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Sensibilidade de células T e persistência a proteínas bacterianas específicas

Sensibilidade de células T e persistência a proteínas bacterianas específicas


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Atualmente, os testes padrão para a doença de Lyme medem a produção de anticorpos após a exposição a uma bactéria, Borrelia burgdorferi. Freqüentemente, os testes são realizados logo após a infecção, antes que os anticorpos possam ser produzidos. Além disso, os pacientes infectados com imunossupressão podem não ter níveis detectáveis ​​de anticorpos contra o antígeno. Em ambos os casos, os resultados dos testes costumam ser falsos negativos.

Um novo teste para a doença de Lyme foi desenvolvido, o ISPOT Lyme da Pharma Labs, que se concentra na atividade das células T em vez da produção de anticorpos. Modelado após o teste ELISPOT para TB, ele mede o interferon gama (IFN-γ) secretado por células T em resposta à estimulação pelo B. burgdorferi proteínas do antígeno - DbpA, OspC, p100 e VlsE-1. Depois de isolar e cultivar linfócitos da amostra de sangue de um paciente, eles expõem os linfócitos cultivados ao B. burgdorferi antígenos. Se os linfócitos 'reconhecem' o antígeno, devido à exposição prévia, eles secretam IFN-y, que reage com um corante de cor azul visível na cultura.

Pergunta: A exaustão de células T pode afetar a utilidade de um ensaio sorológico que mede a sensibilidade das células T a antígenos específicos?


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Ciência

Vol 305, Edição 5690
10 de setembro de 2004

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Por Nathalie Q. Balaban, Jack Merrin, Remy Chait, Lukasz Kowalik, Stanislas Leibler

Ciência 10 de setembro de 2004: 1622-1625

Em uma população bacteriana, alguns membros que mudam para uma taxa de crescimento lenta podem sobreviver ao tratamento com antibióticos.


Resumo

Os patógenos podem alterar substancialmente a expressão gênica em um hospedeiro infectado, dependendo dos requisitos metabólicos ou de virulência em diferentes tecidos; no entanto, o efeito dessas alterações na imunidade do hospedeiro não é claro. Aqui, visualizamos múltiplas respostas de células T CD4 a proteínas expressas temporalmente em Salmonellacamundongos infectados. As células T CD4 específicas da flagelina se expandiram e contraíram precocemente, se diferenciaram nas linhagens Th1 e Th17 e foram enriquecidas nos tecidos da mucosa após a infecção oral. Em contraste, as células T CD4 respondendo a Salmonella Os efetores do Sistema de Secreção Tipo III (TTSS) se acumularam continuamente até que a eliminação bacteriana foi alcançada, principalmente diferenciados em células Th1, e foram predominantemente detectados em tecidos sistêmicos. Assim, a regulação da expressão do antígeno por patógenos desempenha um papel importante na orquestração da expansão, diferenciação e localização de células T CD4 específicas do antígeno in vivo.


RESULTADOS

Grandes populações - o limite determinístico:

A aptidão de longo prazo da cepa do tipo selvagem e do hipQ mutante é calculado usando λ1 e λ1 , respectivamente. Esses valores de aptidão dependem das mudanças do ambiente, manifestadas pela duração do crescimento, tg, e a duração do estresse antibiótico, ts. Para um determinado tipo de ambiente em mudança especificado por (tg, ts), desejamos saber qual cepa tem maior aptidão. Portanto, calculamos a curva no (tg, ts) plano para o qual tipo selvagem e hipQ têm a mesma aptidão. A curva é dada pela equação 7 que implicitamente dá a dependência de ts sobre tg. Plotamos a curva de adequação igual na Figura 1. A curva separa o plano em duas partes. Abaixo da curva, o tipo selvagem tem maior aptidão do que hipQ, enquanto acima da curva a situação se inverte.

Diagrama de fase para competição entre tipo selvagem e hipQ em ambientes periódicos. As durações de crescimento e estresse em horas são dadas por tg e ts, respectivamente. A deformação com maior aptidão é indicada em cada uma das duas regiões. Todos os valores dos parâmetros usados ​​para este cálculo são dados na Tabela 1. Valores extremos possíveis do parâmetro de comutação b do hipQ mutantes foram considerados: principais usos da figura bquadril = 10 −4 usos de inserção bquadril = 10 −6 .

Ao realizar uma expansão assintótica dos valores de aptidão, para grandes valores de tg, descobrimos que a curva assintoticamente cresce linearmente com tg. Não fornecemos os detalhes desse cálculo, pois ele é longo e não é particularmente esclarecedor, dando o resultado 8 onde. Aqui, usamos sobrescritos g e s para indicar o ambiente, por exemplo μ s n refere-se à taxa de morte de células normais em condições de estresse. Usando esta expressão na equação da curva de aptidão igual (7), descobrimos que a Equação 7 é linear em tg e ts, para grandes durações, e que a inclinação da linha é -, que é ∼umaquadril/bwt = 0,01 (quando os valores da Tabela 1 são usados).

Conforme observado na Tabela 1, o valor da taxa de comutação bquadril é mal determinado. Para avaliar o efeito deste parâmetro na aptidão, usamos o valor do limite superior de bquadril ao traçar a curva de adequação igual na Figura 1 e o limite inferior na inserção da Figura 1. O principal efeito de diminuir o valor de bquadril é aumentar o tamanho da região de superioridade do tipo selvagem. Usando a Equação 8, vemos que quando bquadril é pequeno, alterar seu valor em uma ordem de magnitude efetuará uma mudança no hipQ aptidão principalmente por meio do registro (b) termo. Uma vez que este termo é positivo, decrescente bquadril irá diminuir a aptidão de hipQ e, portanto, aumente a região em que o tipo selvagem vence.

Também é interessante traçar a razão das taxas de crescimento das duas cepas em função de tg e ts. Isso é mostrado na Figura 2, plotado em uma escala logarítmica. Esta quantidade indica a rapidez com que a linhagem adaptadora venceria uma competição hipotética entre as duas linhagens. Vemos que na região abaixo da linha de aptidão igual na Figura 2A, o tipo selvagem vence, mas apenas um pouco, enquanto acima da linha, hipQ ganha por uma ordem de magnitude ou mais, dependendo das durações ambientais. Isso ocorre porque nesta região de durações antibióticas muito curtas, a diferença de aptidão entre as duas cepas é bem aproximada pela diferença nas taxas de crescimento de células normais na ausência de antibiótico. Essa diferença é umaquadrilumawt, que é, portanto, apenas 10 -3 a favor do tipo selvagem.

Razão das taxas de crescimento de hipQ ao tipo selvagem no (tg, ts) plano. O tempo é fornecido em horas. (UMA) bquadril = 10 −4 (B) bquadril = 10 −6. A linha preta em A e B é a curva de adequação igual, mostrada na Figura 1, ao longo da qual o z-coordenada é idêntica a zero.

Pequenas populações - o limite estocástico:

A taxa de adequação mostrada na Figura 2 desempenha um papel importante na determinação da sensibilidade dos resultados às mudanças no tamanho da população. Para determinar como os pequenos tamanhos populacionais afetam os resultados determinísticos, rodamos simulações estocásticas nas quais as taxas de crescimento e mudança dadas pelas matrizes G e S determinou a replicação estocástica e os tempos de comutação para uma população finita de células. A simulação é descrita em modelo e métodos. Em todas as vezes t, a simulação registra o número de células normais e persistentes para cada cepa. O tamanho da população é sempre mantido menor do que um determinado tamanho, consistente com a ideia de um recurso limitante.

Na Figura 3A, mostramos uma trajetória estocástica de amostra, para uma população de tamanho 10 5, no ambiente em mudança dado por (tg, ts) = (20, 2,5). A simulação começa com números iguais de tipo selvagem e hipQ células. Nesta simulação em particular, após a quarta rodada de estresse, as células normais tanto do tipo selvagem quanto hipQ são completamente mortos (Figura 3A, evento b). o hipQ mutante, no entanto, gerou um punhado de persistentes durante a fase de crescimento, enquanto o tipo selvagem não. Esses persistentes são capazes de crescer lentamente durante a fase de crescimento subsequente e não são completamente mortos durante o estresse. Eventualmente, o hipQ persistentes atingem um tamanho de população de 10 4, ponto em que a taxa total de mudança de volta para o tipo de célula normal é de 10 4 bquadril, que é 1. Vemos que uma mudança ocorre neste ponto (t = 125 h), e o hipQ a população normal de células depois disso se restabelece.

Competição de tipo selvagem contra hipQ no (tg, ts) = (20, 2,5), começando em 50.000 de tipo selvagem e 50.000 hipQ células: (A) dinâmica estocástica (B) dinâmica determinística. As barras cinzas indicam períodos de crescimento, enquanto os espaços entre as barras são períodos de estresse antibiótico. Quando as linhas vermelha e azul se sobrepõem completamente, usamos uma linha tracejada para resolvê-los. Os eventos circulados são os seguintes: a é a formação de uma única célula persistente do tipo selvagem, que morre logo após b é a extinção completa das células normais tanto do tipo selvagem quanto hipQ e c é a troca de um único hipQ Persiste a célula ao tipo normal. Nessas simulações, Nmax = 110.000 e Neu = 100.000. Os valores dos parâmetros são fornecidos na Tabela 1, tomando bquadril = 10 −4. A dinâmica determinística corresponde à solução numérica das Equações 1, com reescalonamento do tamanho da população, como na simulação estocástica.

Devido às flutuações estocásticas, o resultado de competições entre tipo selvagem e hipQ para tamanhos populacionais pequenos pode diferir do caso determinístico. Na simulação estocástica da Figura 3A, hipQ vence porque é capaz de gerar alguns persistentes que lhe permitem sobreviver a um episódio antibiótico particularmente calamitoso (evento b), enquanto o tipo selvagem não. No caso determinístico, mostrado na Figura 3B, o tipo selvagem vence todas as vezes porque sua população nunca é completamente eliminada por antibióticos e, portanto, sua pequena vantagem de aptidão sobre hipQ garante vitória eventual. Para estudar o desvio de populações finitas do limite determinístico, realizamos competições estocásticas em tg = 20 para vários valores de ts. Cada competição foi repetida 100 vezes, e a fração de vitórias do tipo selvagem foi calculada. Os resultados, para três tamanhos populacionais diferentes, são mostrados na Figura 4.

Competições estocásticas entre tipo selvagem e hipQ no tg = 20 para vários valores de ts. Para cada ponto de dados, 100 simulações foram executadas, começando com uma proporção de 1: 1 de tipo selvagem para mutante. Neu foi considerado o tamanho da população, enquanto Nmax foi definido para 1,1 Neu. Devido aos longos tempos de simulação para N = 10 6, os pontos nesta curva para ts & lt 3 são médias de 20 execuções. A linha pontilhada indica o resultado no limite de grande população (determinístico).

Descobrimos que, para tamanhos de população finitos, a linha de adequação igual muda em favor de hipQ. Ou seja, a quantidade de estresse em que o tipo selvagem tem 50% de chance de vencer é estritamente menor do que no caso determinístico mostrado pela linha pontilhada na Figura 4. Para entender esse efeito, observe que uma população de tamanho 10 n será completamente morto pelo antibiótico em algumas horas. Sem persistentes, uma população de tamanho 10 4, por exemplo, não pode sobreviver a & gt2,4 horas de estresse. Durante a fase de crescimento, o tipo selvagem terá produzido ∼10 4 umawt = 0,01 persistente, o que significa que 99% do tempo não haverá persistência, enquanto hipQ vai produzir 10 4 umaquadril = 10 persistentes. Nesse caso hipQ tem muito mais probabilidade de sobreviver do que o tipo selvagem, como visto na Figura 4.

Em que tamanho da população podemos esperar que a linha de aptidão igual coincida com a linha determinística em ts = 3,9? Observamos que os persistentes no antibiótico morrem a uma taxa de μ s p por hora, o que significa que precisamos de pelo menos experiência para sobreviver ts hora de antibiótico. O tipo selvagem produzirá este número de persistentes quando o tamanho da população estiver na ordem de exp /umawt ≈ 10 6 −10 7, enquanto hipQ produz este número já em tamanhos menores. Portanto, esperamos que os tamanhos da população da ordem de 10 7 sejam quase determinísticos. Podemos ver na Figura 4 que esta estimativa está em bom acordo com a taxa de aproximação do ponto de aptidão igual nas curvas com N = 10 4, 10 5 e 10 6 em direção à linha pontilhada. Simulações estocásticas com N = 10 7 são, infelizmente, proibitivamente longos para coletarmos estatísticas significativas.

Para tamanhos de população & lt10 4, tanto o tipo selvagem quanto hipQ têm alta probabilidade de extinção, mesmo quando o estresse com antibióticos é relativamente curto. Competições em tamanhos tão pequenos não são particularmente significativas porque ambas as populações estão morrendo em média, a menos que períodos muito curtos de estresse sejam usados. Em tais casos ts está próximo de 0, e podemos supor aproximadamente que ambas as populações estão sob condições de crescimento, de modo que a aptidão das células normais do tipo selvagem é μ g numawt e de normal hipQ células é μ g numaquadril. A diferença de aptidão é, portanto, ∼10-3 em favor do tipo selvagem. Sabemos da aproximação de difusão em genética de populações (R oughgarden 1996) que os efeitos estocásticos tornam-se importantes quando o tamanho da população vezes a diferença de aptidão é menor que um. Conforme o tamanho da população diminui para a ordem de 10 3, a diferença de aptidão entre o tipo selvagem e hipQ se tornará insignificante e descobriremos que cada cepa ganha ∼50% das vezes. Esta tendência é vista claramente na Figura 4 para o N = 10 4 curva em valores baixos de ts. Quando executamos 100 simulações usando N = 10 3 em ts = 0, tipo selvagem venceu 51 vezes.

Taxas de troca ideais:

Tendo estabelecido que certos tipos de mudança ambiental podem ser seletivos para uma cepa em relação a outra, gostaríamos de saber em que tipo de ambiente de ciclismo cada cepa é ideal. Optimalidade, aqui, refere-se apenas ao mecanismo de persistência e, mais especificamente, aos parâmetros de comutação uma e b. Consideramos um ambiente específico em mudança, fixado pelo par (tg, ts), e ajustamos os parâmetros uma e b para maximizar a aptidão a longo prazo. A otimização é realizada definindo para zero as derivadas parciais da adequação de longo prazo em relação a uma e b, e, e resolvendo para uma e b. Usando a aproximação dada na Equação 8, obtemos o seguinte resultado: 9

Verificamos esta solução numericamente e descobrimos que na região dos parâmetros relevantes para E. coli (Tabela 1), o erro nos valores ideais aproximados de uma e b dado na Equação 9 é 5%. Desde a R ≈ 0,22 para tipo selvagem, e R ≈ 0,27 para hipQ, descobrimos que para tempos superiores a algumas horas, aproximadamente 1 /t relações mantêm: uma ≈ 1/tg e b ≈ 1/ts. Esse tipo de resultado foi observado também em diferentes modelos, analiticamente em L achmann e J ablonka (1996) e numericamente em T hattai e van O udenaarden (2004).


Fatores celulares bacterianos identificados e vias que aumentam a formação de persister

Aspectos gerais

Como mencionado acima, a persistência bacteriana foi descoberta há 75 anos, mas o (s) mecanismo (s) molecular (s) de formação de persistência é (são) ainda pouco compreendidos (Kaldalu et & # xa0al., 2016). Os persistentes podem ser aparentemente gerados estocasticamente, provavelmente devido à heterogeneidade fisiológica de células únicas em uma população bacteriana (Germain et & # xa0al., 2015 Shan et & # xa0al., 2017). A porcentagem de persistentes em culturas de células de crescimento logarítmico é pequena (& lt & lt1%), mas aumentou significativamente na fase estacionária (Oliver, 2010). A formação de persistência é ainda desencadeada por vários estímulos de estresse. Um grande número de estudos moleculares realizados principalmente com E. coli e algumas outras bactérias modelo, identificaram diferentes fatores e vias de resposta ao estresse que estão aparentemente ligados à formação de persistência. Estes incluem sistemas de toxina-antitoxina (TA) (Maisonneuve et & # xa0al., 2011 Balaban et & # xa0al., 2013 Maisonneuve e Gerdes, 2014 Gerdes, 2016 Kedzierska e Hayes, 2016), resposta ao estresse oxidativo (Wu et & # xa0al., 2012 ), Resposta de estresse geral mediada por RpoS (Mok et & # xa0al., 2015 Liu et & # xa0al., 2017 Mok e Brynildsen, 2018), resposta rigorosa junto com a alarmona tetra- / pentafosfato de guanosina [(p) ppGpp] (Korch et & # xa0al., 2003 Germain et & # xa0al., 2015 Liu et & # xa0al., 2017), dano ao DNA e resposta SOS (D & # xf6rr et & # xa0al., 2009 Kreuzer, 2013 V & # xf6lzing and Brynildsen, 2015), estresse nutricional e produção de energia prejudicada (Amato et & # xa0al., 2013 Amato e Brynildsen, 2015 Shan et & # xa0al., 2017 Mok e Brynildsen, 2018). Todos esses processos desencadeados pelos estímulos de estresse correspondentes levam a um aumento significativo da fração persistente nas populações bacterianas.

Foi sugerido que os componentes da toxina de módulos TA específicos, mais fortemente expressos em algumas células individuais (possivelmente devido à variação estocástica nos níveis de ppGpp), são fatores decisivos para a formação persistente (Maisonneuve et & # xa0al., 2013). No entanto, cepas com múltiplas deleções de genes que codificam diferentes módulos TA (Maisonneuve et & # xa0al., 2011), bem como cepas ppGpp-negativas (Maisonneuve et & # xa0al., 2013) e rpoS cepas de deleção (Nguyen et & # xa0al., 2011) ainda formam persistentes (embora em taxas reduzidas).

As respostas de estresse discutidas aparentemente envolvidas na formação de persistentes compreendem redes regulatórias complexas que controlam a expressão de vários genes cujos produtos são essenciais para lidar com as condições de estresse nos níveis transcricional, translacional e pós-tradução. Além disso, muitos mais genes (e em particular genes metabólicos) do que aqueles diretamente envolvidos na superação da situação de estresse são ativados ou reprimidos pelos vários reguladores de estresse (Khil e Camerini-Otero, 2002 Jozefczuk et & # xa0al., 2010 Yukihira et & # xa0al ., 2015 Christodoulou et & # xa0al., 2018). Curiosamente, estudos de transcriptoma e metaboloma indicam vias metabólicas comuns que são reguladas para baixo ou para cima de maneira semelhante por diferentes condições de estresse, como estresse por temperatura, estresse oxidativo, carência de nutrientes, mudanças de nutrientes ou fase estacionária (Jozefczuk et & # xa0al., 2010). Além disso, existem interações e crosstalks entre esses regulons (Weber et & # xa0al., 2005 Merrikh et & # xa0al., 2009 Amato et & # xa0al., 2013 Baharoglu et & # xa0al., 2013 Leaden et & # xa0al., 2018 Molina-Quiroz et & # xa0al., 2018 Mitosch et & # xa0al., 2019).

Nenhum dos fatores descritos e vias associadas à formação persistente converte toda a população bacteriana no estado persistente, embora todas (ou pelo menos a maioria) das células na população estejam sujeitas ao respectivo estímulo de estresse e à resposta subsequente. Isso indica que nenhuma das condições de estresse acima descritas por si só é a causa final da persistência e, em vez disso, sugere que a persistência é causada pela heterogeneidade fisiológica desencadeada em populações bacterianas sob essas condições (Dhar e Mckinney, 2007 Gefen e Balaban, 2009). Portanto, é mais provável que um estado fisiológico específico, embora desconhecido, seja responsável pela formação de persistência. Este estado parece ser alcançado estocasticamente em algumas células, mesmo de populações bacterianas em crescimento e não estressadas (Amato et & # xa0al., 2013 Radzikowski et & # xa0al., 2017). As condições de estresse descritas, então, estabilizam e aumentam esse estado fisiológico.

Condições de estresse específicas que aumentam a formação de persistentes em bactérias modelo e IBPs

Módulos de toxina / antitoxina bacteriana e sua associação com a persistência

Os módulos bacterianos de TA são compostos por uma toxina e um componente antitoxina que neutraliza a toxina. Pelo menos quatro tipos diferentes de módulos de TA foram identificados com base na função da antitoxina (Yang e Walsh, 2017 Harms et & # xa0al., 2018). Módulos TA tipo I e especialmente tipo II, mais amplamente distribuídos entre procariotos (Gerdes et & # xa0al., 2005 Fozo et & # xa0al., 2008 Leplae et & # xa0al., 2011), mostraram estar envolvidos na indução de persistência (Vazquez- Laslop et & # xa0al., 2006 Rotem et & # xa0al., 2010 Maisonneuve et & # xa0al., 2011 Maisonneuve e Gerdes, 2014 Verstraeten et & # xa0al., 2015 Gerdes, 2016 Página e Peti, 2016). Nos módulos TA tipo I, a antitoxina é um RNA antisense que se liga ao mRNA codificador da toxina e bloqueia sua tradução (Fozo et & # xa0al., 2008), enquanto os módulos TA tipo II consistem em polipeptídeos de toxina e antitoxina que formam um complexo inativo (Gerdes et & # xa0al., 2005 Gerdes, 2016). Em módulos de TA tipo II, a degradação proteolítica (geralmente por proteases Lon ou Clp) da antitoxina libera a toxina ativa. A degradação ou depleção da antitoxina pode ocorrer estocasticamente ou em resposta a estresses e a proteína de toxina liberada afeta os processos celulares centrais, incluindo tradução, replicação de DNA, divisão celular e metabolismo (Gerdes, 2016 Kedzierska e Hayes, 2016 Harms et & # xa0al., 2018 Wilmaerts et & # xa0al., 2019).

Notavelmente, a contribuição dos módulos de TA tipo II para a formação persistente foi recentemente contestada (Harms et & # xa0al., 2017a Goormaghtigh et & # xa0al., 2018). Goormaghtigh e colegas (Goormaghtigh et & # xa0al., 2018) forneceram evidências de que um E. coli A cepa mutante K-12 sem os 10 módulos de TA tipo II postulados anteriormente para participar na formação de persistentes produziu níveis semelhantes de bactérias do tipo selvagem em culturas não estressadas e após a exposição a antibióticos [mas ver também (Holden e Errington, 2018 Ronneau e Helaine, 2019)].

Módulos TA em IBPs

Especialmente, os módulos de TA tipo II foram encontrados na maioria dos patógenos bacterianos humanos, incluindo vários IBPs vacuolares e citosólicos. Um número excepcionalmente grande de módulos TA foi identificado em Salmonella enterica serovares (24 módulos TA incluindo 4 tipo I e 19 tipo II) (Mcclelland et & # xa0al., 2001 Di Cesare et & # xa0al., 2016) e em M. tuberculosis (79 módulos TA) (Slayden et & # xa0al., 2018 Thakur et & # xa0al., 2018). Módulos TA Tipo II também estão presentes em Bartonella (Harms et & # xa0al., 2017b), Listeria monocytogenes (Curtis et & # xa0al., 2017 Kalani et & # xa0al., 2018), Shigella serovars (Mcvicker e Tang, 2016), Rickettsia spp. (Socolovschi et & # xa0al., 2013), e Brucella spp. (Heaton et & # xa0al., 2012). Nem os módulos de TA tipo I nem tipo II foram encontrados em Clamídia spp. e também não há evidências convincentes da presença de tais módulos de AT em Coxiella, Francisella e Legionella (Pandey e Gerdes, 2005 Leplae et & # xa0al., 2011 Yamaguchi et & # xa0al., 2011).

A contribuição dos módulos de TA para persistência de IBPs foi extensivamente estudada em S. Typhimurium (Helaine et & # xa0al., 2014 Di Cesare et & # xa0al., 2016 Vandrisse et & # xa0al., 2017 Rycroft et & # xa0al., 2018) e M. tuberculosis (Korch et & # xa0al., 2009 Albrethsen et & # xa0al., 2013 Schuessler et & # xa0al., 2013 Korch et & # xa0al., 2015 Winther et & # xa0al., 2016 Slayden et & # xa0al., 2018). No L. monocytogenes, MazEF, um módulo de TA tipo II que contribui para a formação de persistência em muitas bactérias (Gerdes et & # xa0al., 2005), obviamente não afeta a formação de persistência após o tratamento com antibióticos em doses letais (Curtis et & # xa0al., 2017).

A Resposta Estringente, o Alarmone (p) ppGpp e a Associação com Formação Persister

Ao lado dos módulos TA, (p) ppGpp parece desempenhar um papel importante na formação do persistente (Korch et & # xa0al., 2003 Kim H. Y. et & # xa0al., 2018). Esta alarmona é o efetor molecular da resposta bacteriana estringente que leva a uma extensa reprogramação transcricional e a alterações metabólicas em resposta à privação de nutrientes (Potrykus e Cashel, 2008). No E. coli (e todos os membros da gama-proteobactéria), RelA e SpoT sintetizam (p) ppGpp (a seguir denominado apenas ppGpp) a partir de GTP e GDP, enquanto em Bacillus subtilis e muitas outras bactérias, uma única enzima (Rel ou Rsh) é responsável por esta atividade (Mittenhuber, 2001). Após a privação de aminoácidos, os tRNAs não carregados ativam o RelA associado ao ribossomo para sintetizar ppGpp, enquanto os carboidratos e a privação de ácidos graxos estimulam a síntese de ppGpp pelo SpoT citoplasmático (Xiao et & # xa0al., 1991 Seyfzadeh et & # xa0al., 1993). Em um complexo com DksA, ppGpp se liga à RNA polimerase e inibe a transcrição iniciada a partir de promotores de RNA estáveis ​​(ou seja, rRNA e tRNA) e regula positivamente a transcrição da biossíntese de aminoácidos e genes de resposta ao estresse (Potrykus e Cashel, 2008 Dalebroux e Swanson, 2012 Hauryliuk et & # xa0al., 2015).

Como mencionado acima, uma ligação entre ppGpp e formação persistente foi mostrada pela primeira vez por Korch et & # xa0al. (2003) e confirmado por outros estudos (Amato et & # xa0al., 2013 Bokinsky et & # xa0al., 2013 Germain et & # xa0al., 2013 Maisonneuve et & # xa0al., 2013 Kim HY et & # xa0al., 2018) demonstrando que aumentou o ppGpp os níveis resultam em interrupção do crescimento e aumento da persistência.

Curiosamente, ppGpp também é um regulador especialmente para o tipo II, mas também para os módulos TA tipo I (Maisonneuve et & # xa0al., 2013 Maisonneuve e Gerdes, 2014 Verstraeten et & # xa0al., 2015 Tian et & # xa0al., 2017). Para módulos de TA tipo II, o aumento da produção de ppGpp ativa a degradação da antitoxina dependente da protease Lon e o componente de toxina liberado parece aumentar a geração de persistentes bloqueando os processos das células centrais (ver acima). Esta ativação mediada por ppGpp de módulos TA tipo II se tornou um modelo amplamente aceito para formação persistente que, no entanto, também entrou em debate crítico recentemente (Chowdhury et & # xa0al., 2016a Shan et & # xa0al., 2017 Maisonneuve et & # xa0al. , 2018). O controle transcricional por ppGpp também foi mostrado para o módulo TA tipo I HokB / SokB (Verstraeten et & # xa0al., 2015 Wilmaerts et & # xa0al., 2018) conforme descrito abaixo com mais detalhes.

Associação de Resposta Estringente e ppGpp com Formação Persister em IBPs

De acordo com o banco de dados Kegg, todos os IBPs, exceto os patógenos intracelulares obrigatórios Clamídia e Rickettsia spp. produzem RelA ou uma enzima semelhante a RelA / SpoT (Rsh) e são capazes de sintetizar ppGpp. SpoT está presente como uma enzima separada em IBPs pertencentes à gama-proteobactéria, isto é, Shigella, Salmonella, Francisella, Legionella, e Coxiella, mas está ausente em Clamídia spp. e Rickettsia spp. (Mittenhuber, 2001 Clark et & # xa0al., 2011). No L. monocytogenes, três genes codificam para as sintetases ppGpp: uma enzima RSH bi-funcional e duas pequenas sintases (Natori et & # xa0al., 2009). M. tuberculosis carrega um gene que codifica RelMtb, um homólogo RelA / SpoT bifuncional que modula a síntese e hidrólise de ppGpp durante a resposta estringente (Avarbock et & # xa0al., 1999 Hogg et & # xa0al., 2004). Uma única enzima Rsh semelhante a RelA / SpoT também foi identificada em Brucella (Dozot et & # xa0al., 2006).

O envolvimento de ppGpp na formação persistente de IBPs foi sugerido para S. enterica und M. tuberculosis (Helaine et & # xa0al., 2014). Helaine e colegas de trabalho relataram que Salmonella Os vacúolos que vivem dentro de macrófagos (MP) são expostos a condições potencialmente estressantes que induzem a expressão de 14 módulos de TA tipo II de maneira dependente de ppGpp / Lon, e esse evento aparentemente desempenha um papel importante na formação de células persistentes. Também foi demonstrado que, em S. Typhimurium, persistência desencadeada por ShpAB (também um módulo TA tipo II com dependência de Lon) também ocorre em um relA mutante, ou seja, na ausência de síntese de ppGpp (Slattery et & # xa0al., 2013). Deve-se ter em mente, no entanto, que o envolvimento do ppGpp na formação do persistente claramente não se restringe ao seu papel na ativação dos módulos de TA (Liu et & # xa0al., 2017) (ver também abaixo).

No M. tuberculosis, a única enzima Rsh (RelMtb), responsável pela produção de ppGpp, é necessária para a sobrevivência a longo prazo sob em vitro condições de fome (Primm et & # xa0al., 2000). Dahl e colegas (Dahl et & # xa0al., 2003) relataram que RelMtb é fundamental para o estabelecimento bem-sucedido de infecção persistente em camundongos, alterando a expressão de fatores antigênicos e enzimáticos que podem contribuir para o sucesso da infecção latente. A resposta rigorosa (envolvendo ppGpp) medeia a persistência em M. tuberculosis (Chuang et & # xa0al., 2015). M. tuberculosis cepas que expressam uma sintetase de ppGpp mutante (RelMtb) são incapazes de persistir em camundongos, também demonstrando que a atividade de RelMtb é necessária para manter os títulos de micobactérias durante a infecção crônica (Weiss e Stallings, 2013). Um mutante RelMtb não retarda a replicação durante a privação de nutrientes e realiza um metabolismo semelhante ao da cepa de tipo selvagem em meio rico em nutrientes (Dutta et & # xa0al., 2019). Além disso, foi relatado (Wayne e Lin, 1982 Dutta e Karakousis, 2014) que em M. tuberculosis culturas que crescem em condições ideais, células dormentes de tradução pré-existem como uma pequena subpopulação e que parte desses persistentes pré-existentes são células com superexpressão de RelMtb (Srinivas et & # xa0al., 2020). Curiosamente, o envolvimento de ppGpp na formação persistente parece estar restrito a micobactérias patogênicas (Bhaskar et & # xa0al., 2018).

Sobre o envolvimento de ppGpp em L. monocytogenes, um estudo de Taylor e colegas (Taylor et & # xa0al., 2002) mostrou que um relA mutante, que foi incapaz de acumular ppGpp em resposta à privação de aminoácidos, foi avirulento em um modelo de infecção murina (em contraste com a cepa de tipo selvagem), indicando um papel essencial da resposta estrita para a sobrevivência e crescimento de L. monocytogenes neste host. Um link para persistência não é aparente neste estudo. No Francisella, o envolvimento de ppGpp na rede regulatória que rege a expressão do gene de virulência foi estabelecido (Charity et & # xa0al., 2009 Dean et & # xa0al., 2009 Cuthbert et & # xa0al., 2017), mas novamente o possível papel na persistência permanece obscuro.

A presença de persistentes, clinicamente relevantes Legionella pneumophila cepas em diferentes ambientes naturais, muitas vezes em estreita associação com amebas de vida livre e biofilmes multiespécies, está bem documentado (Berjeaud et & # xa0al., 2016 Abu Khweek e Amer, 2018), mas virtualmente nada se sabe sobre os mecanismos que causam essa persistência. L. pneumophila requer a síntese de ppGpp em resposta à privação de aminoácidos para atingir um estado que permita à bactéria escapar da ameba infectada (Hammer e Swanson, 1999). Durante seu ciclo de vida intracelular em MPs hospedeiros, L. pneumophila alterna entre um estado replicativo e um transmissivo (Swanson e Fernandez-Moreira, 2002). Nessas células hospedeiras, o ppGpp parece ser necessário para a transmissão, uma vez que um relA/ver mutante é morto durante a entrada e saída de MPs. Trabalhos adicionais mostraram, no entanto, que RelA (que detecta privação de aminoácidos) é dispensável em MPs, enquanto a atividade de hidrolase de SpoT (e, portanto, hidólise de ppGpp) é essencial para a conversão da bactéria da fase transmissiva para a replicativa em MPs (Dalebroux et & # xa0al., 2009). Os autores concluem que a degradação de ppGpp mediada por SpoT (monitoramento da biossíntese de ácidos graxos, ver acima) é necessária para essa alternância em MPs. No entanto, a questão de saber se ppGpp também desempenha um papel na formação de persistência de L. pneumophila, permanece sem resposta (Abu Khweek e Amer, 2018).

No Brucella spp., resposta estrita é induzida por estresse nutricional através da ppGpp que é sintetizado por uma única enzima Rsh bi-funcional. Rsh mutantes de deleção de Brucella suis e B. melitensis mostram uma morfologia alterada e uma taxa de sobrevivência reduzida em condições de fome em modelos de infecção celular e murina (Dozot et & # xa0al., 2006). A conversa cruzada dependente de ppGpp entre as respostas de estresse de nutrientes, oxidantes e de baixo oxigênio foi demonstrada, sugerindo um papel importante do ppGpp na adaptação de Brucella ao hospedeiro (Hanna et & # xa0al., 2013) e possivelmente na persistência e infecções crônicas (Ficht, 2003).

Coxiella e Bartonella spp. possuem sintases ppGpp, mas nada se sabe sobre a possível participação do ppGpp na formação persistente dessas IBPs. Clamídia spp. e Rickettsia spp. carecem de sintases ppGpp e, portanto, são incapazes de produzir ppGpp (Mittenhuber, 2001).

Resposta geral ao estresse e sua ligação com a persistência

Além da resposta estrita dependente de ppGpp, a resposta geral ao estresse (GSR) parece também estar ligada à persistência (Boaretti et & # xa0al., 2003 Hong et & # xa0al., 2012 Schellhorn, 2014 Tkachenko et & # xa0al., 2014 Harms et & # xa0al., 2016 Trastoy et & # xa0al., 2018). No E. coli (e bactérias relacionadas), GSR depende do fator sigma S (RpoS). RpoS governa a expressão de muitos genes indutíveis de fase estacionária em E. coli (Hengge-Aronis, 1996 Battesti et & # xa0al., 2011) e a entrada na fase estacionária é conhecida por levar ao aumento da formação de persistência (Wood et & # xa0al., 2013). Uma variedade de condições de estresse ambiental também pode induzir GSR, incluindo privação de nutrientes, variações de temperatura, produção de biofilme, pH alto, estresse oxidativo e hiperosmolaridade. GSR também está conectado com módulos ppGpp e TA: ppGpp estimula o acúmulo de RpoS (Brown et & # xa0al., 2002 Hirsch e Elliott, 2002 Dalebroux et & # xa0al., 2010). Antitoxinas de certos módulos TA reprimem a expressão de RpoS. However, upon stress, the antitoxins are degraded and RpoS expression is induced (Wang etਊl., 2011 Wang and Wood, 2011 Hu etਊl., 2012).

GSR in IBPs and Its Link to Persistence

Among the IBPs, GSR is controlled by RpoS in the gamma-proteobacteria Shigella, Salmonella, Legionella, e Coxiella, and the involvement of RpoS in formation of persistence has been suggested for salmonellae and shigellae (Trastoy etਊl., 2018). No L. monocytogens, GSR is regulated by the alternative sigma factor SigB (Mittenhuber, 2002), similar as in B. subtilis and a small group of other Gram-positive bacteria (Hecker and Volker, 2001). SigB is involved in the survival of both saprophytic and host-associated stresses by L. monocytogenes (Dorey etਊl., 2019). A SigB-related factor is also present in M. tuberculosis (Mittenhuber, 2002), where it plays a major role in determining the level of tolerance to several drugs and the amount of persisters surviving drug treatment (Pisu etਊl., 2017).

GSR in alpha-proteobacteria, such as Rickettsia, Bartonella e Brucella, is controlled by a cascade including the alternative sigma factor �G (also termed 𼏡 or RpoE1), the anti-sigma factor NepR, and the anti-anti-sigma factor PhyR (Fiebig etਊl., 2015 Francez-Charlot etਊl., 2015). No Brucella, these factors control transcription of approximately 100 genes involved in persistence in a BALB/c mouse chronic infection model (Kim etਊl., 2013 Willett etਊl., 2016). To our knowledge, there are no reports on a possible involvement of GSR-mediated regulation cascade in persister formation of Bartonella e Rickettsia. The obligate intracellular Clamídia lacks all of these GSR-mediating sigma factors.

Oxidative Stress, Reactive Oxygen Species, Oxygen Stress Response, and the Links to Persistence

The connection between persister formation and oxidative stress, the subsequent increased reactive oxygen species (ROS) production, and the oxidative stress response (OSR) thereby induced, has been extensively described (Dörr etਊl., 2009 Möker etਊl., 2010 Vega etਊl., 2012 Wu etਊl., 2012 Wang etਊl., 2017). Augmented ROS production alters the membrane potential and causes damage of proteins, lipids, and nucleic acids (in particular DNA) with a strong impact on persister formation (Wang etਊl., 2017).

No E. coli, an increased ROS level induces the transcription factors SoxRS and OxyR that are primarily involved in the expression of antioxidant activities. But SoxRS can also induce the expression of the AcrAB-TolC multidrug-resistant pump causing extrusion of antibiotics. As consequence, a larger fraction of cells become persisters in the presence of antibiotics (Wu etਊl., 2012).

Increased persister subpopulations are also observed upon treatment of bacterial populations with bactericidal antibiotics (Kohanski etਊl., 2007 Kreuzer, 2013 Belenky etਊl., 2015 Kawai etਊl., 2015). Bactericidal antibiotics�sides blocking their primary targets—lead to downstream effects including metabolic changes accompanied with increased production of ROS (especially hydroxyl radicals) which, as already mentioned above, damage essential cellular components, ultimately causing cell death. In line with this assumption is the finding that bacteriostatic antibiotics, which recognize the same primary targets as the bactericidal antibiotics, do not trigger ROS production (Kohanski etਊl., 2007).

The enhanced persister formation arising upon treatment of a bacterial population with bactericidal antibiotics is apparently connected with this oxidative stress and the subsequent OSR leading to several response reactions that favor persistence (Walawalkar etਊl., 2016 Tosic-Pajic etਊl., 2017).

IBPs frequently encounter oxidative stress during infection. MPs—host cells for most IBPs—generate ROS and reactive nitrogen species (RNS) upon activation. Thus, ROS and subsequent OSR could also contribute to persistence (and possibly) chronic infections of IBPs. However, convincing experimental data are missing to support this assumption.

DNA Damage-Induced SOS Response and Its Link to Persistence

The association of persister formation to SOS response induced by DNA damage has been primarily studied in E. coli. The SOS pathway is crucially involved in the repair of DNA damage in bacteria (Kreuzer, 2013). The key regulators controlling the SOS network are LexA and RecA. Mutants lacking the lexA ou o recA gene are more susceptible to quinolones and exhibit significantly reduced persistence in presence of these antibiotics (Dörr etਊl., 2009 Fung etਊl., 2010 Wu etਊl., 2012), while the constitutive expression of these genes strongly enhances persistence under these conditions (Dörr etਊl., 2009). These results suggest that persistence triggered by quinolones is influenced by the ability of the bacterial cell to repair DNA damage.

A link between SOS response and specific TA modules has also been demonstrated. Deletion of the SOS-inducible TisAB pair causes high reduction of persister cells however, deletion of other LexA-box-containing TA pairs has no effect on persister formation (Dörr etਊl., 2010 Lewis, 2010). TisB is a membrane peptide that causes a decrease of the proton motive force and ATP levels. The resulting ATP depletion could therefore be also responsible for the SOS-induced persister formation by the TisAB TA module (Unoson and Wagner, 2008 Lewis, 2010 Shan etਊl., 2017). These examples show the complex interactions of the various stress conditions and the resulting cellular responses ultimately causing persister formation.

Involvement of the GTPase Obg in Persistence

Obg (also known as ObgE and CgtA) is a highly conserved GTPase present in all bacteria. It appears to function as a regulator for fundamental cellular processes such as ribosome maturation, DNA replication and chromosome segregation (Sikora-Borgula etਊl., 2002 Sikora etਊl., 2006 Persky etਊl., 2009 Kint etਊl., 2014). Obg has also been found to be central in controlling persistence in E. coli e Pseudomonas aeruginosa (Verstraeten etਊl., 2015). No E. coli, Obg-mediated persistence depends on ppGpp and the type I toxin HokB. An elevated ppGpp level induced by Obg leads to enhanced expression of the type I TA module HokB/SokB. The increased expression of the pore-forming HokB toxin results in a collapse of the membrane potential causing ATP leakage associated with persistence (Wilmaerts etਊl., 2018). All IBPs possess Obg-like proteins (Table 1), but there are no reports showing their involvement in persistence of IBPs.

tabela 1 Presence and absence of factors in intracellular bacterial pathogens (IBPs) that were previously found to be associated with persistence.


Adipose Tissue and Infections

As always in research on AT, the initial datasets emerged from studies of obesity. Interestingly, obesity and susceptibility to infections appears to have a two-way link, and AT has a key role in the dialog between metabolism and the immune system. On the one hand, it has been shown that infection impacts AT biology both indirectly (através da the bystander effect of inflammation) and/or directly (através da the impact of local pathogen persistence). These findings strengthen the “infectobesity” hypothesis, in which obesity has an infectious etiology. On the other hand, a growing body of evidence indicates that the obesity-induced disruption of AT direct influences the patients’ susceptibility to infection. AT therefore appears to contribute to anti-infectious immune responses and, at the same time, constitute a target for pathogens and a site at which infections induce perturbations. Both of these aspects will be reviewed below – firstly in contexts unrelated to HIV, and secondly in the specific context of HIV infection.

Our understanding of AT’s contribution to anti-infectious immune responses has changed over time (Figure 4). AT was initially considered to be an inert mechanical barrier – a buffer site that protects against mechanical trauma and thus protects organs from breach and subsequent infections. In the early 2000s, innate immune cells were found in AT (Zeyda and Stulnig, 2007 Schaffler and Scholmerich, 2010). In particular, the AT-resident macrophage fraction was found to contribute to strong pro-inflammatory responses with both local and paracrine effects (Hotamisligil, 2006 Ouchi et al., 2011 Jackson et al., 2017). Other immune cells (CD8 T cells and NK cells) have been identified more recently, although the cells’ local effects have mainly been studied with regard to metabolic homeostasis. Our knowledge of AT’s anti-infectious potential has also benefited from research showing that adipocytes per se exert antimicrobial responses (Nippe et al., 2011 Alcorn and Kolls, 2015). Lastly, the discovery of memory T cell accumulation in AT as a means of providing efficient secondary responses against pathogens constituted a major breakthrough it became clear that AT is an immune partner in both local and systemic immune responses (Han et al., 2017 Figure 5). However, AT is a reservoir for pathogens in various infectious contexts (Nishimura et al., 2000 Neyrolles et al., 2006 Desruisseaux et al., 2007 Dhurandhar, 2011 Nagajyothi et al., 2012 Couturier et al., 2015, 2016 Damouche et al., 2015 Trindade et al., 2016 Beigier-Bompadre et al., 2017 Tanowitz et al., 2017 Couturier and Lewis, 2018 Contreras et al., 2019 Table 2). The detection of various bacterial DNAs in AT also constitutes an argument in favor of the tissue-specific microbiota hypothesis (Burcelin et al., 2013). The unexpected coexistence of immune cells and pathogens within AT is intriguing, and warrants further evaluation with regard to anti-infectious immune responses. Here are some points to discuss for considering a role in immunity of AT besides its close proximity to sites of entry for infective agents.

Figura 5. The local and systemic anti-infectious properties of adipose tissue. The AT’s contribution to anti-infectious immune responses takes several forms. In addition to AT’s local anti-infectious activity, AT-resident memory T cells contributed immune defense against pathogens (as in other non-lymphoid tissues). Although it was initially considered to be a local barrier that protect other tissues after a mucosal breach, AT may also contribute to effective secondary adaptive immune responses. The AT’s local contribution to immune responses to infection includes (i) the maintenance of an effective physical barrier (by ensuring scarring and wound healing), (ii) the local secretion of anti- and pro-inflammatory cytokines (thus modulating both metabolic and immune components of metabolic homeostasis), (iii) immunosurveillance by AT-resident macrophages, and (iv) the direct production of antimicrobial peptides (such as cathelicidins) by adipocytes. Locally, both innate and adaptive immune cells contribute to anti-infectious responses. The systemic contribution of AT to immune responses against infection is mainly driven by the secretion of anti- or pro-inflammatory cytokines that modulate immune responses, regardless of the target antigen (i.e., pathogen, tumor, or self-antigens). However, the recent discovery of the systemic role played by resident memory T cells in non-lymphoid tissue means that one must consider a plethora of new ways in which immune cells in AT may contribute to memory immune response. The accumulation of memory T cells in AT close to interface and lymphoid structures may be a decisive factor in the development of a memory response against a secondary infection by a previously encountered pathogen.

Mesa 2. Metabolic and anti-infectious activity of immune cells in adipose tissue.


Toxin-antitoxin systems in bacterial growth arrest and persistence

Bacterial persister cells constitute a subpopulation of genetically identical, metabolically slow-growing cells that are highly tolerant of antibiotics and other environmental stresses. Recent studies have demonstrated that gene loci known as toxin-antitoxin (TA) modules play a central role in the persister state. Under normal growth conditions, antitoxins potently inhibit the activities of the toxins. In contrast, under conditions of stress, the antitoxins are selectively degraded, freeing the toxins to inhibit essential cellular processes, such as DNA replication and protein translation. This inhibition results in rapid growth arrest. In this Review, we highlight recent discoveries of these multifaceted TA systems with a focus on the newly uncovered mechanisms, especially conditional cooperativity, that are used to regulate cell growth and persistence. We also discuss the potential for targeting TA systems for antimicrobial drug discovery.


Procedimentos experimentais

Bacterial strains and growth conditions

The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Table 1. We used the Keio collection ( Baba et al., 2006 ) for isogenic mutants and pBS(Kan) ( Canada et al., 2002 ) and pCA24N ( Kitagawa et al., 2005 ) for overexpressing genes in E. coli. The gene deletions of mqsR, gadB, gadX, mdtF, osmY e rpoS were confirmed by PCR (all primers are shown in Table S5). All strains were initially streaked from −80°C glycerol stocks on LB ( Sambrook et al., 1989 ) with glucose (0.2%) agar plates and were cultured at 37°C in LB. Kanamycin (50 µg ml −1 ) was used for pre-culturing the isogenic knockout mutants and for maintaining the pBS(Kan)-based and pET28a-based plasmids, chloramphenicol (30 µg ml −1 ) was used for maintaining the pCA24N-based plasmids, and gentamicin (15 µg ml −1 ) was used for pre-culturing the PA14 ΔrpoS mutante. Genes were expressed by adding 1 mM isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Strains and plasmids Genotype/relevant characteristics Fonte
Deformação
BL21 (DE3) F - ompT hsdSB (rB - mB - ) gal dcm λ(DE3) ΩPlacaUV5::T7 polymerase Novagen
BW25113 lacI q rrnB T14ΔlacZWJ16hsdR514 ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78 Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔmqsR BW25113 ΔmqsR Kim et al. (2010 )
BW25113 ΔgadA BW25113 ΔgadAΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔgadB BW25113 ΔgadBΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔgadC BW25113 ΔgadCΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔgadX BW25113 ΔgadXΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔhdeA BW25113 ΔhdeAΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔhdeB BW25113 ΔhdeBΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔrpoS BW25113 ΔrpoSΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔmdtE BW25113 ΔmdtEΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔmdtF BW25113 ΔmdtFΩ Km R Baba et al. (2006 )
BW25113 ΔosmY BW25113 ΔosmYΩ Km R Baba et al. (2006 )
PA14 PA14 wild-type strain Liberati et al. (2006 )
PA14 ΔrpoS PA14_17480 ΩMar2xT7, Gm R Liberati et al. (2006 )
Plasmídeos
pBS(Kan) Km R , pBS(Kan) Canadá et al. (2002 )
pBS(Kan)-mqsR Km R , pBS(Kan) Placa::mqsR + Kim et al. (2010 )
pBS(Kan)-mqsR 2-1 Km R , pBS(Kan) Placa::mqsR 2-1 + (K3N, N31Y aa substitutions) Este estudo
pBS(Kan)-mqsR 20-14 Km R , pBS(Kan) Placa::mqsR 20-14 + (R9C, L35F and V70I aa substitutions) Este estudo
pET28b a Km R , pET28b Novagen
pET28a-mqsR Km R , pET28a PT7::mqsR + marrom et al. (2009 )
pET28a-mqsR K3N Km R , pET28a PT7::mqsR K3N + (K3N aa substitution) Este estudo
pET28a-mqsR N31Y Km R , pET28a PT7::mqsR N31Y + (N31Y aa substitution) Este estudo
pET28a-mqsR 2-1 Km R , pET28a PT7::mqsR 2-1 + (K3N, N31Y aa substitutions) Este estudo
pCA24N Cm R lacI q , pCA24N Kitagawa et al. (2005 )
pCA24N-gadB Cm R lacI q , pCA24N PT5-lac::gadB + Kitagawa et al. (2005 )
pCA24N-gadX Cm R lacI q , pCA24N PT5-lac::gadX + Kitagawa et al. (2005 )
pCA24N-mdtF Cm R lacI q , pCA24N PT5-lac::mdtF + Kitagawa et al. (2005 )
pCA24N-osmY Cm R lacI q , pCA24N PT5-lac::osmY + Kitagawa et al. (2005 )
pCA24N-full rpoS Cm R lacI q , pCA24N PT5-lac::rpoS + Este estudo
  • uma. pET28b is identical to pET28a except for 1 bp that is deleted near BamHI in the multiple cloning site.
  • Km R , Gm R and Cm R are kanamycin, gentamicin and chloramphenicol resistance respectively.

EpPCR for random mutagenesis

mqsR from plasmid pBS(Kan)-mqsR under the control of the laca promoter was mutated by epPCR as described previously ( Fishman et al., 2004 ) using primers ep-pBS(Kan)-f and ep-pBS(Kan)-r. The epPCR product was cloned into pBS(Kan)-mqsR using BamHI and XbaI after treating the plasmid with Antarctic phosphatase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). The ligation mixture was electroporated into BW25113 mqsR competent cells using the Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) at 1.25 kV cm −1 , 25 µF and 200 Ω.

Toxicity screening of MqsR variants

In order to screen MqsR variants for the increased toxicity, each colony of BW25113 ΔmqsR producing MqsR variants from pBS(Kan)-mqsR was transferred to fresh LB agar plates by touching with a toothpick and incubated for 24 h to select colonies with reduced cell growth (i.e. small colony). As controls, BW25113 ΔmqsR with empty pBS(Kan) and pBS(Kan)-mqsR (native MqsR) were used. Interessante mqsR alleles were re-analysed by measuring cell growth in LB cultures in shake flasks after re-electroporation of the plasmids overnight cultures were diluted to a turbidity of 0.05 at 600 nm in LB medium, incubated in a shake flask for 9 h, and cell growth was measured at OD600 every 1 h. Mutant mqsR alleles were sequenced using a primer ep-pBS(Kan)-f. Each data point was averaged from three independent cultures.

Site-directed mutagenesis

Site-directed mutagenesis was performed at the codons corresponding to positions at K3 and N31 of MqsR using plasmid pET28a-mqsR as a template with site-directed mutagenesis primers. PCR was performed using Pfu DNA polymerase at 95°C for 1 min, with 20 cycles of 95°C for 1 min, 55°C for 50 s, and 68°C for 9 min, and a final extension of 68°C for 7 min. The constructed plasmids were electroporated into BL21 (DE3) after DpnI digestion of template plasmids. Mutations were confirmed by sequencing the constructed plasmids using the T7-f and T7-ter-r primers.

Cloning full rpoS into pCA24N

Desde a rpoS in pCA24N from the ASKA library ( Kitagawa et al., 2005 ) lacks 117 nt encoding the N-terminal 39 aa, we constructed a plasmid with a full rpoS seqüência. rpoS was amplified from E. coli BW25113 using rpoS-BseRI-f and rpoS-NS-r primers and then a second PCR was performed on the first PCR with rpoS-BseRI-f2 and rpoS-NS-r primers to obtain an N-terminal His tag and BseRI restriction site with rpoS, which was cloned into pCA24N using the BseRI and SalI restriction sites. Cheio rpoS insertion was confirmed by sequencing using the pCA24N-seq-f, pCA24N-seq-r and rpoS-RT-f primers.

Persister assay

Persister levels were determined by counting the number of colonies grown on solid media after washing and serially diluting the cells after exposure to antibiotic ( Dörr et al., 2009). To determine the number of persister cells with MqsR variants, cells were inoculated in LB medium and grown to a turbidity of 0.5 (to obtain 3–7 × 10 8 cfu ml −1 of viable cells) at 600 nm with 1 mM IPTG. Cells were washed with the same amount of 0.85% NaCl solution, adjusted to a turbidity of 1, and were exposed to 20, 26 or 40 µg ml −1 ampicillin with 1 mM IPTG for 24 h. Cells were washed and diluted by 10 2 to 10 7 via 10-fold serial dilution steps in 0.85% NaCl solution and applied as 10 µl drops on LB agar with kanamycin to determine persister cell viability ( Donegan et al., 1991 ). For isogenic mutants, cells were grown to a turbidity of 1 at 600 nm and exposed to 20 µg ml −1 ampicillin or 1 µg ml −1 ciprofloxacin for 5 h. For complementation strains, 1 mM IPTG was added at a turbidity of 0.5 at 600 nm to produce proteins from pCA24N-based plasmids, and cells at a turbidity of 1 were exposed to 20 µg ml −1 ampicillin with 1 mM IPTG for 5 h.

RNA isolation and whole-transcriptome studies

For the whole-transcriptome study of BW25113 ΔmqsR/pBS(Kan)-mqsR 2-1 versus BW25113 ΔmqsR/pBS(Kan)-mqsR, planktonic cells were grown to a turbidity of 0.5 at 600 nm in LB medium with 1 mM IPTG at 37°C, adjusted to a turbidity to 1, and exposed to 20 µg ml −1 ampicillin with 1 mM IPTG for 1 h. Cells were isolated by centrifuging at 0°C, and RNAMais tarde® buffer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was added to stabilize RNA during the RNA preparation steps. Total RNA was isolated from cell pellets as described previously ( Ren et al., 2004a ) using a bead beater (Biospec, Bartlesville, OK, USA). cDNA synthesis, fragmentation and hybridizations to the E. coli GeneChip Genome 2.0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA P/N 511302) were described previously ( González Barrios et al., 2006). Genes were identified as differentially expressed if the P-value for comparing two chips was less than 0.05 and if the expression ratio was higher than the standard deviation (1.3-fold) ( Ren et al., 2004b ) since the standard deviation was low, a fourfold cut-off for the DNA microarrays was used. The whole-transcriptome data have been deposited in the NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) and are accessible through accession number GSE31054.

For the whole-transcriptome studies with persister cells, two conditions were utilized to generate persister cells: (i) BW25113 wild-type cells were pretreated with oxidative stress prior to ampicillin treatment and (ii) rpoS mutant cells were treated with ampicillin. Gene expression profiles were compared with stationary-phase BW25113 wild-type cells. BW25113 wild-type cells were grown to a turbidity of 1 at 600 nm in LB medium at 37°C, centrifuged, resuspended in LB and exposed to 20 mM H2O2 por 10 min. After H2O2 treatment, cells were washed with 0.85% NaCl and then exposed to 20 µg ml −1 ampicillin for 5 h. rpoS mutant cells were exposed to ampicillin for 5 h at a turbidity of 1. BW25113 wild-type cells in the stationary phase (turbidity of 3) were exposed to 5 µg ml −1 ampicillin for 30 min. The whole-transcriptome data of these persister cells are accessible through Accession No. GSE34028.

QRT-PCR

To corroborate the DNA microarray data, qRT-PCR was used to quantify relative RNA concentrations using 100 ng as a template using the Power SYBR Green RNA-to-CT™ 1-Step Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The reaction and analysis was carried out by the StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The housekeeping gene rrsG was used to normalize the gene expression data. The annealing temperature was 60°C for all the genes in this study.

Western blot analysis and SDS-PAGE

To investigate MqsR protein levels, Western blot and SDS-PAGE were performed. BL21 (DE3) strains containing pET28b, pET28a-mqsR, pET28a-mqsR K3N, pET28a-mqsR N31Y and pET28a-mqsR 2-1 were grown to a turbidity of 0.2, then 1 mM ITPG was added to produce MqsR and the MqsR variants. When the turbidity reached 0.5, cells were washed with TE buffer, and protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, USA) was added to protect proteins. Samples were sonicated using a 60 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) at level 4 for 30 s twice. Total protein was quantified using a Pierce BCA Protein Assay kit (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA), 2× SDS sample buffer was added, and protein was denatured at 95°C for 5 min. The Western blot was performed using 2.5 µg protein of each sample with primary antibodies raised against a His tag (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse secondary antibodies (Millipore, Billerica, MA, USA). CL-Xposure film (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) was used after a 30 s exposure. We confirmed that the same amount of total cell protein was loaded for each sample by over-exposing the Western blot for 2 min. For SDS-PAGE, 25 µg of protein of each sample was loaded, and the gel was stained with Coomassie blue.

Oxidative and acid stress assays

Overnight cultures were diluted to a turbidity of 0.05 and grown to a turbidity of 1 at 600 nm. Cells were centrifuged and resuspended in LB and exposed to either 20 mM H2O2 for 10 min or pH 2.5 for 2 min.

Live/dead staining

The ratio of live and dead cells was quantified using a Live/Dead BacLight® kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cells were grown to a turbidity of 0.5 with 2 h induction of MqsR 2-1 and native MqsR by adding 1 mM IPTG, diluted 10 times, and washed with 0.85% NaCl. Live/Dead staining dye mixture (3 µl of a 1:1 mix of Component A and B) was added to 1 ml of washed culture and incubated at room temperature in a dark room for 15 min. Stained culture (1 µl) was observed using a 40×/0.75 Plan-NEOFLUAR dry objective with an Axiovert 200 M microscope (Carl Zeiss, Berlin, Germany). A FITC filter (excitation 490 nm and emission 525 nm) was used to observe cells stained green (live cells), and a Nile Red filter (excitation 515∼530 nm and emission 525∼605 nm) was used to observe cells stained red (dead cells). Three images were taken for each sample to quantify the average cell size (40 cells) and percentage of dead cells (more than 300 cells).

Swimming motility assay

Swimming motility of BW25113 ΔmqsR strains containing pBS(Kan), pBS(Kan)-mqsR, pBS(Kan)-mqsR 2-1 and pBS(Kan)-mqsR 20-14 was examined on motility agar plates (1% tryptone, 0.25% NaCl and 0.3% agar). Kanamycin (50 µg ml −1 ) was added to maintain the plasmids. Overnight cultures (2 µl) were used to inoculate the motility plates, and the swimming halo was measured after 20 h at 37°C.


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O Instituto de Pesquisa da Criação

Researchers have found a dimmer switch inside a protein. It tunes the protein&rsquos configuration to take advantage of quantum mechanics during photosynthesis. Two parallels with human engineering leave no doubts about the engineered origins of this light collector.

University of Chicago scientists found an elegant sensor connected to the dimmer switch. Two critical chemical parts of the protein together act &ldquoas a trigger,&rdquo according to University of Chicago news. 1

Gregory Engel is a chemist at the University of Chicago and senior author of results published in the Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). 2 His group described when the trigger senses oxygen. Too much oxygen would damage the light-harvesting machines faster than the bacteria could rebuild them. The trigger acts as a failsafe. High oxygen levels trip the trigger, which then uses quantum mechanics to redirect light energy away from the most sensitive energy transfer equipment.

Today&rsquos triggers don&rsquot happen by chance, they happen on purpose. Could these bacteria come with purpose baked into the protein?

Engel told the university, &ldquoWere these results just a consequence of biology being built from molecules, or did they have a purpose? This is the first time we are seeing biology actively exploiting quantum effects.&rdquo 1 In so many words, yes, this team found the kinds of devices&mdashsensors and dimmer switches&mdashthat only arise when an engineer intends a specific purpose. So we are actually seeing God actively exploit quantum effects in his purposeful construction of photosynthetic bacteria.

University of Chicago news said, &ldquoThese bacteria need light to survive, but even small amounts of oxygen can damage their delicate photosynthetic equipment. So they must develop ways to minimize the damage when the bacterium does encounter oxygen.&rdquo But if the bacteria waited to develop ways to maintain this equipment, they would have died! Instead, the bacteria must have had all their vital parts at once in a system-level package&mdashjust like a human engineer designs.

It looks like these bacteria were crafted from the top-down instead of bottom-up. 3

These are the two parallels: purposefully built instrumentation and all-or-nothing parts. They parallel the activities of human engineers. But those same engineers cannot explain, they can only marvel at the elegance of operation, miniaturization of scale, and intimate knowledge of quantum-mechanics that typify the Person who engineered light-harvesting nanotechnology into these invisible cells.

Who could this Person be? How can we meet Him?

The PNAS study authors add the standard nod to nature in their report&rsquos final sentence, writing, &ldquoThe redox-dependent vibronic coupling shown here exemplifies an evolutionary mechanism by which photosynthetic organisms can exploit the quantum mixing between electronic and vibrational states to control excited-state energy transfer dynamics.&rdquo 2 Evolutionary mechanism? What does that even mean?

Nobody has seen evolution&rsquos natural processes craft any mechanism, let alone craft mechanisms that outstrip mankind&rsquos abilities. And everybody has seen actual craftsmen, not accidents, craft mechanisms. There is a Person behind the biological mechanism. And whoever this Person is, He is more clever than we are and much more clever than natural processes.


Materiais e métodos

Ethics statement

This study was carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health. The University of California Davis is accredited by the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). All animal experiments were approved by University of California Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocol number 16612).

C57BL/6 (B6) mice were purchased from the National Cancer Institute (Frederick, MD) and The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). μMT mice were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). RORγt-GFP reporter mice were obtained from Dr. Marc Jenkins (University of Minnesota). Mice used for experiments were 6–12 weeks old, unless otherwise noted. All mice were maintained in accordance with University of California Davis Research Animal Resource guidelines.

Bactérias

Chlamydia muridarum strain Nigg II was purchased from ATCC (Manassas, VA). The organism was cultured in HeLa 229 cells in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Elementary bodies (EBs) were purified by discontinuous density gradient centrifugation as previously described and stored at −80 degree [41]. The number of IFUs of purified EBs was determined by infection of HeLa 229 cells and enumeration of inclusions that were stained with anti-Clamídia MOMP antibody. Heat-killed EBs (HKEBs) were prepared by heating at 56°C for 30 min. A fresh aliquot was thawed and used for every infection experiment. Salmonella enterica serovar Typhimurium strains BRD509 (AroA − D − ) were kindly provided by Dr. D. Xu (University of Glasgow, Glasgow, U.K).

Clamídia infection and enumeration

For systemic infection, mice were injected intravenously in the lateral tail vein with 1×10 5 C. muridarum. To enumerate the bacteria burden in tissues, the spleen, liver and kidney, were crushed in 5 mL SPG buffer and tissue homogenate was placed in a tube with glass beads to disrupt cells. After shaking for 5 min, and centrifugation at 500 g for 10 minutes, supernatants were collected and serial dilutions were plated on HeLa 229 cells. For intravaginal infections, estrus was synchronized by subcutaneous injection of 2.5 mg medroxyprogesterone acetate (Greenstone, NJ) 7 days before infection. 1×10 5 C. muridarum in 5 µL SPG buffer were then deposited into vaginal vaults. To enumerate bacteria, vaginal swabs were collected, shaken with glass beads, and serial dilutions were plated on HeLa 229 cells.

ELISPOT assay

Spleen and lymph nodes (axillary, brachial, inguinal and mesenteric) were harvested and a single-cell suspension prepared. After RBC lysis, CD4 + T cells were enriched using LS MACS columns and anti-CD4 magnetic beads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Enriched CD4 + T cells were incubated with irradiated APCs from naive mice in the presence of 10 µM Clamídia peptide (RplF51–59, FabG157–165, Aasf24–32 or PmpG-1303–311) in 96-well ELISPOT plates (Millipore, Billerica, MA) that had been pre-coated with purified anti-IFN-γ (BD Biosciences, San Diego, CA). The RplF51–59, FabG157–165, Aasf24–32 and PmpG-1303–311 epitopes used for stimulation have been described previously [21], [42]. After 20 h of incubation at 37°C, cells were washed and cytokine spots developed using biotinylated anti-IFN-γ (BD Biosciences), AKP Streptavidin (BD Biosciences), and 1-Step NBT/BCIP substrate (Thermo Scientific, Waltham, MA). Cytokine spots were counted using an ImmunoSpot S5 Core Analyzer (C.T.L., Shaker Heights, OH), and the total number of IFN-γ-producing CD4+ T cells per spleen was calculated.

Construction of pMHCII tetramers

The methodology for construction of pMHCII tetramers has been described in detail [22]. Briefly, biotinylated I-A b monomers containing a covalently linked C. muridarum peptide (RplF51–59, Aasf24–32 or PmpG-1303–311) were expressed by S2 Drosophila insect cell lines and cultured in a Wave Bioreactor (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA). After purification, I-A b monomers were tetramerized by co-incubated with fluorochrome-conjugated streptavidin at a pre-determined optimal ratio at room temperature for 30 min [22]. To test for tetramer specificity, C57BL/6 mice were immunized with each of the three peptides and CFA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Seven days post-immunization, draining lymph nodes were isolated and tetramer positive cells enriched using the methodology described below.

Tetramer enrichment and flow cytometry

Spleen and LNs were harvested from naïve or infected mice. Single cell suspensions were prepared in FACS buffer (PBS with 2% FCS) and stained with tetramers in Fc block (culture supernatant from the 24G2 hybridoma, 2% mouse serum, 2% rat serum, and 0.01% sodium azide) for 1 h at room temperature in the dark. Cells were then washed and tetramer positive cells enriched via LS MACS columns and anti-fluorochrome magnetic beads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Bound and unbound fractions were stained with a panel of monoclonal antibodies (listed below) and analyzed on a FACSCanto or an LSRFortessa flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). To stain for intracellular transcription factors and cytokines, cells were left untreated or stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 50 ng/ml), ionomycin (200 ng/ml) in the presence of brefeldin A (10 µg/ml) for 4 h at 37°C. After surface staining, cells were fixed, permeablized and stained using the Foxp3 staining Kit (eBioscience, San Diego, CA). Antibodies for staining included FITC-CD11b, CD11c, F4/80, B220, TNFα PerCP-eFlour710-CD4 APC-CCR7 eFlour660-T-bet Alexa700-CD44 eFlour450-CD3, Foxp3, IFN-γ (eBioscience, San Diego, CA) FITC-IL-17A and APC-Cy7-CD8 (BD Biosciences, San Diego, CA). Flow data were analyzed using FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR) and endogenous, tetramer-specific CD4 T cells were identified using a previously published gating strategy [22].

Análise estatística

All data sets were analyzed by unpaired Student's t-test using Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). A p value<0.05 were considered statistically significant.


Assista o vídeo: Utholdenhet og oksygentransport i kroppen (Junho 2022).


Comentários:

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  6. Arahn

    Peço desculpas por interromper você



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