Gaffneye sair com muitos outros colegas, amigos e outros ex-alunos do laboratório.

Aqui você pode ver um par de grandes esboços de Yang e Yair, desenhados por Alex Cagan.

4/28/2016. Bem feito Yang, cujo papel O splicing de RNA é o elo principal entre a variação genética e a doença saiu hoje [Link]. Este artigo usa dados de 7 anos de projetos conjuntos entre nosso laboratório e o laboratório de Yoav para fornecer uma contabilidade detalhada das ligações entre variação genética, variação na regulação do gene e doença.

3/29/2016. Parabéns a Evan (NSF predoc!). Também para Yang e David K em seu artigo Leafcutter sobre a quantificação de splicing de RNA, agora disponível no bioRxiv.

1/4/2016. Adeus e melhores votos a Bryce (pós-doutorado, Alkes Price lab, Harvard) e para Graham e Kyle, iniciando seus próprios laboratórios no Salk Institute e UCSD, respectivamente.

11/20/2015. Parabéns a Bryce por sua defesa magistral de PhD em Chicago. Foi uma ocasião agridoce, marcando o fim da era U Chicago.

9/14/2015. O artigo WASP de Bryce e Graham (mapeamento de QTL com leituras específicas de alelo) foi publicado hoje na Nature Methods.

8/18/2015. Tivemos um jantar de despedida no Balcão na sexta-feira por Audrey e Towfique (iniciando seus próprios laboratórios na Universidade de Idaho e no Monte Sinai, respectivamente). Boa Viagem!

Um grande bem-vindo a Kelley Harris e Ziyue Gao que estão se juntando a nós como novos pós-docs dos laboratórios de Rasmus Nielsen e Molly Przeworski!

Bem-vindo ao visitante de curto prazo Dan Lawson e também a Alexis Battle, que está de volta para nos visitar brevemente este mês.

Parabéns a Eilon e Michal pelo nascimento de seu filho Yuval!

No departamento de bolsas, parabéns a Kelley (NRSA), David G (EMBO / LLHF), Yang (CEHG), Jessica (NSF predoc)! E Natalie e Evan receberam duas bolsas de pesquisa internas, uma da Genética e outra da Biologia de Sistemas. Kudos.

5/22/2015. JKP quase terminou as aulas. Em dia com as novidades: Parabéns para Graham quem está levando um trabalho docente no Instituto Salk!!

E parabéns para Towfique quem está levando um trabalho docente em Mt Sinai.

E mais parabéns para Yang que foi premiado com uma bolsa de pós-doutorado CEHG para o próximo ano!

E Papel de Xun sobre a evolução das duplicações gênicas está disponível no bioRxiv.

4/2/2015. Parabéns a David G. que ganhou uma bolsa do Prêmio Dan David!

3/31/2015. Parabéns à ex-membro do laboratório Melissa Hubisz, agora na Cornell, por ganhar um NSF Predoc prêmio! Parabéns também a Jessica, Emily e Evan pelas menções honrosas.

12/18/2014. O artigo de Alexis, Zia e Sidney sobre a relação entre variação genética e variação fenotípica em RNA, ribossomos e proteínas foi lançado hoje. Parabéns!

12/16/2014. Parabéns a Cristina que completou sua defesa de Ph.D. em CS ontem !!

12/04/2014. O artigo de Anil e Heejung sobre o uso de abordagens em várias escalas para modelar dados de DNase em locais de ligação de TF foi publicado no bioRxiv.

11/11/2014. Nosso novo site SciReader para recomendações científicas está em versão beta. Você pode conferir aqui: SciReader.org. Muito bem, Priya, Natalie, Yonggan!

11/11/2014. Artigo e software de Bryce e Graham sobre mapeamento de leitura imparcial específico de alelo e poderoso mapeamento QTL está disponível no bioRxiv e o software WASP correspondente está no GitHub.

9/22/2014. Muitos recém-chegados este mês: David, Yang, Anand e Emily visitantes estudiosos: Audrey, Towfique e Kyle. Receber!

8/07/2014. Esta semana, estamos nos mudando para nosso espaço de laboratório de longa duração no Clark Center! Estamos muito felizes por estar no novo espaço. Em outras notícias, Anand recebeu uma bolsa CEHG para o próximo ano. Muito bem, Anand!

6/24/2014. Alexis vai começar seu próprio laboratório no próximo mês na Johns Hopkins nos departamentos de CS e Biostats [Link]. Desejamos a ela tudo de melhor em seu novo cargo !!

6/24/2014. Bem feito para Eilon sobre ganhar a prestigiosa bolsa EMBO! David Golan, que ingressará em setembro, recebeu as bolsas Rothschild e Fulbright. Parabéns a ambos !!

6/24/2014. O artigo de Xun e Nick sobre influências genéticas na metilação do DNA está disponível no bioRxiv [Link].

4/29/2014. De Anil estrutura rápida o artigo já foi publicado em Genetics: Link.

Alexis vai falar na próxima semana em Biologia dos Genomas sobre seu trabalho com Zia e Sydney na compreensão dos efeitos da variação genética no mRNA, tradução e proteínas.

4/2/2014. Artigo de Darren Cusanovich sobre derrubada de TFs em LCLs (com o laboratório de Yoav) está disponível agora em PLOS Genetics: Link. Artigo de Choongwon Jeong sobre introgressão adaptativa de adaptações de alta altitude de sherpa para tibetanos (colaboração com o laboratório de Anna Di Rienzo), está disponível agora na Nature Communications: Link.

4/1/2014. Bon voyage to Heejung Kim, ela passou o semestre de inverno nos visitando do laboratório de Matthew em Chicago.

3/1/2014. Bem-vindo a Yair, que agora chegou de Chicago com sua família!

2/10/2014. Nosso papel sobre carga genética em populações humanas, juntamente com o laboratório de Guy Sella, está agora na Nature Genetics. Parabéns a Yuval Simons (no laboratório de Guy) e Michael Turchin (agora no laboratório de Matthew Stephens)! Ligação.

2/10/2014. Bem-vindo ao nosso novo pós-doutorado Eilon Sharon, que se mudou do laboratório de Eran Segal para cá. Eilon estará junto com o laboratório de Hunter Fraser. Bem-vindos também aos alunos rotativos deste semestre: Peyton Greenside, Natalie Telis, Diego Calderon, Arbel Harpak e Emily Glassberg!

12/6/2013. Joe Davis escreveu um ótimo post sobre o artigo recente de Graham e Bryce sobre variação genética e modificação de histonas.

12/4/2013. fastSTRUCTURE foi lançado! Os links para o manuscrito de Anil e o software de lançamento beta estão aqui.

12/4/2013. Agradecimentos a Christine Vogel por sua perspectiva sobre a evolução de papel de mRNA / proteína de Zia.

11/12/2013. Bem-vindo a Yonggan e Priya que estão se juntando ao laboratório este mês!

11/12/2013. Parabéns a Jack / Athma / Roger, cujo artigo sobre DNase QTLs foi escolhido como um dos principais artigos de 2012 em Regulatory and Systems Genomics na reunião RECOMB / ISCB.

11/1/2013. Há uma boa perspectiva em NRG por Hannah Storey em 4 artigos recentes - incluindo um de Graham e Bryce - que estudou os efeitos da variação genética em mods de histonas.

10/30/2013. Kudos para Shyam por ganhar o prestigioso Charles Epstein Trainee Research Award (divisão de pós-doutorado) por sua palestra na ASHG sobre inferência histórica para populações africanas. Graham Coop é um vencedor anterior de nosso laboratório (em 2007).

10/22/2013. Parabéns ao ex-aluno de laboratório Joe Pickrell que acabou de aceitar uma posição como um dos primeiros professores do Genome Center de Nova York. Além disso, Zia Khan está agora em trânsito para seu primeiro cargo de professor - em CS na U. Maryland. Boa sorte para os dois!

10/22/2013. O artigo de Darren sobre experimentos knockdown visando 59 TFs foi publicado no ArXiv.

10/17/2013. Zia e Graham / Bryce publicaram um par de artigos na Science hoje: evolução da expressão de proteínas em primatas e efeitos da variação genética nas modificações das histonas. Parabéns a Zia, Graham e Bryce!

10/17/2013. O artigo de Ben Voight sobre a seleção de 2006 foi destacado em um artigo de blog de Emma Ganley como parte das celebrações do 10º aniversário na PLOS Biology.

10/11/2013. Bem-vindo aos nossos primeiros dois alunos rotativos em Stanford: Ilana Arbisser do departamento de Biologia e Michael Sikora da Genética!

8/1/2013. Estamos muito satisfeitos com a mudança para a Universidade de Stanford. Este será um ambiente acadêmico fantástico e um ótimo lugar para morar. Dito isso, vamos sentir falta de nossos muitos amigos da Universidade de Chicago, onde o laboratório foi baseado por 12 anos.

8/1/2013. Bem-vindo ao nosso mais novo pós-doutorado Alexis Battle! É ótimo tê-la a bordo.

8/1/2013. Bem-vindos a Anil, Stoyan e Xun, que estão chegando a Stanford este mês. O resto do laboratório seguirá em breve ou trabalhará em Chicago durante o período de transição.

Olá Mundo. O laboratório muda para Stanford em 01/08/2013, após 12 anos na Universidade de Chicago.


Quantificando mudanças na seleção natural no uso de códons entre regiões de proteínas: uma abordagem de genética populacional

O viés de uso de códons (CUB), o uso não uniforme de códons sinônimos, ocorre em todos os domínios da vida. A hipótese do CUB adaptativo resulta da seleção para um movimento eficiente do ribossomo e / ou translação precisa. Evidências empíricas e computacionais indicam que mudanças na taxa de erro missense e na velocidade de tradução podem afetar a capacidade de uma proteína de atingir seu estado nativo. Dada a ligação crítica entre dobramento e função, vários estudos analisaram a relação entre o uso de códons e a estrutura da proteína. Os resultados têm sido frequentemente contraditórios devido aos vários métodos para quantificar as diferenças no uso de códons e não controlar adequadamente os fatores de confusão (por exemplo, tendências de aminoácidos). Para evitar essas deficiências, adotamos uma abordagem de genética populacional explícita para quantificar as mudanças específicas do códon na seleção natural relacionadas à estrutura da proteína. Nossos resultados revelam uma relação fraca entre o uso de códons e a estrutura da proteína, indicando que as diferenças na seleção entre as estruturas são muito sutis e / ou ocorrem de forma intermitente. Embora a magnitude das diferenças na seleção pareça pequena, nossos resultados indicam que a relação entre o uso de códons e a estrutura da proteína é mais complexa do que se acreditava anteriormente.Nosso trabalho demonstra o poder estatístico e os benefícios de estudar mudanças seletivas no uso de códons ou outras características genômicas a partir de uma abordagem explicitamente evolucionária.

Declaração de interesses concorrentes

Os autores declararam não haver interesses concorrentes.


Resultados e discussão

Análise de ciclo fechado imunoprecipitado e complexos 4E-BP

O modelo de loop fechado representa uma explicação amplamente divulgada para a seleção de mRNA para o início da tradução [12,18,19]. Avaliamos o perfil de ligação global do mRNA dos componentes do complexo de alça fechada em S. cerevisiae (Figura 1A). Usamos cepas portadoras de tags de purificação de afinidade em tandem carboxi-terminal genomicamente integradas (TAP) em cada um dos genes endógenos que codificam os componentes do complexo de alça fechada e os cultivamos sob condições de crescimento exponencial padrão em cultura em lote. Para fornecer uma análise sistemática do processo de seleção de mRNA e os mecanismos regulatórios que podem estar envolvidos, também investigamos o perfil de ligação de mRNA para cada uma das proteínas de ligação de eIF4E de levedura (4E-BPs), Caf20p e Eap1p, que são considerados repressores de tradução (Figura 1A) [40].

Ao estabelecer o sistema experimental de imunopurificação (IP) de mRNAs associados a cada um desses componentes, foi dada atenção especial a uma série de fatores. Em primeiro lugar, foi avaliado o impacto da marcação TAP nos níveis de cada fator. Como resultado, observamos que no CDC33-TAP cepa, a proteína eIF4E-TAP é superexpressa, então nós reconstruímos esta cepa para remover o marcador selecionável e restaurar os níveis de eIF4E para o tipo selvagem (dados não mostrados). Em segundo lugar, todas as cepas marcadas com TAP usadas neste estudo foram avaliadas em termos de crescimento (dados não mostrados) e tradução global de mRNA via perfil de polissomo (arquivo adicional 1A). As cepas carregam o alelo marcado com TAP como a única cópia desses genes essenciais do fator de iniciação da tradução, portanto, o fato de que os perfis de crescimento e polissoma são indistinguíveis da cepa parental sugere que as proteínas marcadas são totalmente funcionais. Terceiro, desenvolvemos um protocolo de esfera magnética para o IP rápido de proteínas de interesse, de modo que nosso IP seja concluído em 20 minutos para minimizar o impacto nos complexos de ribonucleoproteína. Um cuidado especial também foi tomado para otimizar as purificações de modo que a maioria de cada proteína marcada fosse purificada e, portanto, esgotada do extrato (compare as entradas, vazões e eluatos na Figura 1B). Na verdade, o único IP em que qualquer proteína marcada com TAP foi detectável no fluxo direto foi na amostra Pab1p. Como resultado, embora Pab1p seja uma das proteínas de ligação de RNA mais abundantes na célula [38], ainda imunopurificamos mais de 80% dessa proteína a partir de extratos de células inteiras (Figura 1B).

A fim de garantir que os IPs contenham proteínas que são consistentes com a formação do complexo de alça fechada e complexos de repressão 4E-BP, as amostras imunopurificadas foram sondadas com vários anticorpos em western blots (Figura 1C, D). Nestes blots, a migração de cada proteína marcada com TAP é retardada em relação à proteína não marcada (por exemplo, Pab1p-TAP, eIF4E-TAP e Caf20p-TAP na Figura 1C, D). Para eIF4G1-TAP e eIF4G2-TAP, a proteína A no epítopo TAP é detectada pelo anticorpo secundário, portanto, uma banda de proteína eIF4G2-TAP é observada, embora um anticorpo primário específico eIF4G1 tenha sido usado (Figura 1C). No entanto, para resumir esta análise, todos os componentes relevantes do complexo de loop fechado, eIF4E, eIF4G1 e Pab1p, estavam presentes nos IPs apropriados de eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 e Pab1p (Figura 1C). Da mesma forma, em termos dos complexos de repressão 4E-BP, ambos os IPs Eap1p e Caf20p contêm eIF4E, mas não eIF4G1 (Figura 1D), consistente com o modelo competitivo geralmente aceito para repressão mediada por 4E-BP representado na Figura 1A [41]. Finalmente, a capacidade das proteínas marcadas com TAP para interagir apropriadamente com o cap de mRNA foi avaliada usando cromatografia de afinidade Cap (arquivo adicional 1B). Cada um dos componentes marcados com TAP foi isolado na resina de maneira semelhante à proteína não marcada relevante, sugerindo que os marcadores TAP nas cepas não estão influenciando indevidamente a capacidade das proteínas marcadas de interagir com RNA ou proteínas ligadas ao RNA.

MRNAs enriquecidos e o significado funcional de sua associação

Os mRNAs que estão associados aos IPs para eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Pab1p, Caf20p e Eap1p em três réplicas biológicas foram quantificados por RNA-seq (consulte Materiais e métodos para obter detalhes e Arquivo adicional 2 para mapear estatísticas e contagens). Os dados foram processados ​​para gerar uma razão para cada espécie de mRNA em relação a uma amostra de RNA total da mesma cepa marcada com TAP. As bibliotecas foram sequenciadas a uma profundidade média de 7,8 ± 5,8 milhões de leituras únicas mapeadas, e os dados foram usados ​​para estabelecer listas de transcritos estatisticamente (taxa de descoberta falsa (FDR) & lt0,05) enriquecidos na amostra imunoprecipitada usando o modelo pareado de GLM de EdgeR (listas completas fornecidas no arquivo adicional 2). Uma análise de enriquecimento funcional gerada a partir dos dados RIP-seq é apresentada na Figura 2A, a partir da qual uma série de tendências são evidentes. Ambas as proteínas de ligação eIF4E, Caf20p e Eap1p, têm transcritos enriquecidos com IP, cujos produtos proteicos participam de todo um hospedeiro de funções nucleares (por exemplo, processamento e transcrição de RNA), possivelmente revelando uma conexão entre a regulação translacional e a regulação de eventos upstream na via de expressão gênica. Em um estudo anterior, avaliamos a significância funcional de Caf20p e Eap1p por meio do uso de microarrays para medir qualquer mudança na associação de mRNAs em gradientes de polissoma em tipo selvagem versus caf20Δ e eap1Δ cepas mutantes [40]. Isso revelou que mais de mil transcritos foram potencialmente regulados no nível translacional pelos 4E-BPs de levedura. Aqui, podemos avaliar como os mRNAs encontrados para estar associados a Caf20p e Eap1p por meio de RIP-seq mudam em termos de associação polissômica nas cepas de nocaute. As transcrições que se associam preferencialmente com Caf20p e Eap1p são deslocadas sutilmente, mas significativamente (usando uma gama de cortes de FDR), até as frações polissômicas no caf20Δ cepa em relação ao tipo selvagem (arquivo adicional 3). Para o eap1Δ cepa mutante em relação ao tipo selvagem, tendências semelhantes foram observadas em todo o eap1Δ gráficos, embora a escala de efeito seja significativamente menos pronunciada do que para o caf20Δ dados (dados não mostrados), potencialmente devido à sua abundância reduzida na célula em relação ao Caf20p [38]. No geral, esta comparação dos dados RIP-seq com estudos anteriores de microarray em mutantes é consistente com o papel descrito para os 4E-BPs como repressores de início de tradução.

Propriedades de transcrições preferencialmente associadas a componentes de malha fechada e 4E-BPs. (UMA) Termos da ontologia genética que são significativamente super-representados (vermelho) ou sub-representados (verde) para cada um dos conjuntos de transcritos enriquecidos no menu suspenso de afinidade das seis proteínas mostradas no topo. (B, C) Box and whisker plot detalhando a variação na ocupação do ribossomo [42] e comprimento da cauda poli (A) [43] para os transcritos enriquecidos com os componentes de loop fechado e 4E-BPs. Um teste estatístico de classificação de Wilcoxon entre conjuntos de transcrições revelou uma alta associação para ambas as características com as transcrições enriquecidas com Pab1p. Nestes gráficos, as caixas coloridas representam a extensão dos quartis superior e inferior com o entalhe representando a mediana. As linhas verticais pontilhadas representam os extremos superior e inferior, enquanto os círculos são valores periféricos.

Para avaliar outras correlações para as listas de genes individuais, eles foram comparados com uma série de parâmetros diferentes, incluindo poli (A) comprimento da cauda [43] e ocupação de ribossomo [42] (Figura 2B, C). Surpreendentemente, os mRNAs associados a Caf20p e Eap1p têm ocupações de ribossomo tão altas quanto mRNAs associados a eIF4G1 ou eIF4G2. Pode haver uma série de razões para isso: a interação com eIF4E pode não ser a única maneira pela qual Caf20p e Eap1p podem se associar a mRNAs, ou os 4E-BPs de levedura podem simplesmente amortecer a tradução de mRNAs altamente traduzidos de modo que, em média , os mRNAs associados a 4E-BP ainda podem ter uma alta ocupação de ribossomo. Talvez o resultado mais surpreendente dessas comparações seja que os transcritos enriquecidos com Pab1p estão associados não apenas com caudas poli (A) mais longas, como seria de se esperar, mas também com os altos níveis de ocupação de ribossomo (Figura 2B, C). O alto nível de correlação entre o comprimento da cauda poli (A) e associação de ribossomo foi observado antes [43], mas aqui mostramos que o nível de ocupação de ribossomo para os transcritos enriquecidos com Pab1p foi significativamente maior do que para os transcritos associados a outros componentes de o complexo de alça fechada (Figura 2C). Esses resultados destacam o Pab1p como um jogador importante para mRNAs onde a tradução é particularmente eficiente e robusta.

O perfil de ligação de RNA Pab1p é diferente daquele dos outros componentes de circuito fechado

A fim de fornecer uma avaliação quantitativa da variação entre diferentes conjuntos de dados RIP-seq em pares, usamos um modelo de interação derivado da função Modelo Linear Generalizado (GLM) dentro do pacote de software EdgeR (Bioconductor) [44,45] . Mais especificamente, comparamos a proporção dos níveis de mRNA nas amostras de IP em relação ao nível em uma amostra de RNA total (log2(IP / Total)) para cada gene em cada um dos seis experimentos de imunoprecipitação e examinou as correlações de pares entre eles (Figura 3A). Aqui, o perfil completo dos valores de enriquecimento de mRNA é apresentado, em vez daqueles definidos por um corte estatístico. Esses dados são apresentados como gráficos de dispersão comparando os conjuntos de dados, destacando em vermelho as transcrições encontradas como significativamente diferentes entre os experimentos de acordo com o GLM. Surpreendentemente, esses gráficos enfatizam a alta correlação observada nos perfis de ligação dos três membros do complexo eIF4F (correlações de Pearson de 0,755, 0,753 e 0,812). Da mesma forma, os dois perfis de ligação 4E-BP, para Caf20p e Eap1p, também exibem uma alta correlação semelhante entre si. Notavelmente, enquanto Pab1p exibe correlações positivas com componentes do complexo eIF4F, é o único fator avaliado que exibe uma correlação negativa com os perfis dos repressores translacionais Caf20p e Eap1p.

Comparações pareadas diretas entre experimentos RIP-seq para cada um dos componentes de malha fechada e 4E-BPs. (UMA) Os gráficos de dispersão exibem alterações no registro2 alterações na dobra mediana (IP / total) para cada uma das seis proteínas comparadas umas com as outras. Destacados em vermelho estão aqueles transcritos identificados como sendo significativamente diferentes entre os dois experimentos de acordo com o modelo GLM de interação de edgeR em um FDR & lt0,05. (B) Tabela que descreve o número total de transcrições que variam significativamente nas comparações de pares em (UMA). Os números representam transcrições que estão super-representadas nos IPs das proteínas listadas nas colunas em relação às proteínas listadas em cada linha.

Os números de transcrições em variação com o modelo de interação são mostrados na Figura 3B (detalhado no arquivo adicional 4). Isso mostra o número de transcrições diferencialmente enriquecidas ou sub-representadas para cada comparação de pares de acordo com o GLM (os pontos de dados vermelhos) e suporta as tendências gerais observadas nos gráficos de dispersão (Figura 3A). Por exemplo, nenhuma transcrição foi identificada como significativamente diferente em sua associação com as duas isoformas de eIF4G, eIF4G1 e eIF4G2. Esta observação é consistente com dados recentes que sugerem que essas duas isoformas são provavelmente redundantes funcionalmente [17]. Esses resultados, combinados com os dados acima, sugerem que o complexo eIF4F explica a grande maioria das interações de eIF4E, eIF4G1 e eIF4G2 com mRNA. Isso é particularmente intrigante, dado que os repressores de tradução Caf20p e Eap1p inibem a tradução por meio da interação com eIF4E, ainda que seu perfil de ligação exiba correlação mínima com o de eIF4E. As possíveis explicações para isso são que os 4E-BPs podem interagir com mRNAs de maneiras que são independentes de eIF4E ou que o complexo 4E-BP-eIF4E pode estar associado de forma menos estável ao mRNA.

Também é aparente que se Pab1p fosse estequiométrico com o complexo eIF4F em cada mRNA, então o perfil de ligação do mRNA para Pab1p seria semelhante ao de eIF4E, eIF4G1 e eIF4G2. No entanto, esse claramente não é o caso. Deve-se notar que Pab1p se liga à extremidade 3 'do mRNA e os componentes eIF4F se associam à extremidade 5'. É possível que essa diferença explique algumas das variações que são aparentes entre esses conjuntos de dados RIP-seq. Alternativamente, esses dados podem destacar que o complexo de loop fechado é relevante apenas para a tradução de um subconjunto de mRNAs. Curiosamente, o perfil Pab1p se correlaciona inversamente com aqueles dos repressores translacionais Caf20p e Eap1p (na verdade, em vez dos perfis eIF4G é de longe a anti-correlação mais forte com perfis 4E-BP), e os transcritos enriquecidos com Pab1p também têm ribossomo mais alto ocupação (Figura 2B), enfatizando uma forte correlação entre a associação Pab1p e tradução ativa.

O agrupamento de perfis de enriquecimento RIP-seq revela tendências globais no controle translacional por meio do complexo de loop fechado e Pab1p

Embora a comparação entre pares dos conjuntos de dados RIP-seq tenha fornecido insights significativos, a comparação dos perfis de ligação de RNA em todos os conjuntos de dados RIP-seq pode ser visualizada simultaneamente usando um método de agrupamento hierárquico. Os dados RIP-seq foram, portanto, expressos na forma de um mapa de calor, exibindo as três réplicas biológicas fortemente correlacionadas para cada membro de loop fechado como colunas e transcrições individuais como linhas (Figura 4). A fim de garantir um número mínimo de falsos positivos, um corte estatístico mais conservador juntamente com um filtro baseado em contagem foi usado para a análise de agrupamento. Mais especificamente, o mapa de calor é restrito às transcrições que exibem um enriquecimento significativo (FDR & lt0.01) ou sub-representação de acordo com o modelo GLM de EdgeR em pelo menos um dos IPs, bem como às transcrições com mais de 20 leituras em cada um dos as amostras de extrato total pertinentes. No total, 3.173 dos genes anotados no genoma da levedura satisfazem esses critérios. Portanto, uma proporção substancial do transcriptoma de levedura mostra enriquecimento ou sub-representação pouco discernível e estatisticamente significativo em relação ao mRNA total, e o mapa de calor concentra-se naqueles que apresentam.

Quatro clusters principais são aparentes nos conjuntos de dados RIP-seq. Mapa de calor derivado do agrupamento hierárquico dos perfis de ligação do mRNA (log2 alterações de vezes IP / Total) das seis proteínas no estudo vermelho e azul representam mRNAs super e sub-representados, respectivamente. A análise foi restrita a 3.173 transcrições que foram identificadas como super-representadas ou sub-representadas em qualquer um dos seis conjuntos de dados e o agrupamento hierárquico foi realizado conforme descrito na seção Materiais e métodos. O mapa de calor apresentado contém 2.767 transcrições separadas em 7 grupos que foram agrupados nos grupos I a IV com base na similaridade dos padrões de associação.

Usando agrupamento hierárquico padrão (consulte Materiais e métodos para obter detalhes) dos perfis de enriquecimento RIP-seq, quatro grupos amplos (I a IV) podem ser definidos que abrangem 2.767 transcrições (Figura 4 Arquivo adicional 5). Estes quatro grupos visualmente distintos exibem padrões intrigantes de associação com os componentes de circuito fechado e os repressores translacionais Caf20p e Eap1p, manifestados em grande parte como blocos de enriquecimento / sub-representação em relação a eIF4E / 4G1 / 4G2 / Pab1p e Caf20p / Eap1p. O Grupo I contém mRNAs que estão principalmente sub-representados em IPs de todos os componentes testados, com exceção de Pab1p. O Grupo II contém mRNAs enriquecidos em IPs dos repressores de tradução Caf20p e Eap1p. O Grupo III consiste em dois clusters que contêm mRNAs que são enriquecidos em IPs de componentes de circuito fechado, mas sub-representados nas amostras Caf20p e Eap1p: um perfil de associação que pode ser esperado para mRNAs onde a tradução é altamente ativa e iniciada de forma robusta por meio do circuito fechado complexo. Finalmente, o grupo IV é um grupo grande e amplo de mRNAs que são enriquecidos em conjuntos de dados eIF4F e 4E-BP, com três subclusters determinados pelo nível de enriquecimento com Pab1p ou os componentes eIF4F aqui pode haver uma competição complexa entre a interação de componentes de loop fechado e os repressores de tradução. É particularmente intrigante que cerca de metade dos mRNAs do grupo IV são sub-enriquecidos para Pab1p, embora esses mesmos mRNAs sejam enriquecidos com eIF4F. Parece plausível que, para esses mRNAs, a cauda poli (A) poderia interagir com outras proteínas de ligação de RNA, como Nab2p ou Sgn1p, que foram sugeridas para competir com Pab1p anteriormente [46]. No geral, esses agrupamentos destacam a possibilidade de que a iniciação da tradução por meio do complexo de loop fechado pode ser mais importante para alguns mRNAs do que outros. Em particular, o grupo III define os mRNAs que parecem interagir preferencialmente com o complexo de alça fechada e os mRNAs do grupo II que interagem preferencialmente com os 4E-BPs.

Antes de considerar esses grupos translacionais globais de mRNAs em mais detalhes, é interessante notar que, conforme encontrado anteriormente, usando o modelo GLM e os gráficos de dispersão (Figura 3), há uma alta correspondência entre os perfis eIF4E, eIF4G1 e eIF4G2 IP, enquanto o padrão para Pab1p parece diferente (Figura 4). Além disso, embora os perfis para as leveduras 4E-BPs, Caf20p e Eap1p, sejam muito semelhantes, eles são diferentes dos padrões observados para os outros IPs. Isso é particularmente evidente no dendrograma de agrupamento apresentado nas colunas da Figura 4. De fato, os perfis eIF4G1 e eIF4G2 são tão semelhantes que não podem ser distinguidos no dendrograma. O fato de que os componentes eIF4F eIF4E e eIF4G exibem um perfil de interação de mRNA semelhante, enquanto que para Pab1p parece diferente novamente aponta para um modelo em que o complexo de alça totalmente fechada é relevante apenas para a tradução de um subconjunto de mRNAs. Além disso, uma vez que no grupo II os 4E-BPs podem ser identificados como interagindo preferencialmente com transcritos onde os fatores de tradução não são enriquecidos, parece que o modelo simples de interação eIF4E-4E-BP em mRNAs para reprimir a tradução pode ser uma simplificação excessiva. .

A fim de fornecer uma validação independente para os clusters identificados na Figura 4 e os conjuntos de dados RIP-seq como um todo, uma série de análises quantitativas de transcriptase reversa PCR (qRT-PCR) foram conduzidas em RNA preparado a partir de IPs dos fatores marcados com TAP e comparados com os níveis de RNA nas frações de entrada (Figura 5). Esses dados exibem uma excelente correlação com a análise RIP-seq. Os mRNAs do Grupo III são enriquecidos com eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 e Pab1p, mas não com 4E-BPs. Os mRNAs do Grupo II são predominantemente enriquecidos com 4E-BPs.Os mRNAs do grupo IV são enriquecidos para a maioria dos componentes marcados com TAP e os mRNAs do grupo I são sub-enriquecidos para todos os fatores, exceto Pab1p. Esta última observação é particularmente notável e sugere que Pab1p desempenha um papel fundamental na tradução desses mRNAs de alta abundância. Foi sugerido que Pab1p aprimora vários estágios no processo de tradução, incluindo a junção de subunidades durante a iniciação [22] e a terminação da tradução / reciclagem de ribossomos [23]. Portanto, uma possibilidade é que Pab1p atue para aumentar essas etapas independentemente das proteínas que interagem com cap. Alternativamente, Pab1p poderia estar agindo de uma forma até então não identificada.

Validação de agrupamentos de transcritos por RT-PCR quantitativo. A figura mostra quatro gráficos, um para cada um dos grupos de transcrição. Os mRNAs indicados são quantificados nas amostras de IP em relação ao RNA total para o controle não marcado e os componentes reguladores de circuito fechado / 4E-BP. As barras de erro são ± erro padrão de três experimentos replicados.

Outro aspecto dos dados que é destacado pela análise de qRT-PCR é que, apesar do sub-enriquecimento de transcritos com vários componentes de loop fechado e 4EBPs em relação a uma amostra de RNA total, os mRNAs ainda estão presentes nos IPs quando comparados com o nível de mRNA obtido a partir de uma cepa não marcada (Figura 5 comparar BY4741 com as cepas marcadas com TAP). Isso também é aparente a partir dos dados RIP-seq medidos pelos valores RPKM (leituras por quilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas) nos experimentos de IP (arquivo adicional 2). Ou seja, mesmo aqueles mRNAs que são sub-enriquecidos com eIF4F, Pab1p ou 4E-BPs ainda estão claramente ligados por esses componentes, embora em um nível significativamente reduzido.

Análise funcional de mRNAs enriquecidos e clusters de circuito fechado

Para decifrar ainda mais o papel funcional dos componentes de alça fechada na iniciação da tradução em levedura, examinamos os grupos de mRNAs derivados do mapa de calor para tendências e padrões em termos de função do gene. Inicialmente nos concentramos no grupo III, já que este grupo exibe o padrão mais claro de associação com componentes complexos de alça fechada. Descobrimos que os mRNAs do grupo III exibem alta ocupação de ribossomo e seus produtos de proteína são, em média, altamente abundantes (Figura 6B, C). Isso é consistente com a iniciação da tradução dependente do complexo de loop fechado, atuando como uma rota eficiente para a produção de proteínas estáveis ​​altamente abundantes. Uma análise funcional dos mRNAs presentes neste grupo dá mais peso a essa ideia, pois demonstra um enriquecimento muito substancial em mRNAs para proteínas ribossômicas (Figura 6A) 115 dos 395 genes no grupo III codificam proteínas ribossômicas. O fato de que os mRNAs para as proteínas ribossômicas são fortemente enriquecidos com a maquinaria de loop fechado fornece um paralelo interessante com a situação em células de mamíferos, onde muitos dos mRNAs que codificam proteínas ribossômicas exibem padrões regulatórios discretos em virtude de uma oligopirimidina 5 'terminal (TOP) motivo [47]. Não desta maneira cisAs sequências atuantes são óbvias nos mRNAs da proteína ribossômica de levedura ou no conjunto de mRNA do grupo III (dados não mostrados), no entanto, parece provável que tais elementos devem ditar o nível muito alto de associação que observamos com os componentes do complexo de alça fechada. Os paralelos entre as propriedades do mRNA do grupo III e aquelas dos mRNAs TOP de mamíferos são mais profundos. Por exemplo, os mRNAs TOP são especialmente sensíveis à regulação pelo alvo mamífero da rapamicina (mTOR), e evidências recentes sugerem que isso ocorre por meio do repressor de tradução 4E-BP1 [48]. A regulação específica dos mRNAs TOP desta maneira sugere que esses mRNAs são altamente sensíveis ao complexo cap e, possivelmente, à inibição do complexo de alça fechada [48]. Portanto, o enriquecimento específico de mRNAs de proteínas ribossômicas com componentes do complexo de alça fechada de levedura destaca a possibilidade de que um mecanismo paralelo possa existir na levedura.

Análise funcional de proteínas codificadas pelos agrupamentos de transcritos. (UMA) Termos da Ontologia Genética (GO) que estão significativamente sobre-representados (vermelho) ou sub-representados (azul) para transcrições que estão presentes nos quatro clusters definidos na Figura 4. Apenas os termos GO que mostram diferenças significativas (por meio de um teste de Fisher comparando esse agrupamento com o resto do genoma FDR & lt0,01) para pelo menos um agrupamento e também teve diferenças entre os agrupamentos (teste de qui-quadrado FDR & lt0,01) são representados. A escala de cores representa a significância estatística do enriquecimento ou sub-enriquecimento do termo GO conforme medido por log10FDR. Por conveniência, o log de enriquecimento do termo GO10Os valores de FDR foram multiplicados por -1. (B, C) Box e whisker plots, como na Figura 2, detalhando a variação na ocupação do ribossomo [42] e abundância de proteínas de acordo com o banco de dados PaxDb [49] para os transcritos enriquecidos com os componentes de loop fechado e 4E-BPs. Um teste de classificação de Wilcoxon entre conjuntos de transcrições em pares revelou uma diferença significativa (P & lt 1 × 10 -7) em todos os casos para ambos os gráficos, sendo a única exceção entre o grupo I e o grupo III para a ocupação ribossômica, que foi significativa em P & lt 0,03.

Semelhante ao grupo III, os mRNAs do grupo I têm altas ocupações de ribossomo e seus produtos de proteína são altamente abundantes (Figura 6B, C). No entanto, o padrão de associação com os componentes de malha fechada é muito diferente para o grupo I em relação ao grupo III. Os mRNAs do Grupo I são geralmente sub-representados para eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p e Eap1p. De fato, os IPs de Pab1p são os únicos em que esse grupo de mRNAs não está sub-representado em relação ao total (Figuras 4 e 5). Uma análise das funções dos produtos proteicos dos mRNAs dentro deste grupo destaca o metabolismo de aminoácidos e nucleotídeos, metabolismo de carboidratos / geração de energia, aminoacilação de tRNA e tradução (Figura 6A Arquivo adicional 5). Surpreendentemente, este grupo inclui mRNAs que codificam os fatores glicolíticos, como ENO2, TDH3 e PGK1e fatores de tradução, como TEF1, TEF2, EFB1, TIF1 e TIF2, que estão entre as proteínas mais expressas e, portanto, abundantes na célula. A sub-representação dos mRNAs neste grupo com componentes eIF4F combinados com a alta abundância dos produtos de proteína sugere que o complexo de alça fechada é muito menos relevante para o início da tradução de alta eficiência para este grupo de mRNAs do que para os mRNAs do grupo III. É plausível, portanto, que tais mRNAs exijam uma alternativa ao mecanismo de loop fechado para seu início de tradução altamente eficiente. Uma possibilidade é que Pab1p esteja de alguma forma envolvido em tal mecanismo alternativo de alta eficiência, especialmente considerando que os mRNAs do grupo I estão sub-representados com todos os componentes da proteína de alça fechada, exceto Pab1p. Curiosamente, no que diz respeito a tal modelo, os mRNAs que são estatisticamente super-representados em Pab1p IPs exibem, em média, caudas poli (A) mais longas e uma ocupação de ribossomo mais alta do que a média (Figura 2B, C). Pab1p foi previamente sugerido para atuar em várias etapas no processo de tradução: iniciação interna, junção da subunidade ribossômica 60S e término da tradução. É possível, portanto, que uma dessas atividades explique a observação de que os mRNAs do grupo I parecem fortemente traduzidos, embora eles interajam menos bem com os componentes do eIF4F. As observações para esta coorte de mRNAs combinadas com a correlação inversa entre Pab1p e os 4E-BPs em termos de seus perfis de ligação de mRNA aumentam a imagem em que a interação Pab1p representa um preditor chave da eficiência da tradução.

Os mRNAs do grupo II do mapa de calor incluem mRNAs que estão preferencialmente associados aos 4E-BPs e, portanto, devem ser reprimidos traducionalmente. Como acima, embora esses transcritos pareçam sub-enriquecidos para eIF4E, os mRNAs ainda estão claramente presentes nos experimentos de IP, mas estão sub-enriquecidos em relação a outros transcritos fortemente ligados. Uma análise funcional dos mRNAs do grupo II identifica um forte enriquecimento para certas vias biossintéticas de aminoácidos, incluindo aquelas para os aminoácidos hidrofóbicos e básicos (Figura 6A Arquivo adicional 5), embora deva ser observado que muitos genes biossintéticos de aminoácidos também estão presentes nos grupos I e IV. No entanto, conexões intrigantes foram identificadas entre a via Gcn que controla a biossíntese de aminoácidos e os 4E-BPs de levedura [50]. No geral, a descoberta de que mRNAs específicos são enriquecidos com 4E-BPs é consistente com a suposição de que tais mRNAs não são críticos em crescimento exponencial ilimitado, portanto, a tradução é reprimida em virtude dos repressores 4EBP. Esta análise também é consistente com a hipótese de que os 4E-BPs de levedura não são reguladores globais da iniciação da tradução, mas funcionam para regular de uma maneira específica do mRNA [40,51,52].

Finalmente, o grande grupo representado pelo grupo IV é caracterizado por fortes interações com ambos eIF4F e os repressivos 4E-BPs. As proteínas codificadas por este grupo de mRNAs exibem uma gama muito ampla de funções; este grupo é enriquecido em funções ligadas à transcrição, fosforilação de proteínas e ao ciclo celular, e é sub-enriquecido para funções ligadas à tradução e ao ribossomo. Este grupo contém 79 dos 127 mRNAs que codificam a proteína quinase, enquanto nenhum outro grupo contém quaisquer mRNAs da proteína quinase. Portanto, parece que este grupo contém mRNAs para processos que são rigidamente regulados na célula, incluindo sinalização e ativação de vias e respostas a estímulos. Nossos dados sugerem que parte disso se manifesta no nível translacional. Sugerimos que esses processos estão sob controle finito, onde existe um equilíbrio delicado no nível de um mRNA individual ligado pelo circuito fechado em relação aos 4E-BPs. Também pode ser verdade que este grupo está preparado para que a desrepressão da tradução por meio do alívio da repressão 4E-BP represente um meio de liberar um 'freio de mão molecular'.

Estimativa da estequiometria de interações de proteínas com eIF4E ligado a mRNA

A descoberta de que um grande grupo de mRNAs está superrepresentado em imunoprecipitações de eIF4G e 4E-BPs (Figura 4, mRNAs do grupo IV) destaca o potencial para interações competitivas com eIF4E nos mRNAs entre as várias proteínas de ligação de eIF4E. Partindo do pressuposto de que a soma das interações das quatro proteínas de ligação eIF4E deve se aproximar do perfil de ligação de RNA para eIF4E como o porteiro para iniciação (e, portanto, tradução Figura 7A, B), podemos expressar isso matematicamente por meio de uma combinação linear simples dos quatro perfis (Figura 7C).

Um modelo estequiométrico para ligação eIF4E destaca o CAF20 e EAP1 mRNAs como outliers significativos. (UMA) Diagrama que mostra a base teórica para o modelo estequiométrico onde as quatro proteínas, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p e Eap1p, todas se ligam à proteína de ligação cap eIF4E, que por sua vez se liga a mRNAs em um equilíbrio complexo. Este modelo presume que o perfil de ligação do mRNA eIF4E pode ser modelado por meio de uma combinação linear dos outros perfis de proteína de loop fechado. (B) Mapas de calor de enriquecimento de mRNA para cada uma das quatro proteínas de ligação de eIF4E e um mapa de calor de enriquecimento de mRNA previsto para eIF4E com base em um melhor ajuste do modelo aos dados RIP-seq, que por sua vez podem ser comparados com o enriquecimento de mRNA observado para eIF4E. Uma excelente correlação é observada entre os perfis de mapa de calor previstos e observados, com R 2 = 0,75. (C) Equação detalhando a afirmação de que o perfil de ligação para eIF4E é igual à soma dos perfis observados para todas as proteínas de ligação eIF4E, com os coeficientes β correspondentes representando a contribuição de cada perfil individual para o modelo geral (todos significativos P & lt 0,002). (D) Um gráfico mostrando os valores do modelo ajustado e os resíduos correspondentes da modelagem de regressão linear. Notavelmente, o CAF20 e EAP1 Os mRNAs são outliers significativos do modelo ao traçar seus resíduos a partir dos valores de enriquecimento eIF4E previstos.

Aqui, os valores β são coeficientes que representam as contribuições nominais de cada proteína de ligação de eIF4E para o perfil de ligação de eIF4E, tomando o perfil de eIF4E como um proxy geral para iniciação dependente de cap. Podemos estimar os valores dos coeficientes β na equação acima usando regressão linear múltipla padrão para construir um modelo para o log2(alterações de dobra (IP / Total)) para eIF4E construído a partir do log2(alterações de vezes (IP / Total)) das outras quatro proteínas. Isso produz um bom modelo com R 2 = 0,75. Os coeficientes β para os parceiros de ligação do eIF4E igualados ao perfil de ligação do mRNA do eIF4E deste modelo são exibidos na Figura 7C. Cada proteína faz uma contribuição altamente significativa para o modelo, com P-valores estimados em abaixo de 0,002 em todos os casos. Os coeficientes β para eIF4G1 e eIF4G2 são grandes e positivos, enquanto o coeficiente de Caf20p é baixo e o de Eap1p é negativo. Estes refletem amplamente os valores de correlação de GLM de pares entre eIF4E e as outras proteínas mostradas na Figura 3, e as semelhanças no mapa de calor na Figura 4. Por exemplo, os perfis de ligação de RNA de eIF4G1 e eIF4G2 estão intimamente relacionados aos de eIF4E, ao passo que os perfis de ligação de RNA dos 4EBPs, Caf20p e Eap1p, estão mal correlacionados com eIF4E's. Queremos deixar claro que os coeficientes β do modelo não são simplesmente explicados pela abundância relativa dos componentes de loop fechado: tomando estimativas da abundância relativa de proteínas do conjunto de dados proteômicos quantitativos integrados PaxDb [49], os níveis das quatro proteínas de levedura são: eIF4E = 1.011 ppm, eIF4G1 = 444 ppm, eIF4G2 = 118 ppm, Caf20p = 306 ppm, Eap1p = 57 ppm. Uma análise como esta é complicada pelo alto grau de colinearidade ao comparar os perfis de ligação do mRNA de eIF4G1 com eIF4G2 ou de Caf20p com Eap1p. Essa colinearidade pode ser responsável pelo maior coeficiente para eIF4G2 em relação a eIF4G1, embora a abundância de proteínas sugira que eIF4G1 deva desempenhar um papel mais proeminente. No entanto, tal colinearidade não pode explicar o coeficiente relativamente baixo de Caf20p e o coeficiente negativo de Eap1p. Os coeficientes baixo e negativo para Caf20p e Eap1p, respectivamente, são provavelmente indicativos de uma rede mais complexa de interações com mRNA ou outras proteínas de ligação de RNA que não dependem de eIF4E e da estrutura cap de mRNA.

De longe, a observação mais impressionante da modelagem é mostrada no gráfico dos resíduos jackknife versus os valores ajustados (Figura 7D). Este é um gráfico de diagnóstico comum em regressão linear, onde os resíduos padronizados para transcrições individuais devem se concentrar em uma média de 0 para um modelo bem descrito. Portanto, como pode ser visto na Figura 7D, quase todos os dados se ajustam bem a esse modelo. No entanto, os dois mRNAs que estão fora desse modelo em grande medida são aqueles que codificam os 4E-BPs, Caf20p e Eap1p. Esta observação sugere fortemente que, dentro dos limites do complexo de loop fechado, o início da tradução do CAF20 e EAP1 Os mRNAs estão fora desse modelo e são regulados de maneira diferente.

Caf20p interage preferencialmente e regula sua própria transcrição

A comparação de pares estatística direta entre pull-downs de proteínas (Figura 3) também aponta para o comportamento atípico do CAF20 e EAP1 mRNAs. Os perfis de ligação de mRNA de eIF4E e eIF4G1 são altamente correlacionados com apenas um punhado de transcritos preferencialmente enriquecidos no pull-down eIF4E (Figura 3B). Notavelmente, no entanto, entre as seis transcrições estatisticamente enriquecidas estão CAF20, EAP1 e TIF4632 mRNAs, que codificam 4E-BPs Caf20p e Eap1p, e eIF4G2, respectivamente (Figura 8A). Da mesma forma, quando os pull-downs eIF4E e eIF4G2 foram comparados, observamos 24 transcrições super-representadas no pull-down eIF4E em relação ao pull-down eIF4G2 (Figura 3B). Novamente mRNAs para CAF20 e EAP1, e, desta vez TIF4631, que codificam eIF4G1, foram preferencialmente associados a eIF4E (Figura 8A). Esses dados mostram que o CAF20/EAP1 Os mRNAs são enriquecidos com eIF4E, mas não com eIF4G1.

Caf20p autorregula sua própria transcrição. (UMA) Transcrições super-representadas nos menus suspensos eIF4E em relação a eIF4G1 (azul claro) ou eIF4G2 (rosa). Os dados são retirados do modelo GLM apresentado na Figura 3B. (B) Um gráfico de superfície tridimensional de P-valores detalhando o nível de significância para o enriquecimento das transcrições de loop fechado / eIF4E-BP individuais nos seis experimentos RIP-seq. (C) Uma validação RT-PCR semiquantitativa da associação da proteína Caf20p com seu próprio transcrito usando primers projetados para as regiões 1 a 6 representadas na figura (detalhado no arquivo adicional 6). O nível dessas regiões do CAF20 transcrito foi determinado em amostras purificadas por afinidade TAP do CAF20-TAP cepas em relação às cepas de tipo selvagem (WT). (D) Um diagrama que descreve dois modelos possíveis pelos quais Caf20p poderia interagir com seu próprio transcrito para regular a produção de proteínas. (E) Purificação de afinidade de TAP e análise de Western blot de cepas marcadas com eIF4E-TAP, investigando a associação de eIF4E com proteína Caf20p endógena e Caf20p de tipo selvagem marcada com Flag ou Caf20 m2 p marcada com Flag (que teve a região de ligação eIF4E mutada). (F) Validação da especificidade de primers de RT-PCR usando RNA total das cepas representadas no gráfico de barras para qualquer endógeno CAF20 transcrições ou com marcação CAF20 transcrições (arquivo adicional 6). As barras de erro são ± erro padrão de três experimentos replicados. (G) qRT-PCR para o endógeno e marcado com Flag CAF20 transcritos de uma purificação de afinidade eIF4E-TAP usando os primers validados acima. o CAF20 ou CAF20-fl os transcritos são quantificados nas amostras IP em relação ao RNA total para as cepas listadas. As barras de erro são ± erro padrão de três experimentos replicados. (H) Análise de Western blot usando extratos de caf20 cepas de deleção transformadas com plasmídeos centroméricos (baixa cópia) portadores de qualquer CAF20-fl gene ou o m2 mutante de CAF20-fl. Três diferentes transformantes únicos são analisados ​​para cada cepa e os blots são sondados com anticorpos anti-Flag para detectar Caf20-fl em relação aos anticorpos anti-eIF4A de controle.

Para explorar ainda mais a possibilidade de que os componentes da proteína do sistema de loop fechado estão envolvidos na regulação de mRNAs que codificam outros componentes do sistema, uma análise estatística baseada na significância de qualquer enriquecimento para cada um dos transcritos que codificam as seis proteínas imunopurificadas através do RIP -seq experimentos foram realizados. Esses dados são apresentados como um gráfico de superfície tridimensional na Figura 8B, onde os picos (roxo) denotam a significância do enriquecimento da transcrição em IPs específicos, enquanto os vales (azul) representam a significância de qualquer sub-representação. De longe, as relações mais marcantes nesta trama estão associadas à ligação Caf20p e eIF4E do CAF20 transcrição (Figura 8B). De fato, CAF20 é de longe o transcrito mais super-representado na imunoprecipitação Caf20p com relação ao mRNA total da análise EdgeR GLM, com um FDR corrigido & lt10 -30.

Com base nos resultados acima, teorizamos que a interação do Caf20p e eIF4E com o CAF20 a transcrição pode representar um mecanismo autoregulatório (Figura 8D). Curiosamente, a este respeito, estudos anteriores notaram uma dificuldade na superexpressão genética de Caf20p: a expressão de todos os outros componentes do complexo de alça fechada de plasmídeos de alta cópia em levedura leva a um aumento de duas a cinco vezes no nível de proteína, enquanto os plasmídeos de alta cópia portando o CAF20 gene não gera tal superexpressão. No entanto, tal plasmídeo gera níveis de tipo selvagem de Caf20p em um caf20Δ estirpe [52]. A fim de validar diretamente a observação de que Caf20p interage com seu próprio transcrito, purificações de afinidade TAP foram realizadas em cepas de tipo selvagem e Caf20p-TAP e os RNAs associados foram fragmentados por tratamento com RNase III. Um ensaio RT-PCR semiquantitativo foi realizado nessas amostras para avaliar a eficiência do enriquecimento de seis regiões diferentes do CAF20 transcrição (Figura 8C). Os produtos de RT-PCR foram identificados em todo o CAF20 mRNA nas amostras imunoprecipitadas, ao passo que nenhum produto foi encontrado em amostras de cepas portadoras não marcadas CAF20. Enriquecimento particular foi observado para pares de iniciadores cobrindo a extremidade 3 'da estrutura de leitura aberta (Figura 8C). Assim, por meio de um ensaio independente, esses dados confirmam que Caf20p pode interagir com o CAF20 mRNA.

Embora os dados acima realcem a possibilidade de que Caf20p auto-regule a tradução de sua própria transcrição, também é possível que Caf20p parcialmente traduzido nascente interaja através de seu domínio de ligação eIF4E amino-terminal com eIF4E ligado ao CAF20 mRNA 5 'cap (Figura 8D). Isso poderia explicar o enriquecimento da CAF20 mRNA com eIF4E e Caf20p. Essas interações co-tradução de complexos de proteína-proteína foram descritas anteriormente e podem explicar o co-enriquecimento de mRNAs que codificam uma subunidade específica com outras subunidades de proteína do mesmo complexo [53].

Para explorar mais essa possibilidade, testamos se o enriquecimento de CAF20 O mRNA com eIF4E é dependente da associação da proteína Caf20p com eIF4E. Usamos uma estratégia onde Caf20p marcado com Flag ou Caf20 m2 p marcado com Flag (onde a região de Caf20p que interage com eIF4E foi interrompida por meio de duas mutações missense) foram expressos a partir de plasmídeos em uma cepa eIF4E-TAP já abrigando o tipo selvagem genômico endógeno CAF20 alelo. Isso coloca o mRNA marcado com Flag em competição com o CAF20 mRNA e permite que o impacto da mutação de ligação eIF4E nesta competição seja analisado. Como um controle para o sistema, o Western blotting de eIF4E purificado por afinidade de TAP capturou Caf20p endógeno e Caf20p marcado com Flag (Figura 8E), enquanto que quando a proteína mutante Flag-Caf20 m2 p foi colocada em competição com Caf20p endógeno, eIF4E apenas interagiu com a proteína endógena (Figura 8E), confirmando que as mutações m2 interrompem a ligação de eIF4E [52].

qRT-PCR foi usado para distinguir os endógenos CAF20 mRNA do Flag-tagged CAF20 mRNA. As reações de qRT-PCR de controle de amostras de RNA total demonstraram especificidade de par de primer (Figura 8F). Em uma cepa de tipo selvagem, apenas o endógeno CAF20 O mRNA foi detectado, enquanto apenas a forma marcada do mRNA foi identificada em uma cepa contendo apenas o CAF20 gene (caf20Δ Flag-CAF20 Figura 8F). Finalmente, em cepas que carregam tanto o endógeno CAF20 e marcado com bandeira CAF20 genes, ambos os mRNAs foram detectados (Figura 8F). Portanto, usamos este sistema para medir o nível de ambos os sinalizadores e endógenos CAF20 mRNAs com eIF4E imunoprecipitado, e ambos os mRNAs foram detectados em imunoprecipitações de eIF4E. Criticamente, o sinalizado CAF20 mRNA associado com eIF4E independentemente de o produto proteico deste mRNA poder interagir com eIF4E (compare os resultados para cepas contendo pCAF20-Fl contra pCAF20 m2 -Fl Figura 8G). Portanto, a interação de eIF4E com o CAF20 O mRNA não depende da capacidade da proteína Caf20p de interagir com eIF4E. A partir desses dados, postulamos que é altamente improvável que a razão principal para o enriquecimento seletivo de CAF20 O mRNA com eIF4E ou a proteína Caf20p é a 'interação cotranslacional' do Caf20p nascente por meio de seu domínio de ligação eIF4E amino-terminal. Em vez disso, favorecemos o modelo em que a proteína Caf20p madura enriquece seletivamente o CAF20 mRNA presumivelmente via interações Caf20p com outras proteínas de ligação de RNA, bem como sua interação com eIF4E (Figura 8D). De fato, Caf20p já demonstrou ter interações com as proteínas de ligação a RNA Puf4p e Puf5p [40].

Uma previsão do modelo de autorregulação Caf20p é que em cepas onde o mutante de ligação eIF4E (Caf20 m2) é a única fonte de Caf20p, a autorregulação entrará em curto-circuito e Caf20p acumulará em níveis mais altos do que em cepas com selvagem -tipo Caf20p. De fato, na Figura 8H esta previsão é considerada correta: em caf20Δ mutantes carregando o pCAF20 m2 -Fl plasmídeo, Caf20p acumula níveis de 7,05 (± 1,25) vezes mais elevados do que no mutante que carrega o plasmídeo de tipo selvagem. Tomados coletivamente, esses dados destacam um circuito autorregulatório que controla a expressão de Caf20p em um loop de feedback negativo, onde um freio autolimitante é aplicado para modular a expressão de um repressor translacional celular geral.


12.3 Outros Mecanismos de Evolução

As quatro forças evolutivas mais importantes que mudarão uma população de organismos ao longo do tempo são a seleção natural, a mutação, a deriva genética e a migração ou fluxo gênico para dentro ou para fora de uma população. A seleção natural é descrita em detalhes na seção anterior. Esta seção cobrirá o restante dos mecanismos de evolução.

12.3.1 Mutação: a fonte de todas as novas variações

Mutação é uma mudança em uma sequência de DNA. Pode ser uma pequena alteração, como uma mudança de um único par de bases, por meio de mudanças mais extensas, como a adição ou exclusão de um par de bases, embora grandes alterações em um nível cromossômico. Mesmo pequenas mudanças podem fazer grandes diferenças na proteína que o DNA codifica, como parece acima no exemplo da anemia falciforme.

A mutação transforma um alelo em um novo alelo. Esse novo alelo tem uma frequência muito pequena durante a primeira geração. Ao longo de várias gerações, sua frequência aumentará lentamente em uma população se nenhuma outra força evolutiva atuar no alelo. Se a seleção natural agir contra o alelo, ele será removido da população. Esta é uma das razões pelas quais as doenças genéticas permanecem na população humana em frequências muito baixas. Se o alelo for favorecido pela seleção, sua frequência aumentará. Se a mutação for neutra & # 8211 nem aumentar ou diminuir a aptidão reprodutiva & # 8211, sua frequência permanecerá estática em uma população por gerações.

12.3.2. Fluxo gênico / migração

Se duas populações de uma espécie têm frequências de alelos diferentes, a migração de indivíduos de uma população para outra causará mudanças de frequência em ambas as populações. A nova população terá um aumento em certos alelos, enquanto a população anterior experimentará uma diminuição em certos alelos (Figura 12.23).

Figura 12.23 Neste exemplo, um inseto marrom migra de uma população para outra. A frequência do alelo para a cor marrom aumentou, portanto, na população à esquerda. Crédito: & # 8220File: Gene flow.jpg & # 8221 por Tsaneda está licenciado sob CC BY 3.0

Após a migração, o (s) novo (s) indivíduo (s) acasala (m) com indivíduos locais e o (s) novo (s) alelo (s) torna-se parte do pool genético da população.

Enquanto algumas populações são razoavelmente estáveis, outras experimentam mais fluxo. Alguns animais não viajam muito durante sua vida, enquanto algumas espécies são altamente migratórias e o fluxo gênico é muito comum. As espécies de plantas podem parecer muito fixas em sua localização, mas também experimentam o fluxo gênico. Muitas plantas podem enviar suas sementes para longe pelo vento ou nas vísceras de animais que as comeram e depois depositá-las em um local diferente ao defecar. Essas sementes que viajam muito podem introduzir alelos comuns na população de origem para uma nova população na qual são raros.

12.3.3 Deriva Genética

Outra maneira pela qual as frequências de alelos de uma população podem mudar é a deriva genética (Figura 11.7), que é simplesmente o efeito do acaso. A deriva genética é mais importante em pequenas populações. A deriva estaria completamente ausente em uma população com infinitos indivíduos, mas, é claro, nenhuma população é tão grande. A deriva genética ocorre porque os alelos em uma geração descendente são uma amostra aleatória dos alelos na geração progenitora. Os alelos podem ou não chegar à próxima geração devido a eventos casuais, incluindo a mortalidade de um indivíduo, eventos que afetam a busca de um parceiro e até mesmo os eventos que afetam os gametas que acabam nas fertilizações. Se um indivíduo em uma população de dez indivíduos morrer antes de deixar qualquer prole para a próxima geração, todos os seus genes - um décimo do pool genético da população - serão perdidos repentinamente. Em uma população de 100, esse 1 indivíduo representa apenas 1 por cento do pool genético geral, portanto, tem muito menos impacto na estrutura genética da população e é improvável que remova todas as cópias, mesmo de um alelo relativamente raro.

Imagine uma população de dez indivíduos, metade com alelo A e metade com alelo a (os indivíduos são haplóides). Em uma população estável, a próxima geração também terá dez indivíduos. Escolha aquela geração aleatoriamente lançando uma moeda dez vezes e deixe que cara seja A e coroa seja a. É improvável que a próxima geração tenha exatamente metade de cada alelo. Pode haver seis de um e quatro do outro, ou algum conjunto diferente de frequências. Assim, as frequências dos alelos mudaram e a evolução ocorreu. Uma moeda não funcionará mais para escolher a próxima geração (porque as chances não são mais da metade para cada alelo). A frequência em cada geração irá flutuar para cima e para baixo no que é conhecido como passeio aleatório até que em um ponto todos os A ou todos os a sejam escolhidos e aquele alelo seja fixado daquele ponto em diante. Isso pode levar muito tempo para uma grande população. Essa simplificação não é muito biológica, mas pode-se mostrar que populações reais se comportam dessa forma. O efeito da deriva nas frequências é tanto maior quanto menor for a população. Seu efeito também é maior em um alelo com frequência longe da metade. A deriva irá influenciar todos os alelos, mesmo aqueles que estão sendo selecionados naturalmente.

A deriva genética também pode ser ampliada por eventos naturais ou causados ​​pelo homem, como um desastre que mata aleatoriamente uma grande parte da população, que é conhecido como o efeito de gargalo que resulta em uma grande parte do genoma sendo repentinamente eliminada (Figura 11,8). De uma só vez, a estrutura genética dos sobreviventes se torna a estrutura genética de toda a população, que pode ser muito diferente da população pré-desastre. O desastre deve ser aquele que mata por motivos não relacionados às características do organismo, como um furacão ou fluxo de lava. Uma matança em massa causada por temperaturas anormalmente frias à noite provavelmente afetará os indivíduos de maneira diferente, dependendo dos alelos que eles possuem e que conferem resistência ao frio.

Outro cenário no qual as populações podem sofrer uma forte influência da deriva genética é se alguma parte da população partir para iniciar uma nova população em um novo local, ou se uma população for dividida por uma barreira física de algum tipo. Nessa situação, é improvável que esses indivíduos sejam representativos de toda a população, o que resulta no efeito fundador. O efeito fundador ocorre quando a estrutura genética corresponde à dos pais e mães fundadores da nova população. Acredita-se que o efeito fundador tenha sido um fator chave na história genética da população Afrikaner de colonos holandeses na África do Sul, como evidenciado por mutações que são comuns em Afrikaners, mas raras na maioria das outras populações. Isso provavelmente se deve a uma proporção maior do que o normal dos colonos fundadores, que eram uma pequena amostra da população original, portadores dessas mutações. Como resultado, a população expressa incidências excepcionalmente altas de doença de Huntington (HD) e anemia de Fanconi (AF), um distúrbio genético conhecido por causar medula óssea e anomalias congênitas e até mesmo câncer.


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