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Boas regras ou ferramentas de filtragem poli-A

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Estou alinhando um grande número de ESTs. Parece que as caudas poli-A aparecem de muitas maneiras diferentes. Além de ocorrerem bem no final, eles podem ser flanqueados pela sequência de clonagem em uma extremidade ou ter incompatibilidades / erros. Qual é uma boa regra ou ferramentas disponíveis para lidar com os casos usuais?

Alguns exemplos dos casos não triviais que encontrei, com seus Genbank Accs:

> EE409337 ... AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCTTGTC> EE409340 ... TTTCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTTGTC> EE409361 ... TTGTTAAACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCATGTCGGC TTACTGAATTGAA> EE420306 ... AAAAAAAGTTATGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAA

Postado cruzado em SeqAnswers, Biostars.


Regra de cinco de Lipinski

Regra de cinco de Lipinski, também conhecido como Regra de cinco da Pfizer ou simplesmente o regra de cinco (RO5), é uma regra para avaliar a semelhança com o medicamento ou determinar se um composto químico com uma determinada atividade farmacológica ou biológica tem propriedades químicas e físicas que o tornariam um medicamento provavelmente ativo por via oral em humanos. A regra foi formulada por Christopher A. Lipinski em 1997, com base na observação de que a maioria dos medicamentos administrados por via oral são moléculas relativamente pequenas e moderadamente lipofílicas. [1] [2]

A regra descreve propriedades moleculares importantes para a farmacocinética de um medicamento no corpo humano, incluindo sua absorção, distribuição, metabolismo e excreção ("ADME"). No entanto, a regra não prevê se um composto é farmacologicamente ativo.

É importante ter em mente a regra durante a descoberta do medicamento, quando uma estrutura principal farmacologicamente ativa é otimizada em etapas para aumentar a atividade e a seletividade do composto, bem como para garantir que as propriedades físico-químicas semelhantes ao medicamento sejam mantidas conforme descrito pela regra de Lipinski. [3] Os medicamentos candidatos que estão em conformidade com o RO5 tendem a ter taxas de atrito mais baixas durante os ensaios clínicos e, portanto, têm uma chance maior de chegar ao mercado. [2] [4]

Alguns autores criticaram a regra de cinco pela suposição implícita de que a difusão passiva é o único mecanismo importante para a entrada de drogas nas células, ignorando o papel de transportadores. Por exemplo, O'Hagan e co-autores escreveram o seguinte: [5]

Essa famosa "regra do 5" tem sido altamente influente nesse aspecto, mas apenas cerca de 50% das novas entidades químicas administradas por via oral realmente a obedecem.

Estudos também demonstraram que alguns produtos naturais quebram as regras químicas usadas no filtro Lipinski, como macrolídeos e peptídeos [6] [7] [8]


Meio filtrante

A mídia de filtro pode ser dividida em duas classes gerais: (1) barreiras finas, exemplificadas por um pano de filtro, tela de filtro ou papel de filtro comum de laboratório (2) barreiras grossas ou em massa, como leitos de areia, leitos de coque, cerâmicas porosas, metal poroso, e o pré-revestimento de auxiliar de filtro que é freqüentemente usado na filtração industrial de fluidos que contêm precipitados gelatinosos.

Um meio filtrante fino oferece uma única barreira na qual as aberturas são menores do que as partículas a serem removidas do fluido. Um único meio de filtro fino geralmente é satisfatório se as camadas de partículas sólidas que se acumulam no meio produzem um bolo poroso que é permeável ao fluido. Se a torta de filtro for gelatinosa ou as partículas forem macias e compressíveis, em vez de firmes, a torta de filtro pode “cegar”, ou seja, os poros da torta podem fechar e interromper a filtração. Se isso acontecer, um auxiliar de filtro ou meio de filtro espesso, como o leito de areia, pode ser usado.

Ao contrário da situação com o meio fino, os poros em um meio de filtro espesso, como um leito de areia, podem ser consideravelmente maiores do que as partículas a serem removidas. As partículas podem viajar por alguma distância ao longo do caminho tortuoso do fluido através do meio, mas mais cedo ou mais tarde ficarão presas nos interstícios mais finos entre as partículas que constituem o leito do filtro. Desta forma, as partículas macias removidas são distribuídas sobre um volume de meio filtrante que é suficiente para evitar o cegamento e a interrupção da filtração. Depois que os sólidos se acumulam, os leitos podem ser lavados com fluido transparente para limpar o leito.


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Integração com outros tipos de dados

A integração de dados de RNA-seq com outros tipos de dados do genoma (Fig. 1c) nos permite conectar a regulação da expressão gênica com aspectos específicos da fisiologia molecular e genômica funcional. Análises integrativas que incorporam dados de RNA-seq como a leitura de expressão de gene primária que é comparada com outros experimentos genômicos estão se tornando cada vez mais prevalentes. Abaixo, discutimos alguns dos desafios adicionais apresentados por tais análises.

Sequenciamento de DNA

A combinação de sequenciamento de RNA e DNA pode ser usada para diversos fins, como descoberta de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), análises de edição de RNA ou mapeamento de loci de características quantitativas de expressão (eQTL). Em um experimento eQTL típico, perfis de genótipo e transcriptoma são obtidos do mesmo tipo de tecido em um número relativamente grande de indivíduos (& gt50) e correlações entre o genótipo e os níveis de expressão são então detectados. Essas associações podem desvendar a base genética de características complexas, como altura [121], suscetibilidade a doenças [122] ou mesmo características da arquitetura do genoma [123, 124]. Grandes estudos eQTL mostraram que a variação genética afeta a expressão da maioria dos genes [125-128].

O RNA-seq tem duas vantagens principais sobre as tecnologias baseadas em array para detectar eQTLs. Primeiro, ele pode identificar variantes que afetam o processamento da transcrição. Em segundo lugar, lê que SNPs heterozigotos sobrepostos podem ser mapeados para cromossomos maternos e paternos, permitindo a quantificação da expressão específica de alelo em um indivíduo [129]. Sinais específicos de alelo fornecem informações adicionais sobre um efeito genético na transcrição, e uma série de métodos computacionais recentemente se tornaram disponíveis para alavancar esses sinais para aumentar o poder de mapeamento de associação [130-132]. Um desafio desta abordagem é a carga computacional, já que bilhões de associações gene-SNP precisam ser testadas por bootstrap ou abordagens baseadas em permutação [133] são freqüentemente usadas [134, 135]. Muitos estudos se concentraram em testar apenas SNPs no cis região em torno do gene em questão, e abordagens computacionalmente eficientes foram desenvolvidas recentemente para permitir o mapeamento extremamente rápido de eQTLs em todo o genoma [136]. Além disso, a combinação de RNA-seq e re-sequenciamento pode ser usada para remover falsos positivos ao inferir genes de fusão [88] e para analisar alterações no número de cópias [137].

Metilação de DNA

A metilação pareada do DNA e a integração do RNA-seq, na maior parte, consistiu na análise da correlação entre os DEGs e os padrões de metilação [138-140]. Modelos lineares gerais [141-143], modelos de regressão logística [143] e modelo empírico de Bayes [144] foram tentados entre outras abordagens de modelagem. As correlações estatisticamente significativas que foram observadas, no entanto, foram responsáveis ​​por efeitos relativamente pequenos. Uma mudança interessante longe do foco nas correlações de metilação de gene-CpG individual é usar uma abordagem baseada em interação de rede para analisar seq de RNA em relação à metilação de DNA. Esta abordagem identifica um ou mais conjuntos de genes (também chamados de módulos) que têm expressão diferencial coordenada e metilação diferencial [145].

Características da cromatina

A combinação de dados de sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina (ChIP-seq) de RNA-seq e fator de transcrição (TF) pode ser usada para remover falsos positivos na análise de ChIP-seq e para sugerir o efeito ativador ou repressivo de um TF em seus genes-alvo. Por exemplo, BETA [146] usa expressão diferencial de genes em combinação com picos de experimentos ChIP-seq para chamar alvos TF. Além disso, experimentos ChIP-seq envolvendo modificações de histonas foram usados ​​para entender o papel geral dessas mudanças epigenômicas na expressão gênica [147, 148]. Outras abordagens integrativas de sequenciamento de RNA-ChIP são revisadas em [149]. A integração de dados de cromatina aberta, como o de FAIRE-seq e DNase-seq com RNA-seq, tem se limitado principalmente à verificação do status de expressão de genes que se sobrepõem a uma região de interesse [150]. A DNase-seq pode ser usada para rastrear todo o genoma de fatores de ligação ao DNA, e isso em combinação com a expressão real de genes pode ser usado para inferir redes de transcrição ativas [150].

MicroRNAs

A integração de dados de RNA-seq e miRNA-seq tem o potencial de desvendar os efeitos regulatórios de miRNAs em níveis de transcrição em estado estacionário. Esta análise é desafiadora, no entanto, devido à natureza muito ruidosa das previsões de miRNA alvo, o que dificulta as análises baseadas em correlações entre miRNAs e seus genes alvo. Associações podem ser encontradas em bancos de dados como mirWalk [151] e miRBase [152] que oferecem predição de alvo de acordo com vários algoritmos. Ferramentas como CORNA [153], MMIA [154, 155], MAGIA [156] e SePIA [157] refinam as previsões testando associações significativas entre genes, miRNAs, caminhos e termos GO, ou testando a relação ou anticorrelação de os perfis de expressão de ambos os genes alvo e os miRNAs associados. Em geral, recomendamos o uso de associações miRNA-mRNA que são previstas por vários algoritmos. Por exemplo, em camundongos, descobrimos que exigir a associação miRNA-mRNA em cinco bancos de dados resultou em cerca de 50 previsões de mRNA alvo por miRNA (observações STATegra).

Proteômica e metabolômica

A integração do RNA-seq com a proteômica é controversa porque as duas medições mostram uma correlação geralmente baixa (

0,40 [158, 159]). No entanto, a integração de pares de proteômica e RNA-seq pode ser usada para identificar novas isoformas. Peptídeos não relatados podem ser previstos a partir de dados de RNA-seq e, em seguida, usados ​​para complementar bancos de dados normalmente consultados em espectrometria de massa como feito por Low et al. [160]. Além disso, eventos de edição pós-tradução podem ser identificados se os peptídeos que estão presentes na análise de espectrometria de massa estiverem ausentes dos genes expressos do conjunto de dados de RNA-seq. A integração da transcriptômica com os dados da metabolômica foi usada para identificar as vias que são reguladas tanto na expressão do gene quanto no nível do metabólito, e ferramentas estão disponíveis que visualizam os resultados dentro do contexto da via (MassTRIX [161], Paintomics [162], VANTED v2 [ 163] e SteinerNet [164]).

Integração e visualização de vários tipos de dados

A integração de mais de dois tipos de dados genômicos ainda está em sua infância e ainda não foi amplamente aplicada a técnicas de sequenciamento funcional, mas já existem algumas ferramentas que combinam vários tipos de dados. SNMNMF [165] e PIMiM [166] combinam dados de expressão de mRNA e miRNA com redes de interação proteína-proteína, DNA-proteína e miRNA-mRNA para identificar módulos reguladores de miRNA-gene. MONA [167] combina diferentes níveis de dados de genômica funcional, incluindo mRNA, miRNA, metilação de DNA e dados de proteômica para descobrir funções biológicas alteradas nas amostras que estão sendo estudadas. A paintomics pode integrar qualquer tipo de dados genômicos funcionais na análise da via, desde que as características possam ser mapeadas em genes ou metabólitos [162]. 3Omics [168] integra dados de transcriptômica, metabolômica e proteômica em redes regulatórias.

Em todos os casos, a integração de diferentes conjuntos de dados raramente é direta porque cada tipo de dados é analisado separadamente com seus próprios algoritmos personalizados que produzem resultados em formatos diferentes. Ferramentas que facilitam as conversões de formato e a extração de resultados relevantes podem ajudar a exemplos de tais pacotes de software de construção de fluxo de trabalho incluem Anduril [169], Galaxy [170] e Chipster [171]. Anduril foi desenvolvido para construir pipelines complexos com grandes conjuntos de dados que requerem paralelização automatizada. A força do Galaxy e do Chipster é que a visualização da usabilidade é um componente chave de seu design. A visualização simultânea ou integrativa dos dados em um navegador do genoma é extremamente útil tanto para a exploração de dados quanto para a interpretação dos resultados. Os navegadores podem exibir mapeamentos em tandem da maioria das tecnologias de sequenciamento de última geração, enquanto adicionam trilhas personalizadas, como anotação de gene, variação de nucleotídeos ou conjuntos de dados ENCODE. Para integração proteômica, o pipeline PG Nexus [172] converte dados de espectrometria de massa em mapeamentos que são co-visualizados com alinhamentos de RNA-seq.


Filtração, ajuste e uso adequado

1. O filtro do respirador deve ser altamente eficaz na captura de partículas que passam por ele,

2. O respirador deve se ajustar perfeitamente ao rosto do usuário (ou seja, criar uma vedação) para minimizar o número de partículas que passam pelo filtro através das lacunas entre a pele do usuário e a vedação do respirador e

3. O respirador deve ser colocado (colocado) e retirado (retirado) corretamente antes e usado durante toda a exposição.

A OSHA exige que os profissionais de saúde que devem realizar atividades de pacientes com pessoas com suspeita ou confirmação de infecção por COVID-19 usem proteção respiratória, como um respirador N95. O respirador N95 refere-se a um respirador de máscara facial com filtro N95 (FFR) que veda o rosto e usa um filtro para remover pelo menos 95% das partículas transportadas pelo ar do ar respirável do usuário. O NIOSH também aprova outros FFRs que são tão ou mais protetores quanto o N95, incluindo o N99, N100, P95, P100, R95 e R100. É importante observar que as máscaras cirúrgicas, às vezes chamadas de máscaras faciais, são diferentes dos respiradores e não são projetadas nem aprovadas para fornecer proteção contra partículas transportadas pelo ar. As máscaras cirúrgicas são projetadas para fornecer proteção de barreira contra gotículas, no entanto, não são regulamentadas para a eficiência de filtração de partículas e não formam uma vedação adequada ao rosto do usuário para ser confiável para proteção respiratória. Sem uma vedação adequada, o ar e pequenas partículas vazam em torno das bordas do respirador e na zona de respiração do usuário.

Quando devidamente encaixado e usado, o vazamento mínimo ocorre em torno das bordas de um respirador N95 quando o usuário inala, garantindo que o ar respirável do usuário seja direcionado através do material do filtro. Os funcionários que são obrigados a usar proteção respiratória devem passar por testes de ajuste, liberação médica e treinamento, que são todos elementos obrigatórios do programa de proteção respiratória por escrito de uma instituição de saúde. Estes são os requisitos do padrão de Proteção Respiratória da Administração de Segurança e Saúde Ocupacional (OSHA) (29 CFR 1910.134).

O teste de encaixe é um componente crítico para um programa de proteção respiratória sempre que os trabalhadores usam respiradores de encaixe justo. A OSHA exige um teste inicial de ajuste do respirador para identificar o modelo, estilo e tamanho corretos de respirador para cada trabalhador. Os testes de ajuste anuais garantem que os usuários continuem a receber o nível de proteção esperado. Um teste de ajuste confirma que o respirador se ajusta corretamente ao usuário. Além disso, os respiradores justos, incluindo N95s, exigem uma verificação do selo do usuário cada vez que você os coloca para ajudar a garantir o melhor ajuste possível. Nos EUA, os respiradores aprovados pelo NIOSH incluem instruções sobre como conduzir uma verificação do lacre do usuário.

Durante tempos de restrições extremas de fornecimento, quando pode haver disponibilidade limitada de respiradores ou kits de teste de encaixe, os empregadores podem enfrentar desafios para os trabalhadores de teste de encaixe. Os empregadores devem envidar todos os esforços para garantir que os trabalhadores que precisam usar respiradores bem ajustados sejam testados para identificar o respirador certo para cada trabalhador.


Artigo em destaque: Aproveitando programas de melhoramento e dados genômicos em abeto da Noruega (Picea abies L. Karst) para análise de GWAS

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Detecção de DNA microbiano livre de células usando uma estrutura de análise controlada por contaminantes

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Papéis de TET e TDG na desmetilação de DNA em células imunes em proliferação e não proliferação

Autores: Atsushi Onodera, Edahí González-Avalos, Chan-Wang Jerry Lio, Romain O. Georges, Alfonso Bellacosa, Toshinori Nakayama e Anjana Rao


E-value e amp Bit-score

O valor E de 10 significa que até 10 ocorrências podem ser encontradas apenas por acaso, dado o mesmo tamanho de um banco de dados aleatório.

O valor E pode ser usado como um filtro de primeira qualidade para o resultado da pesquisa do BLAST, para obter apenas resultados iguais ou melhores que o número fornecido pela opção -evalue. Os resultados da explosão são classificados por valor E por padrão (melhor acerto na primeira linha).

blastn -query genes.ffn -subject genome.fna -valor 1e-10

Quanto menor for o valor E, melhor será a correspondência.

-valor 1e-50

valor E pequeno: baixo número de acessos, mas de alta qualidade

Os acertos de explosão com um valor E menor que 1e -50 incluem correspondências de banco de dados de qualidade muito alta.

-valor 0.01

Os acertos de explosão com valor E menor que 0,01 ainda podem ser considerados um bom acerto para correspondências de homologia.

-valor 10 (predefinição)

grande valor E: muitos resultados, parcialmente de baixa qualidade

O valor E menor que 10 incluirá ocorrências que não podem ser consideradas significativas, mas podem dar uma ideia de relações potenciais.

O valor E (valor esperado) é uma pontuação de bits corrigida ajustada ao tamanho do banco de dados de sequência. O valor E, portanto, depende do tamanho do banco de dados de sequência usado. Como grandes bancos de dados aumentam a chance de ocorrências de falsos positivos, o valor E corrige a chance maior. É uma correção para comparações múltiplas. Isso significa que um acerto de sequência obteria um valor E melhor quando presente em um banco de dados menor.

E = m x n / 2 pontuação de bits

n - comprimento total do banco de dados (soma de todas as sequências)

Quanto maior for a pontuação de bits, melhor será a semelhança de sequência

A pontuação de bits é o tamanho necessário para um banco de dados de sequência em que a correspondência atual pode ser encontrada por acaso. A pontuação de bits é um log2 pontuação bruta escalonada e normalizada. Cada aumento de um dobra o tamanho do banco de dados necessário (pontuação de 2 bits).

A pontuação de bits não depende do tamanho do banco de dados. A pontuação de bits fornece o mesmo valor para ocorrências em bancos de dados de tamanhos diferentes e, portanto, pode ser usada para pesquisar em um banco de dados em constante crescimento.


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Avanços no sequenciamento metilômico do genoma completo

Jessica Nordlund, em Epigenetics Methods, 2020

Resumo

Os avanços notáveis ​​no sequenciamento de alto rendimento trouxeram uma progressão sem precedentes para o campo da pesquisa epigenômica, particularmente na área de análise de metilação de DNA em todo o genoma. A variedade de abordagens disponíveis permitiu a criação de perfis de todo o genoma de incontáveis ​​tipos de células e estados, resultando em descobertas que provaram ser fundamentais para o avanço de nossa compreensão da identidade celular no desenvolvimento, saúde e doença. As abordagens de todo o metiloma que estão disponíveis hoje variam em muitos aspectos, como entrada de DNA necessária, grau de resolução e cobertura genômica e capacidade de quantificação. Este capítulo discute o desenvolvimento histórico, as modificações comprovadas e as muitas aplicações para a análise da metilação do DNA e outras modificações de base em uma escala global, bem como seu potencial de tradução.


Assista o vídeo: EXCEL - Filtrowanie filtr, filtry (Agosto 2022).