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Células-tronco da pele (epiteliais): unipotentes ou multipotentes?

Células-tronco da pele (epiteliais): unipotentes ou multipotentes?



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Em um vídeo na plataforma Khan sobre células-tronco, as células-tronco epiteliais são descritas como células-tronco unipotentes, ou seja, produzem apenas um tipo de célula especializada: células epiteliais ou da pele.

No entanto, em um site que descreve a hierarquia da potência das células [tronco], mostra-se que as células da pele são o produto de células-tronco multipotentes:

Qual categoria é a correta para células-tronco da pele - unipotentes ou multipotentes?

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Neste artigo da sciencedirect.com, as células epiteliais da pele são descritas como produtos de células-tronco epiteliais multipotentes e / ou células "progenitoras" unipotentes (que presumo ser uma forma de descrever uma célula-tronco que produz apenas um tipo de célula - neste caso, uma célula epitelial ou da pele). As células-tronco multipotentes epiteliais podem produzir uma variedade de células.

A maioria dos tecidos epiteliais se auto-renovam ao longo da vida adulta devido à presença de células-tronco multipotentes e / ou células progenitoras unipotentes [enfatiza o meu].

Células-tronco epiteliais e suas linhagens As células-tronco epiteliais podem gerar tecidos que exibem uma fascinante variedade de arquiteturas celulares, cada uma das quais feita sob medida para funções distintas. Nesta revisão, enfocaremos quatro células-tronco epiteliais bem caracterizadas cujos tecidos possuem diversos desenhos arquitetônicos e fisiologia: intestino, epiderme, glândula mamária e córnea.

Portanto, parece que a resposta à minha pergunta é: ambos.


Progenitores multipotentes e unipotentes contribuem para o desenvolvimento pós-natal da próstata

A próstata é um epitélio glandular composto de células basais, luminais e neuroendócrinas que se originam do seio urogenital durante o desenvolvimento embrionário. Após o nascimento, a próstata continua se desenvolvendo até o final da puberdade. Aqui, usamos experimentos de rastreamento de linhagem genética induzível em camundongos para investigar a hierarquia celular que governa o desenvolvimento pós-natal da próstata. Descobrimos que o desenvolvimento pós-natal da próstata é mediado por células-tronco multipotentes basais que se diferenciam em células basais, luminais e neuroendócrinas, bem como por progenitores basais e luminais unipotentes. A análise clonal de células basais revelou a existência de progenitores basais bipotentes e unipotentes, bem como células basais já comprometidas com a linhagem luminal com células intermediárias que coexpressam marcadores basais e luminais associados a esta etapa de comprometimento. A existência de progenitores basais multipotentes durante o desenvolvimento pós-natal da próstata contrasta com os conjuntos distintos de células-tronco basais e luminais unipotentes que medeiam a regeneração da próstata adulta. Nossos resultados revelam a hierarquia celular que atua durante o desenvolvimento da próstata e serão fundamentais na definição da origem celular e dos mecanismos subjacentes à iniciação do câncer de próstata.


Engenharia de tecidos da pele

A pele é o maior órgão do corpo e é fundamental para a sobrevivência do organismo como barreira ao meio ambiente e para regulação térmica e retenção da hidratação. Para cumprir essas funções críticas, a pele está em constante renovação e possui a capacidade de reparar feridas, que dependem dos múltiplos tipos de células-tronco presentes na pele. Os substitutos de pele projetados têm uma aplicação médica crítica para pacientes com queimaduras extensas. No entanto, os substitutos da pele atuais não restauram a anatomia normal da pele, faltando os apêndices normais da pele, incluindo folículos capilares, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas, bem como as propriedades mecânicas normais da pele. Os avanços na biologia das células-tronco e na morfogênese da pele prometem a capacidade de melhorar significativamente a engenharia de substitutos da pele que, idealmente, seriam indistinguíveis da pele normal.

1. Introdução

Avanços recentes em nossa compreensão das células-tronco e da morfogênese dos tecidos podem permitir a engenharia de tecidos de reposição que restauram a anatomia e a fisiologia normais da pele e de outros tecidos. Para que os tecidos e órgãos mantenham uma homeostase entre a perda e a substituição celular, eles devem possuir células-tronco que sejam capazes de se auto-renovar e também de se diferenciar. As células-tronco também são essenciais para a resposta ao trauma para substituir o tecido danificado. Fontes de células-tronco para substituição de tecido incluem células-tronco somáticas específicas de tecido. Alternativamente, as células-tronco embrionárias, que são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto embrionário, podem ser diferenciadas na célula-tronco específica do tecido desejada. O uso de células-tronco embrionárias humanas tem sido controverso por razões éticas devido à necessidade de isolá-las de embriões humanos. A recente descoberta de que fibroblastos humanos normais podem ser reprogramados em células pluripotentes (iPS) indistinguíveis de células-tronco embrionárias (Jaenisch e Young, 2008), reabre a possibilidade de usar essas células-tronco embrionárias derivadas para engenharia de tecidos. O desafio de criar uma pele estrutural e funcionalmente equivalente à pele normal requer não apenas a capacidade de formar as várias células-tronco específicas da pele, mas também de induzir a sinalização adequada necessária para a morfogênese desse órgão complexo.

2. Substitutos de pele atuais

A pele é o maior órgão do corpo humano, representando aproximadamente um décimo da massa corporal, e é necessária para a sobrevivência animal. Este órgão desempenha várias funções importantes, incluindo barreira física ao ambiente externo, regulação térmica e retenção da hidratação normal. Quando uma grande porcentagem de pele é perdida, lâminas epiteliais cultivadas são rotineiramente usadas para fazer enxertos autólogos, que podem salvar vidas para pacientes com queimaduras extensas (De Luca et al., 1989 Gallico et al., 1984 Romagnoli et al., 1990) . Os queratinócitos autólogos podem ser isolados e cultivados em camadas coesivas de epitélio que podem ser transplantadas em grandes defeitos da pele do paciente. Os queratinócitos clonogênicos, denominados holoclones, podem ser isolados da pele e propagados em série na cultura por mais de 140 duplicações e foram mostrados como células-tronco multipotentes genuínas com base em sua capacidade de renovar várias linhagens na pele (Claudinot et al., 2005 Mathor et al., 1996). Essas células-tronco enxertadas dentro dessas lâminas epiteliais garantem a restauração e renovação da epiderme por anos.

O cultivo de células-tronco epidérmicas em matrizes de fibrina ou derme alogênica provou ser vantajoso. Esses substratos de suporte melhoraram substancialmente as taxas de pega dos enxertos, melhoraram a facilidade de manuseio e manipulação dos enxertos e diminuíram a retração da borda da ferida e cicatrizes. A cultura de células-tronco epidérmicas autólogas torna possível obter grandes lâminas epiteliais para transplante a partir de uma pequena biópsia de pele do paciente, mas esse processo requer várias semanas. O cultivo de células-tronco em um substrato diminui o tempo necessário para fazer grandes lâminas epiteliais a partir de uma pequena biópsia de pele porque o epitélio no substrato não precisa atingir a confluência completa antes do transplante. Além disso, as células-tronco epidérmicas em matrizes de fibrina ou derme alogênica conferem a capacidade de regenerar a junção dermoepidérmica ondulada normal e a porção superficial da derme, denominada derme papilar (Ronfard et al., 2000).

No entanto, esses enxertos de células-tronco epidérmicas não são capazes de restaurar uma pele totalmente funcional. Os apêndices epidérmicos, incluindo folículos capilares, glândulas sebáceas ou glândulas sudoríparas não são regenerados após o transplante desses enxertos de células-tronco epidérmicas, sugerindo que interações epiteliais e mesenquimais complexas são necessárias para formar apêndices. Além disso, os enxertos não restauram as propriedades mecânicas ou a aparência estética da pele original. Os avanços na biologia das células-tronco e na morfogênese da pele têm o potencial de melhorar a engenharia da pele que pode substituir a funcionalidade normal e a estética da pele normal.

3. Anatomia da pele

A engenharia de pele equivalente à pele normal tem sido um desafio devido à complexidade estrutural e funcional do órgão da pele. O órgão da pele é composto por diversas células derivadas de três origens embrionárias distintas: neurectoderme, mesoderme e crista neural. A pele é composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme (ver Figura 1). A epiderme, a camada mais externa, é composta principalmente de epitélio escamoso estratificado de queratinócitos, que é derivado da neurectoderme e compreende mais de noventa por cento das células epidérmicas. Os queratinócitos são responsáveis ​​pela coesão da estrutura epidérmica e pela função de barreira. Melanócitos contendo pigmento de origem na crista neural, células de Langerhans de processamento de antígeno de origem na mesoderme e células de Merkel com detecção de pressão de origem na crista neural também residem na epiderme.


Anatomia da pele. A pele é composta por três camadas, começando com a camada mais externa: epiderme, derme e hipoderme. A epiderme é um epitélio escamoso estratificado dividido em quatro camadas, começando pela camada mais externa: estrato córneo (SC), estrato granuloso (SG), estrato espinhoso (SS) e estrato basal (SB). A bainha externa da raiz do folículo piloso é contígua à camada epidérmica basal. Os nichos de células-tronco incluem a camada epidérmica basal, a base da glândula sebácea, a protuberância do folículo piloso, as papilas dérmicas e a derme.

A derme é um tecido conjuntivo responsável pelas propriedades mecânicas da pele. É composto por fibroblastos de origem mesoderme, que se encontram dentro de uma matriz extracelular especializada. Os colágenos estão entrelaçados com elastina, proteoglicanos, fibronectina e outros componentes. A epiderme e a derme são conectadas por uma membrana basal composta por várias integrinas, lamininas, colágenos e outras proteínas que desempenham papéis importantes na regulação da interferência epitelial-mesenquimal. A derme papilar superficial é organizada em estruturas semelhantes a cristas chamadas papilas dérmicas, que contêm redes microvasculares e neurais e estendem a área de superfície para essas interações epitelial-mesenquimal. Glândulas sebáceas, glândulas écrinas, glândulas apócrinas e folículos pilosos são de origem neurectoderme e se desenvolvem como crescimento descendente da epiderme para a derme. Além disso, a derme também contém vasos sanguíneos e vasos linfáticos de origem mesoderme e terminações nervosas sensoriais de origem na crista neural. A hipoderme, que é profunda na derme, é composta principalmente de tecido adiposo de origem mesoderme e separa a derme da fáscia muscular subjacente.

4. Células-tronco da pele

A fim de desempenhar e manter sua função de barreira enquanto continuamente exposta a traumas mecânicos e químicos do meio ambiente, a pele deve sofrer renovação constante ao longo da vida adulta e ter a capacidade de reparo de feridas para substituir células danificadas. Semelhante ao papel das células-tronco hematopoéticas na medula óssea para gerar continuamente células sanguíneas maduras, a capacidade do tecido da pele de se auto-renovar é conferida pelas células-tronco específicas da pele. As células-tronco multipotentes ou unipotentes da pele são células de ciclo lento que residem em pelo menos cinco nichos distintos na pele: camada basal (mais interna) da epiderme, protuberância do folículo piloso, base da glândula sebácea, papilas dérmicas e derme (ver Figura 1) . Essas células-tronco não são apenas críticas para a manutenção a longo prazo do tecido da pele, mas também são ativadas por feridas para proliferar e regenerar o tecido.

A epiderme da pele está passando por um rejuvenescimento constante ao se desprender de suas células superficiais enquanto as substitui por novas células na camada basal em proliferação que se diferenciam e se movem para dentro das múltiplas camadas de células em diferenciação terminal. Esta estrutura auto-renovável mantém uma barreira eficaz de proteção do meio ambiente e manutenção da hidratação normal. Por meio da divisão celular assimétrica, as células-tronco epidérmicas continuamente dão origem à progênie que executa o programa de diferenciação dos queratinócitos terminais: retira-se do ciclo celular, suprime sua expressão de integrina e laminina, move-se para fora em direção à superfície da pele até que se desprenda após aproximadamente 4 semanas, e são continuamente substituídos por uma nova progênie. As análises de rastreamento de linhagem demonstraram que a camada epidérmica basal é organizada em unidades proliferativas epidérmicas com pelo menos uma célula-tronco epidérmica por unidade. A pele quimérica gerada pela infecção com retrovírus expressando LacZ revelou colunas discretas de células azuis que se estendem da camada basal à camada mais externa de células diferenciadas, o estrato cornuem (Ghazizadeh e Taichman, 2001 Kolodka et al., 1998 Mackenzie, 1997). Suporte adicional para unidades proliferativas epidérmicas de auto-renovação foi demonstrado por colunas de células GFP-positivas irregulares observadas em camundongos transgênicos stop-EGFP de mutações esporádicas (Ro e Rannala, 2004). No entanto, o número de células-tronco epidérmicas dentro de uma unidade proliferativa epidérmica individual e sua capacidade de dar origem a outras linhagens dentro da pele, como glândulas sebáceas e folículos pilosos, permanecem obscuros. Estudos futuros são necessários para identificar marcadores capazes de purificar e analisar com eficiência as células-tronco epidérmicas interfoliculares.

Os folículos capilares percorrem o ciclo de crescimento e degeneração ao longo da vida adulta, um processo que requer células-tronco para a regeneração contínua do cabelo. O ciclo do cabelo é dividido em três fases: fase de crescimento chamada anágena, fase degenerativa chamada catágena e fase de repouso chamada telógena. As células-tronco do folículo capilar são tipicamente quiescentes, mas são estimuladas para dar origem à progênie que se prolifera e se diferencia para regenerar o folículo capilar durante a fase anágena do ciclo capilar e em resposta à ferida. Com base em seu estado quiescente e sua capacidade de formar grandes colônias in vitro, essas células-tronco foram encontradas em um local discreto no folículo capilar chamado protuberância, que não degenera durante o ciclo do cabelo. A protuberância é uma parte da bainha externa da raiz que é contígua à epiderme localizada logo abaixo da glândula sebácea perto do local de fixação do músculo eretor do pêlo ao folículo piloso (ver Figura 1). Essas células-tronco foram inicialmente identificadas por experimentos de retenção de rótulo na protuberância do cabelo, que marcam as células de proliferação mais lenta administrando BrdU por uma semana em camundongos recém-nascidos e, em seguida, avaliando a retenção de rótulo na pele após quatro semanas (Cotsarelis et al., 1990). Além disso, as células dissecadas de segmentos na região de protuberância de folículos de bigode de rato e segmentos que se estendem desde a protuberância até a bainha da raiz externa inferior da pele humana adulta mais eficientemente formaram colônias altamente proliferativas e podem ser passadas a longo prazo in vitro (Kobayashi et al ., 1993 Rochat et al., 1994). Ao contrário das células-tronco epidérmicas, as células-tronco protuberantes capilares foram enriquecidas e isoladas com sucesso por três abordagens. Fuchs e colegas usaram um camundongo transgênico histona H2B-GFP regulado por tetraciclina em que quatro semanas após a administração de tetraciclina, apenas as células protuberantes marcam brilhantemente (Tumbar et al., 2004), eles também empregaram um camundongo transgênico K14-GFP em combinação com anticorpos contra α6-integrina e CD34 (Blanpain et al., 2004). Alternativamente, Cotsarelis e colegas usaram camundongo transgênico K15-GFP com anticorpo contra α6-integrina (Morris et al., 2004). As células-tronco protuberantes normalmente geram apenas as linhagens dos folículos capilares para manter a homeostase, mas contribuem para a epiderme como uma resposta de reparo inicial quando a epiderme é ferida (Ito et al., 2005 Oshima et al., 2001 Taylor et al., 2000 ) No entanto, os sinais moleculares que mobilizam as células-tronco protuberantes para o reparo epidérmico permanecem desconhecidos.

As células-tronco dos melanócitos também residem na protuberância do folículo piloso e dão origem aos melanócitos tanto na matriz capilar quanto na epiderme (Nishimura et al., 2002). O uso de células-tronco de melanócitos será importante para combinar a cor da pele do paciente, bem como a cor relativa do local do corpo. Além disso, a capacidade de manipular a pele com células-tronco de melanócitos terá aplicações em distúrbios pigmentares, como o vitiligo.

As glândulas sebáceas, que estão ligadas aos folículos pilosos, também sofrem renovação contínua. As células-tronco na base da glândula sebácea são necessárias para gerar continuamente sebócitos diferenciados terminalmente, que degeneram para liberar lipídios e sebo através do canal capilar e lubrificar a superfície da pele (Ghazizadeh e Taichman, 2001).

5. Fibroblastos e células-tronco dérmicas

Embora a derme possa parecer apenas um substrato de suporte para a epiderme, tornou-se claro que se trata de uma estrutura complexa que possui comunicação sinalizadora importante com a epiderme, vital para a homeostase da pele. O principal componente celular da derme é o fibroblasto, que é de origem mesenquimal. A derme está continuamente sendo remodelada, o que é mantido por células-tronco mesenquimais. Essas células-tronco mesenquimais dão origem não apenas aos fibroblastos, mas também aos nervos e adipócitos. Os fibroblastos produzem e organizam a matriz extracelular e se comunicam entre si e com a epiderme por meio de várias vias de sinalização. Trabalhos anteriores usando perfis de expressão genômica demonstraram que fibroblastos de diferentes regiões anatômicas do corpo são heterogêneos (Rinn et al., 2006). Eles têm padrões distintos de expressão gênica em todo o genoma que são específicos do local e podem ser divididos anatomicamente em anterior-posterior, proximal-distal e dermo-não-dermal. Também há heterogeneidade nos fibroblastos do mesmo sítio anatômico. Os fibroblastos da derme papilar (derme superficial) são distintos daqueles da derme reticular (derme profunda). A composição e organização da matriz extracelular também são diferentes entre a derme papilar e a derme reticular. Além disso, existe um grupo único de fibroblastos que fica ao redor dos folículos capilares.

Uma célula-tronco distinta das células-tronco mesenquimais, que foi denominada SKP para precursor derivado da pele, foi isolada da derme como esferas flutuantes usando uma técnica previamente desenvolvida para isolar células-tronco neurais do cérebro (Toma et al., 2001) . SKPs são derivados da crista neural, pelo menos na pele facial, têm um nicho nas papilas dérmicas do cabelo e dos folículos dos bigodes e parecem ser multipotentes com base em sua capacidade de se diferenciar em células de origem neural e mesodérmica in vitro (Fernandes et al., 2004). No entanto, se os SKPs dão origem a células endógenas, como fibroblastos, células de Merkel, células de Schwann ou melanócitos, permanece obscuro.

6. Sinalização morfogenética da pele

A engenharia da pele também tem sido desafiadora por causa das vias de sinalização complexas que controlam a autorrenovação, proliferação e diferenciação, que são críticas para manter a homeostase do órgão da pele em constante regeneração. Um dos principais reguladores é o p63, que desempenha um papel crítico na regulação da autorrenovação e da capacidade proliferativa de longo prazo das células-tronco epidérmicas. Seu papel crítico foi sugerido pela primeira vez pela observação de que camundongos knockout para p63 têm capacidade prejudicada de formar epiderme (Mills et al., 1999 Yang et al., 1999). A isoforma delta N de p63 é normalmente expressa em células basais na epiderme, e p63 é regulada negativamente assim que as células migram para longe da camada basal. A redução de p63 por pequenos RNAs de interferência (siRNAs) em um sistema de cultura de pele organotípica reduziu a proliferação celular e a diferenciação terminal (Truong et al., 2006). Quando tanto o p63 quanto o p53 são nocauteados por siRNAs, a proliferação celular era normal, sugerindo que o p63 regula a proliferação celular pela inibição do p53. No entanto, o siRNA de p53 não resgatou o bloqueio da diferenciação terminal, sugerindo que a deficiência de p63 inibe a diferenciação independente de p53. Recentemente, foi demonstrado que o p63 é regulado por um microRNA da pele, miR-203, que é expresso na epiderme suprabasal e inibe a expressão do p63, reprimindo a proliferação e promovendo a diferenciação (Yi et al., 2008).

Sinais epidérmicos e dérmicos complexos atuam juntos para regular a morfogênese do cabelo na pele embrionária.Durante o desenvolvimento embrionário, um agrupamento de células epidérmicas que expressam citoqueratina 17, denominado placódio epitelial, se forma sobre um condensado dérmico que possui atividade de fosfatase alcalina. A comunicação epitelial-mesenquimal por meio da ativação Wnt e subsequente sinalização sônica de hedgehog a jusante, conduz o crescimento para baixo da epiderme para formar um folículo que produzirá cabelo ciclicamente. Os sinais que estabilizam a beta-catenina são centrais para a decisão das células-tronco de se diferenciarem em folículo piloso em vez de epiderme. Quando o excesso de beta-catenina é estabilizado na epiderme de camundongos transgênicos, folículos pilosos ectópicos se formam na epiderme interfolicular (Gat et al., 1998). Em contraste, a morfogênese do folículo capilar é inibida pela ablação condicional de beta-catenina ou expressão ectópica do inibidor de Wnt Dickoff 1 (Dkk1) (Andl et al., 2002 Huelsken et al., 2001). Quando os níveis de beta-catenina estabilizada estão transitoriamente elevados, os folículos capilares entram precocemente no anágeno (Lo Celso et al., 2004 Van Mater et al., 2003). Anteriormente, pensava-se que os folículos capilares só poderiam se formar durante o desenvolvimento embrionário e que a perda do folículo capilar adulto é permanente. No entanto, a descoberta notável de que um estímulo de ferida e a ativação da via Wnt podem desencadear a formação de folículo capilar de novo a partir de células-tronco epidérmicas paralelas ao desenvolvimento do folículo embrionário (Ito et al., 2007), sugere que a engenharia da pele com folículos capilares normais é uma possibilidade real . Curiosamente, a neogênese do folículo piloso ocorreu apenas no centro de grandes feridas longe da borda da ferida, o que sugere que a pele não ferida pode possuir um inibidor lateral difusível do cabelo e da regeneração da pele.

Os sinais dérmicos demonstraram ter a capacidade de programar a identidade das células epidérmicas. O trabalho pioneiro estudando o desenvolvimento embrionário em aves demonstrou que o componente mesenquimal da pele controla a formação e o padrão das penas (Lin et al., 2006 Sengel, 1990). Da mesma forma, a epiderme palmoplantar humana tem propriedades únicas em comparação com a pele em outras partes do corpo, notadamente expressando queratina 9, sem cabelo e tendo uma densidade mais baixa de melanócitos, que são regulados pela derme subjacente. Verificou-se que fibroblastos palmoplantares expressam DKK1, que inibe não apenas o desenvolvimento do folículo capilar, mas também a proliferação de melanócitos e a produção de proteínas melanossomais e melanina (Yamaguchi et al., 2004). Além disso, a co-cultura de queratinócitos não palmoplantares com fibroblastos palmoplantares fez com que os queratinócitos induzissem a expressão de queratina 9 (Yamaguchi et al., 1999). Esta capacidade dos fibroblastos palmoplantares de induzir a expressão da queratina 9 epidérmica foi significativamente reduzida com depleção do gene específico distal HOXA13 por siRNA (Rinn et al., 2008). HOXA13 é necessário para manter o programa de transcrição distal específico, incluindo a expressão de WNT5A, em fibroblastos humanos adultos e, notavelmente, a adição de proteína WNT5A purificada recombinante à cocultura com fibroblastos distais esgotados de HOXA13 ou aos queratinócitos na ausência de fibroblastos co-cultivados , expressão de queratina 9 epidérmica resgatada (Rinn et al., 2008). Esses resultados sugerem que, semelhante ao padrão de penas em pássaros, o padrão HOX embrionário em fibroblastos dérmicos serve como uma fonte de memória posicional para a pele humana tanto na homeostase quanto na regeneração.

7. Terapia genética da pele

Os substitutos da pele derivados de células-tronco da pele também prometem uma terapia genética viável para doenças genéticas incapacitantes da pele, como a epidermólise bolhosa. A descoberta de que a epiderme é organizada em unidades de proliferação epidérmica que são auto-renovadas por pelo menos uma célula-tronco epidérmica sugere que a transdução de células-tronco epidérmicas da camada basal da epiderme para terapia gênica deve resultar na expressão permanente do transgene . Foi demonstrado que queratinócitos transduzidos ex vivo de holoclones têm expressão de transgene que dura mais de 150 gerações de células em cultura e, mais importante, demonstrou expressar a proteína transgene quando enxertada em lâminas epidérmicas in vivo (Mathor et al., 1996). Células-tronco epidérmicas autólogas isoladas em cultura por formação de holoclones foram transduzidas retroviralmente com laminina 5 e foram transplantadas com sucesso em pacientes com epideromólise bolhosa juncional (Mavilio et al., 2006). Os enxertos regeneraram uma epiderme normal no oitavo dia e a epiderme normal foi mantida ao longo de um ano de acompanhamento.

8. Futuro

O avanço contínuo da tecnologia de reprogramação de células iPS abre a porta para fontes de células-tronco específicas do paciente para substituição de tecidos. Recentemente, descobriu-se que a eficiência da geração de iPS melhorou significativamente com o uso de queratinócitos em comparação com fibroblastos (Aasen et al., 2008). Além disso, o iPS pode ser gerado a partir de queratinócitos isolados do cabelo de um único adulto. Assim, arrancar um único fio de cabelo de uma pessoa fornece o único material de partida celular necessário para gerar células iPS, que podem então ser diferenciadas para formar células-tronco específicas de tecido, incluindo intraepidérmica, protuberância do folículo piloso, melanócito, glândula sebácea, mesenquimal e SKP células-tronco. A recente demonstração de que a introdução de três fatores de transcrição definidos pode reprogramar células exócrinas pancreáticas em camundongos adultos para células β das ilhotas sugere que a reprogramação direcionada pode até ser possível sem reversão para um estado de célula-tronco pluripotente (Zhou et al., 2008). Em outras palavras, pode ser possível que os queratinócitos de um cabelo arrancado sejam reprogramados diretamente para as várias células-tronco da pele sem um estado intermediário de iPS. A capacidade de formar todas as diferentes células-tronco da pele que podem ser combinadas em um tecido de pele projetado permitirá a regeneração de todos os tipos de células complexos dentro da pele.

Além disso, a capacidade de manipular as vias de sinalização morfogenética no tecido da pele projetado será necessária para formar um tecido adequadamente diferenciado, bem como para formar a pele apropriada para diferentes locais do corpo, por exemplo, pele facial versus pele do couro cabeludo com cabelo. Trabalhos futuros são necessários para determinar se a introdução de um estímulo à ferida e a ativação da via Wnt irão desencadear a formação de folículos capilares não apenas na pele de camundongos, mas também na pele humana projetada. A proteína Wnt3a embalada em lipossomas foi desenvolvida recentemente e demonstrou ter aumentado a atividade de Wnt3a e ter a capacidade de induzir a neogênese do folículo capilar na Vivo por injeção subcutânea em camundongos (Morrell et al., 2008). O desenvolvimento semelhante de formas de entrega de tecido eficientes de agonistas ou antagonistas de outras vias de sinalização abrirá portas adicionais para controlar a morfogênese na pele projetada.

9. Resumo

Avanços na biologia das células-tronco da pele e nas vias de sinalização que regulam a morfogênese da pele forneceram percepções profundas sobre a complexidade do órgão da pele. No entanto, nosso conhecimento permanece limitado em relação aos mecanismos precisos que mantêm as identidades únicas e sustentam os nichos para as várias células-tronco, bem como as vias de sinalização precisas que coordenam o crescimento adequado e a diferenciação dessas células-tronco para formar e sustentar a pele em constante regeneração órgão. As respostas a essas perguntas serão críticas para o uso da medicina regenerativa para melhorar a engenharia do tecido da pele para aplicações terapêuticas importantes, como queimaduras extensas ou distúrbios de bolhas genéticas graves. Os estudos genéticos e biológicos celulares em andamento sobre as células-tronco da pele e a morfogênese da pele, sem dúvida, nos aproximarão de possibilitar a engenharia de substitutos da pele que são estrutural e funcionalmente indistinguíveis da pele gerada pelo desenvolvimento embrionário normal.

Reconhecimentos

Este trabalho foi financiado por doações da Dermatology Foundation, American Cancer Society, California Institute for Regenerative Medicine e National Institutes of Health.

Referências

Este é um artigo de acesso aberto distribuído nos termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


1. INTRODUÇÃO

As glândulas ectodérmicas consistem em uma região ductal absortiva e uma porção glandular secretora. As glândulas secretoras possuem dois tipos principais de células: células mioepiteliais, também chamadas de células basais (BCs), que ficam adjacentes à membrana basal, e células luminais (CLs) que são suprabasais e circundam o lúmen das glândulas. Para investigar a existência e localização das células-tronco glandulares, rastreamento de linhagem genética altamente detalhado e experimentos de transplante foram realizados na glândula mamária e na glândula sudorípara. 1-4 Como princípio geral, os progenitores glandulares são multipotentes no início do desenvolvimento e mais tarde tornam-se principalmente unipotentes, retendo esse status após a morfogênese ser concluída, mas podem reverter para um estado menos diferenciado após perturbações como lesão ou transplante. Além disso, células-tronco multipotentes (raras) existem nas glândulas mamárias adultas, 5-7, mas não nas glândulas sudoríparas adultas, potencialmente refletindo diferenças entre essas duas glândulas em suas necessidades funcionais de remodelação glandular na idade adulta, devido às suas diferentes trajetórias de desenvolvimento: expansão rápida da mama glândulas com cada gravidez em preparação para a produção de leite versus produção consistente de suor sem quaisquer sinais de remodelação ao longo da vida. Ainda não está claro quando e como essa restrição de linhagem é estabelecida e, mais especificamente, quais fatores intrínsecos e extrínsecos contribuem para o destino desses progenitores / células-tronco glandulares.

Aqui, usando a glândula sudorípara écrina e a glândula mamária como dois modelos glandulares, discutimos as hierarquias diferenciais e o estabelecimento da restrição de linhagem durante o desenvolvimento, homeostase, remodelação, reparo de feridas e regeneração.


Discussão

Neste estudo, apresentamos um método para diferenciar hiPSCs em EpSCs funcionais que são capazes de reconstituir os componentes epiteliais do folículo piloso e da epiderme interfolicular nos ensaios de regeneração da pele. Como o ciclo do folículo capilar humano dura anos, não é possível estudar o ciclo do folículo capilar humano usando os modelos de xenoenxerto e, portanto, é difícil avaliar a renovação a longo prazo dos EpSCs derivados de hiPSC transplantados. É interessante que no dia 18 após a diferenciação, os números de células Lrig1 + / ITGA6 +, células Lrg6 + / ITGA6 + ou células MTS24 + / ITGA6 + também estão presentes na cultura (Fig. Suplementar 21). Embora a função dessas populações de células humanas seja desconhecida, as diferentes linhagens epidérmicas após o enxerto de células CD200 + / ITGA6 + podem surgir de populações de células-tronco multipotentes e de populações de células-tronco unipotentes potencialmente diferentes.

Estudo anterior demonstrou que queratinócitos multipotentes derivados de iPSC de camundongo induzidos por BMP4 podem reconstituir a pele normal e seus apêndices em um na Vivo ensaio 32. Veraitch O et al usaram um protocolo semelhante e descobriram que as células precursoras ectodérmicas derivadas de hiPSC emergiram no dia 11 contribuíram para a morfogênese do folículo capilar 33. No entanto, não ficou claro a partir do estudo que população de células nas células ectodérmicas contribuiu para a foliculogênese e a haste do cabelo mostrada no estudo parecia ser de origem de camundongo. Os autores sugerem que a baixa frequência de células derivadas de humanos nos folículos capilares observada em seu estudo implica que essas células contribuem para a morfogênese do folículo piloso via repovoamento direto e atividades autônomas não celulares 33. Observamos apenas uma pequena porcentagem de células CD200 + / ITGA6 + no dia 11 quando testamos um protocolo semelhante sem usar EGF e mais de 30% das células retiveram a expressão de SSEA3 (Fig Suplementar 22) que são iPSCs indiferenciadas e potencialmente tumorigênicas. Esgotamos as células SSEA3 + antes na Vivo ensaios de reconstituição. Mais importante, EpSCs derivados de hiPSC são capazes de restabelecer a região protuberante do folículo piloso com células KRT15 + em nosso trabalho.

Em conclusão, desenvolvemos um novo método de diferenciação de hiPSC que diferencia eficientemente hiPSCs de EpSCs, e essas células CD200 + / ITGA6 + têm características moleculares semelhantes às de hEpSCs. As células CD200 + / ITGA6 + derivadas de hiPSC isoladas por esferas magnéticas fornecem uma abordagem simples para gerar populações altamente enriquecidas de células humanas foliculogênicas que podem reconstituir os componentes epiteliais do folículo piloso e epiderme interfolicular na Vivo. Nosso estudo estabelece um meio para obter uma fonte escalonável de EpSCs humanos, que é um passo importante para o desenvolvimento de tratamentos baseados em células para queda de cabelo e outras doenças de pele. No entanto, o protocolo atual para obter EpSCs derivados de hiPSC não é compatível com o FDA e precisará ser totalmente validado. No entanto, o acesso a células com características essenciais de hEpSCs abre novas possibilidades para o estudo de terapias regenerativas para queda de cabelo, cicatrização de feridas e envelhecimento da pele.


Parte 2: Aproveitando o potencial de células-tronco adultas

00: 00: 14,25 Sou Elaine Fuchs.
00: 00: 16.10 Sou professor da The Rockefeller University em Nova York.
00: 00: 21.04 Também sou investigador do Howard Hughes Medical Institute.
00: 00: 25.20 E hoje eu gostaria de falar um pouco sobre como explorar o potencial das células-tronco adultas.
00: 00: 32.12 Cada tecido do nosso corpo tem que repor células mortas, células mortas,
00: 00: 39.01 que pelo uso e desgaste são perdidos de nossos tecidos.
00: 00: 43,18 50-70 bilhões de células morrem todos os dias em nosso corpo e precisam ser substituídas.
00: 00: 50,28 Como isso acontece?
00: 00: 52.09 Nosso corpo deve reparar seus tecidos, também, quando danificado.
00: 00: 56,26 Como isso acontece?
00: 01: 00.13 Cada tecido do nosso corpo possui reservatórios de células-tronco para homeostase e reparo de feridas.
00: 01: 07.05 Então, são as células-tronco que substituem esses 50-70 bilhões de di. bilhões de células que morrem
00: 01: 13.13 todos os dias no nosso corpo, e que também reparam as nossas feridas.
00: 01: 20.11 Alguns tecidos mudam rapidamente e possuem muitas células-tronco.
00: 01: 24,24 Essas são. como as células-tronco hematopoéticas, que regeneram as células vermelhas do sangue e as células do sistema imunológico.
00: 01: 30.28 Ou células-tronco da pele, que regeneram a epiderme e os folículos capilares e nossas glândulas sudoríparas.
00: 01: 37.02 Ou células-tronco intestinais, que rejuvenescem as células adsortivas de alimentos do nosso corpo.
00: 01: 44.00 Outros tecidos têm muito pouca capacidade regenerativa.
00: 01: 47.25 Nosso sistema nervoso central e periférico, por exemplo, tecido pancreático ou tecido cardíaco.
00: 01: 55.24 Então, quais são as características das células-tronco dos tecidos que existem nos tecidos adultos?
00: 02: 02.04 Essas células têm a capacidade de se dividir, de produzir mais células-tronco
00: 02: 06.21 - esse é um processo conhecido como auto-renovação -
00: 02: 10.02 e produzem um tecido diferenciado, como a epiderme ou o cabelo.
00: 02: 15.04 E eles fazem isso a longo prazo.
00: 02: 19.09 Essas células são relativamente imaturas em comparação com sua progênie, em comparação com as células do tecido.
00: 02: 27.19 Eles são tipicamente multipotentes, são capazes de produzir um subconjunto de linhagens celulares.
00: 02: 33.14 Exemplos: as células-tronco hematopoéticas podem formar o sangue e as células do sistema imunológico
00: 02: 38.13 as células-tronco da pele podem formar a epiderme e o cabelo.
00: 02: 43.23 É apenas o óvulo fertilizado que tem potencial ilimitado, que pode formar todas as células do nosso corpo.
00: 02: 51.15 As células-tronco dos tecidos tendem a ser mais restritas no que podem fazer.
00: 02: 55.28 E para entender por quê, precisamos estudar a biologia das células-tronco do tecido adulto.
00: 03: 02.14 Então, meu laboratório estuda a pele e as células-tronco da pele.
00: 03: 06.25 E eu sempre pensei que a natureza claramente se divertiu e se divertiu muito mais com a criação de superfícies corporais
00: 03: 11.15 do que ela fez na criação de qualquer um dos órgãos feios em que a maioria dos cientistas trabalha.
00: 03: 18.13 Meu grupo trabalha com células-tronco da pele.
00: 03: 23.16 Então, de onde vêm as células-tronco da pele adulta?
00: 03: 27.14 Eles começaram no início do desenvolvimento embrionário, logo após a gastrulação, quando o embrião
00: 03: 37.20 efetivamente vira do avesso e começa a se desenvolver no animal.
00: 03: 44.10 A pele começa como uma única camada de células que estão na superfície do embrião.
00: 03: 51.03 Essas são as células que vão dar origem à epiderme estratificada que vocês veem aqui.
00: 03: 58.15 Eles também vão gerar os folículos capilares.
00: 04: 01.04 Eles também irão gerar a superfície da córnea do nosso olho, as glândulas sudoríparas e as glândulas mamárias.
00: 04: 07.15 Todas essas células vêm desta única camada de células progenitoras multipotentes,
00: 04: 15.10 que são as origens das células-tronco da nossa pele adulta.
00: 04: 20.07 Então, as células-tronco da pele fornecem o suprimento quase infinito de células que reabastecem a epiderme
00: 04: 28.04 e os cabelos do nosso corpo.
00: 04: 30.21 Podemos isolá-los?
00: 04: 32.02 Podemos persuadi-los a transformarem-se em cabelo e também em epiderme?
00: 04: 37,21 Que valor eles têm na medicina regenerativa?
00: 04: 42.12 Quando era estudante de graduação, trabalhava com bactérias.
00: 04: 45.26 E ouvi uma palestra de Howard Green, que na época estava no MIT como cientista pesquisador.
00: 04: 53.20 E Howard desenvolveu um método onde ele poderia pegar um pedaço de pele humana,
00: 04: 58.11 e colocar as células em cultura, podendo propagá-las indefinidamente, sem perder sua capacidade
00: 05: 04.20 para fazer a pele.
00: 05: 06.08 Fiquei fascinado com a palestra dele.
00: 05: 09.18 E eu soube então que queria me tornar um biólogo de células-tronco.
00: 05: 18.09 Então, aqui estão alguns exemplos, então, das células-tronco que estão crescendo em cultura.
00: 05: 24.20 E você pode ver pelos cromossomos escuros que essas células estão se dividindo ativamente.
00: 05: 30.15 E eles podem ser propagados, como mencionei, indefinidamente.
00: 05: 34.20 Abaixo, o que você vê é uma cultura tridimensional, a chamada cultura organoide, ou um tecido,
00: 05: 43.06 onde reconstituímos a epiderme começando do zero usando estes
00: 05: 48.05 células-tronco epidérmicas humanas.
00: 05: 50.11 Parece muito bom em comparação com a epiderme da pele humana normal.
00: 05: 57.04 Então, Howard Green passou a desenvolver esta tecnologia para o tratamento de pacientes queimados,
00: 06: 03.04 onde ele poderia pegar um pedacinho da pele boa do paciente, propagar essas células em cultura,
00: 06: 09.00 e fazer lâminas - centenas de lâminas de células epidérmicas - que então poderiam ser enxertadas
00: 06: 15.06 na pele ruim do paciente.
00: 06: 16.27 Então, as células-tronco epidérmicas poderiam ser cultivadas por meses em um prato e para sempre quando enxertadas
00: 06: 23,16 em um paciente.
00: 06: 25.00 E isso mostra um exemplo de parte da pele enxertada de um desses pacientes.
00: 06: 30.24 Os pacientes que Howard Green tratou com sucesso com essas células-tronco epidérmicas humanas cultivadas
00: 06: 37.05 do paciente cobriu até 95% da pele queimada do paciente,
00: 06: 43,16 com apenas 5% dos pacientes com pele não queimada.
00: 06: 47.07 E a partir daí as células-tronco poderiam ser cultivadas.
00: 06: 50.08 Um avanço notável.
00: 06: 53.17 Depois de um ano, a epiderme da pele ainda parecia com a epiderme da pele normal.
00: 07: 00.27 E não mostrou sinais de câncer ou efeitos deletérios que pudessem nos dar uma indicação de que
00: 07: 07.06 toda essa cultura é uma coisa ruim para essas células-tronco epidérmicas humanas.
00: 07: 13.04 Michele De Luca e Graziella Pellegrini, que então estudavam no laboratório de Howard Green
00: 07: 22.06 e, em seguida, iniciaram seus próprios laboratórios na Itália, adaptando os procedimentos de cultura pioneiros
00: 07: 28.23 que Howard Green realizou, neste caso, para cultivar córnea ou células epiteliais da córnea
00: 07: 36.22 de células-tronco da córnea de um paciente.
00: 07: 40.16 Então, neste caso, o paciente teve um acidente industrial, onde um dos olhos
00: 07: 46,12 - o olho que você vê aqui - estava cego.
00: 07: 50.02 Tirando células-tronco do olho saudável, cultivando essas células e produzindo uma folha
00: 07: 57.00 de células epiteliais da córnea, foi possível, então, enxertá-la no olho cego.
00: 08: 02.25 E aqui está o resultado da terapia com células-tronco: um epitélio corneano restaurado que efetivamente
00: 08: 11.00 restaurou a visão neste olho para este paciente.
00: 08: 14,22 Então, vamos dar uma olhada dez anos depois, depois que esses experimentos com a córnea foram realizados.
00: 08: 24.22 Apenas no último mês, houve um relatório muito bem-sucedido de medicina regenerativa de corpo inteiro
00: 08: 34.02 de células-tronco epidérmicas corrigidas de doenças.
00: 08: 38.01 E, neste caso, o paciente, um menino de sete anos, sofria de uma doença genética conhecida
00: 08: 45.15 como epidermólise bolhosa juncional.
00: 08: 49.05 Este distúrbio genético é devido a mutações genéticas recessivas que podem ser tanto no
00: 08: 55.18 laminina 5, uma proteína da matriz extracelular importante para a epiderme
00: 09: 01.02 para aderir à derme subjacente, ou mutações nas integrinas alfa-6 ou beta-4,
00: 09: 08.05 que são as integrinas nas células-tronco epidérmicas que são necessárias para aderir à epiderme
00: 09: 14,16 para a derme subjacente.
00: 09: 16.15 E este paciente em particular tinha um distúrbio, ou lesão genética, na cadeia da laminina5.
00: 09: 22.13 E, como consequência, a epiderme não aderiu e efetivamente se soltou
00: 09: 30.06 do corpo do paciente com o menor trauma mecânico.
00: 09: 34.10 O paciente estava perto da morte no momento em que Michele De Luca, minha colega em Roma,
00: 09: 42.15 assumiu a tarefa de trabalhar com médicos alemães para poder colher uma pequena amostra
00: 09: 51.01 das células do paciente, queratinócitos com defeito de epidermólise bolhosa juncional
00: 09: 58.25 usou terapia genética para ser capaz de colocar de volta a cadeia de laminina normal e ser capaz de extirpar
00: 10: 05.00 a mutação genética do paciente e efetivamente, nesse ponto, então, gerado saudável
00: 10: 12.20 células-tronco epidérmicas humanas que poderiam ser mantidas e propagadas para gerar camadas de epiderme
00: 10: 19,23 que foram então enxertados neste paciente.
00: 10: 23.11 Portanto, esta terapia genética de células-tronco epidérmicas exigia apenas um pequeno número de células-tronco
00: 10: 34.09, a fim de ser capaz de repor, ou repovoar, toda a epiderme deste paciente
00: 10: 40.13 usando medicina regenerativa de corpo inteiro a partir de células-tronco epidérmicas corrigidas de doenças.
00: 10: 45.18 E aqui está o menino hoje, basicamente capaz de sair e brincar de uma maneira que ele era
00: 10: 54.23 mal conseguindo sobreviver na hora da terapia.
00: 11: 00.08 Então, mesmo um ano atrás, os cientistas não pensaram, ou estavam preocupados, que talvez não fosse possível
00: 11: 10.15 para ser capaz de produzir células-tronco epidérmicas normais e saudáveis ​​a partir da edição do gene da mutação
00: 11: 21.11 fora das células-tronco.
00: 11: 24.02 E também era duvidoso que a medicina regenerativa de corpo inteiro fosse possível corrigir
00: 11: 31.04 a base genética desta doença, ou para corrigir esta doença genética.
00: 11: 35.20 As outras células do paciente ainda abrigam aquele defeito genético, mas qual o aspecto importante
00: 11: 42,26 disso é que o paciente - a epiderme da pele do paciente - agora está corrigido.
00: 11: 50.05 E este menino pode ser capaz de pelo menos viver uma vida relativamente normal.
00: 12: 03.01 Então, quais são, então, as várias terapias associadas diferentes que se seguiram
00: 12: 14.11 a cultura de células-tronco epidérmicas que foram realizadas pela primeira vez em 1975?
00: 12: 22.10 E agora temos a correção de queimaduras de terceiro grau com células-tronco epidérmicas, e a correção
00: 12: 29.24 de epidermólise bolhosa juncional com células-tronco epidérmicas que foram editadas por genes.
00: 12: 36.04 Em 1985, tínhamos células-tronco epiteliais da córnea para corrigir a cegueira por queimaduras e por produtos químicos.
00: 12: 45.03 Em 1992, Peterson e Bissell, cientistas do Laboratório Lawrence Berkeley, e também
00: 12: 53.10 na Dinamarca, foram capazes de produzir glândulas produtoras de leite a partir de células-tronco epiteliais mamárias humanas
00: 13: 02.21 cultivadas em laboratório.
00: 13: 05.01 E estes têm sido extremamente úteis, não apenas para estudar a biologia mamária de mamíferos,
00: 13: 11.11, mas também para estudar o câncer de mama.
00: 13: 14.08 Em 2013, Sato e Clevers fizeram um avanço impressionante para serem capazes de produzir culturas organoides
00: 13: 25.11 de epitélios simples, de células epiteliais intestinais, epiteliais do pulmão, estômago e células-tronco do fígado.
00: 13: 32.09 Estes foram, novamente, avanços que levaram anos para os cientistas fazerem com, novamente, a realização
00: 13: 39.20 que o importante é entender o suficiente sobre a biologia das células-tronco para ser capaz
00: 13: 45.18 para saber sobre o seu ambiente e basicamente recriar o ambiente que aquela célula-tronco
00: 13: 51.22 normalmente tem em seu tecido normal, e recrie isso em um prato de cultura.
00: 13: 56.27 Foi determinado no início, por Howard Green e outros, para células-tronco epidérmicas.
00: 14: 02.16 Muitos anos depois, agora é possível cultivar muitos tipos diferentes de células-tronco adultas.
00: 14: 09.06 E então, aqui, pelo uso da capacidade de cultivar, por exemplo, células-tronco pulmonares,
00: 14: 15.08 também foi possível em. Novamente, apenas no ano passado na Holanda, ser capaz de
00: 14: 21.02 tratar um paciente com fibrose cística por edição de genes de culturas organoides de minipulmão cultivadas
00: 14: 29,22 do paciente e. e basicamente permitir que o paciente o faça. para voltar a ser capaz de respirar corretamente,
00: 14: 41,05 e. e promessa para o futuro.
00: 14: 47.17 Então, onde estamos em 2018 com nosso conhecimento sobre a biologia das células-tronco teciduais?
00: 14: 56.13 Porque é a biologia que vai impulsionar os avanços futuros nas clínicas,
00: 15: 02.24 e também na indústria farmacêutica e de biotecnologia.
00: 15: 06.11 Então, o que sabemos é que as células-tronco de tecidos adultos normalmente residem em nichos, em
00: 15: 14.02 microambientes.
00: 15: 15.07 Isso é verdade para o folículo piloso, para o intestino e para o sistema hematopoiético,
00: 15: 22.00 as três células-tronco sobre as quais sabemos mais sobre as células-tronco e seus nichos.
00: 15: 30.23 Quando uma célula-tronco de tecido decide, vou fazer tecido ou vou ficar dormente,
00: 15: 38,22 ou quiescente?
00: 15: 40.06 São as interações entre a célula-tronco e seu microambiente, ou as interações de nicho entre células-tronco,
00: 15: 46.04 que toma essa decisão.
00: 15: 48.27 Quando uma célula-tronco não está fazendo tecido e existe, por exemplo, na pele, basicamente
00: 15: 54,24 está recebendo sinais inibitórios do microambiente,
00: 15: 59.01 dizendo-lhe para ficar frio, ficar quieto, estar dormente e não fazer tecido.
00: 16: 05.21 Mas se uma célula-tronco precisa fazer tecido, agora deve haver sinais de interação que são
00: 16: 12.26 pistas de ação positiva que agora vão substituir essas pistas inibitórias.
00: 16: 18.22 E nesse ponto, essas células-tronco ativadas passam a fazer progenitores de vida curta,
00: 16: 24.11 que então passam a produzir a maior parte do tecido.
00: 16: 27.13 E no caso da pele, seria, por exemplo, a epiderme ou o folículo piloso.
00: 16: 33.07 A quantidade e a frequência de ativação das células-tronco dependem das necessidades de cada tecido.
00: 16: 40.22 Então, sabemos muito sobre as células-tronco da pele do meu laboratório e de pesquisas de outros laboratórios
00: 16: 47.01 nas últimas décadas.
00: 16: 51.22 E sabemos que as células-tronco do tecido residem na interface entre a epiderme
00: 16: 57,09 e a derme.
00: 17: 00.03 Mas eles estão definidos em sua tarefa e também em seu programa de expressão gênica
00: 17: 05.24 por seus nichos locais.
00: 17: 06.25 Então, as células-tronco epidérmicas que residem na camada mais interna da epiderme estão em
00: 17: 12.14 um microambiente de nicho que é muito diferente daquele das células-tronco do folículo capilar
00: 17: 17.23 que estão localizados na base da porção não cíclica do folículo piloso.
00: 17: 25.04 E que as interações célula-tronco-nicho são o que define as células-tronco em cada um desses
00: 17: 33,07 nichos. nichos, e diz às células-tronco da epiderme para fazer a epiderme
00: 17: 38.24 - produzem nossa barreira - enquanto as células-tronco do folículo capilar para fazer cabelo.
00: 17: 45.23 Então, meu laboratório estuda o folículo piloso há vários anos.
00: 17: 51.13 É realmente o sistema perfeito para entender um problema biológico básico.
00: 17: 56.07 E é assim que as células-tronco fazem a transição entre a quiescência e a regeneração do tecido.
00: 18: 02.02 Este é um problema enfrentado por todas as células-tronco dos nossos tecidos adultos.
00: 18: 06.26 E aprendemos muito sobre as várias interações diferentes que são necessárias.
00: 18: 11,23 Sabemos que essas setas vermelhas são basicamente inter. células inter-nicho que são
00: 18: 17.15 enviando um sinal chamado BMP que diz a essas células-tronco, em roxo, para serem quiescentes.
00: 18: 25.12 Sabemos que na base do nicho de células-tronco, existem sinais - novos sinais, sinais de ativação -
00: 18: 30.14 chamados Wnts, que são produzidos pelas próprias células-tronco do folículo piloso,
00: 18: 36.25 e inibidores de BMP produzidos pela célula verde subjacente,
00: 18: 41.13 basicamente uma bolsa de células mesenquimais especializadas chamadas células da papila dérmica.
00: 18: 45.27 E estes são os sinais de pró-ativação que são necessários para retirar as células-tronco
00: 18: 51.24 para fora de seu estado de repouso e persuadi-los a fazer cabelo.
00: 18: 55.18 Assim, quando os níveis de limiar dos sinais de ativação superam o sinal BMP inibitório,
00: 19: 02.26 então, as células-tronco são basicamente ativadas.
00: 19: 06.25 Eles começam a ter uma progênie de vida curta.
00: 19: 09.16 E agora a progênie de vida curta pode receber um novo sinal, este chamado ouriço sônico.
00: 19: 15.02 Sonic hedgehog age de duas maneiras, que aprendemos com o nocaute condicional
00: 19: 23.09 do receptor e do ligante.
00: 19: 26.02 O que aprendemos é que o ouriço sônico primeiro atua para estimular as células mesenquimais especializadas,
00: 19: 32.17 as células da papila dérmica, para produzir mais inibidores de BMP e também FGFs pró-ativadores.
00: 19: 40.08 Então, vários dias depois, o ouriço sônico atua nas células-tronco quiescentes, aquelas células roxas,
00: 19: 48.23 para ser capaz de reabastecer as células-tronco utilizadas no curso da regeneração do tecido,
00: 19: 55.05, mas também para produzir o eixo que então cresce para baixo, empurrando o centro de sinalização
00: 20: 02.21 longe do nicho de células-tronco.
00: 20: 04.18 E agora as células-tronco voltam à quiescência, mas a progênie de vida curta produz cabelo
00: 20: 11.23 e o canal em que o folículo piloso se encontra.
00: 20: 15.06 E assim, desta forma, entendemos muito bem como funciona o ciclo do cabelo, porque
00: 20: 23.28 uma vez que o ciclo do cabelo começa e continua, são essencialmente os progenitores de vida curta
00: 20: 30.26 que então fazem a maior parte da fabricação do tecido, neste caso, o cabelo em seu canal.
00: 20: 35.19 Portanto, os progenitores de vida curta têm vida curta.
00: 20: 38.10 Eventualmente, eles perdem sua capacidade proliferativa e sofrem apoptose e diferenciação.
00: 20: 46.02 E agora o sistema volta ao normal novamente, para reiniciar o ciclo do cabelo.
00: 20: 52.15 Então, o que é preciso para fazer um folículo piloso?
00: 20: 56.24 Falei sobre a importância do sinal Wnt, mas há muitos anos meu laboratório ativou
00: 21: 04.17 o sinal Wnt. na época nem sabíamos que era um sinal Wnt.
00: 21: 10.06 ativamos seu parceiro de interação conhecido como beta-catenina.
00: 21: 15.04 E quando ativamos a beta-catenina na pele do camundongo, o que obtivemos foi este camundongo super peludo,
00: 21: 20.11 em relação ao seu irmão próximo a ele.
00: 21: 24.03 Esses ratos acabaram produzindo muito mais folículos capilares do que o normal.
00: 21: 29.13 Inicialmente, ficamos muito animados com isso.
00: 21: 32.19 Mas a desvantagem disso é que esses ratos desenvolvem tumores com o tempo.
00: 21: 38.02 Obviamente, ainda não está pronto para o horário nobre.
00: 21: 41.24 Mas nos disse uma coisa muito importante, que a sinalização Wnt é importante em
00: 21: 47.06 ditando a esses progenitores não especificados que façam um folículo piloso, não que façam a epiderme.
00: 21: 54.14 Então, quando retiradas de seu nicho e cultivadas, as células-tronco verdes que você vê aqui,
00: 22: 01.05 do folículo piloso, acaba adquirindo plasticidade.
00: 22: 05.00 Podemos cultivar essas células-tronco da mesma forma que Howard Green cultivou células-tronco epidérmicas
00: 22: 11,03 muitos anos atrás.
00: 22: 13.01 E quando cultivamos essas células, podemos pegar uma colônia, ou um clone, derivado de um de
00: 22: 19.09 as células-tronco individuais, e podemos enxertá-las em um camundongo que não tem cabelo,
00: 22: 25.14 e aqueles ratos agora podem produzir cabelo.
00: 22: 28.06 Também produzem epiderme e glândulas sebáceas.
00: 22: 31.25 E isso é algo que eles normalmente não fazem.
00: 22: 35.01 Normalmente, eles só fazem cabelo.
00: 22: 38.14 Eles irão, no entanto, formar epiderme e glândulas sebáceas quando a pele for ferida,
00: 22: 44.25 e quando faltam a epiderme e as glândulas sebáceas.
00: 22: 47.16 Então, as células-tronco recebem sinais, neste caso. neste caso, sinais de ferida,
00: 22: 54.04 que estimulam essas células-tronco a fazerem cabelo, mas também a fazerem epiderme
00: 22: 59.21 e glândulas sebáceas, para repor os tecidos que faltavam
00: 23: 04.13 como consequência da ferida.
00: 23: 07.05 E quando você tira as células-tronco fora do contexto, fora do nicho do folículo capilar,
00: 23: 11.23 e você as coloca em cultura, agora as células-tronco meio que esquecem o que deveriam fazer
00: 23: 18.13 quando eles são enxertados de volta na pele.
00: 23: 20.20 E agora eles basicamente agem como se estivessem em um estado ferido, e efetivamente também farão
00: 23: 26.21 epiderme e glândulas sebáceas.
00: 23: 29.00 Chamamos este fenômeno de plasticidade das células-tronco, e é algo que vemos em
00: 23: 35.10 uma variedade de células-tronco diferentes. células-tronco de tecidos.
00: 23: 40.24 É um fenômeno que basicamente permite que um tecido receba, essencialmente, uma chamada de perigo
00: 23: 49.18 em uma ferida que informa às células-tronco próximas para serem capazes de reparar e repor o tecido
00: 23: 58.14 a todo custo e o mais rápido possível.
00: 24: 00.25 Então, são sempre as células-tronco mais próximas, então, da ferida que podem repará-la.
00: 24: 06.03 Infelizmente, essas células-tronco não farão automaticamente neurônios ou outros tecidos
00: 24: 13.05 do nosso corpo sem alguma manipulação.
00: 24: 15.27 Mas essas células-tronco irão, no entanto, produzir naturalmente não apenas folículos capilares, mas também epiderme
00: 24: 24.16 e glândulas sebáceas.
00: 24: 26.26 Então, nós estudamos essas células-tronco ao longo de muitos anos, agora.
00: 24: 33.16 E sabemos que essas células-tronco são definidas pelo seu perfil transcricional, efetivamente,
00: 24: 41.16 o padrão de expressão gênica que essas células-tronco fazem.
00: 24: 44.28 E sabemos muito sobre isso.
00: 24: 46.20 Sabemos que existem os fatores de transcrição em roxo, uma variedade de diferentes fatores de transcrição
00: 24: 52.19 que são feitas por essas células-tronco do folículo capilar e não por outras células-tronco,
00: 24: 59.03 pelo menos como uma coorte.
00: 25: 00.17 Sabemos que existem alguns fatores, como o LGR5, que são produzidos por várias células-tronco diferentes:
00: 25: 05.27 células-tronco epiteliais intestinais, células-tronco do folículo capilar e muitas outras
00: 25: 11.15 tipos de células-tronco.
00: 25: 12.28 Sabemos que as integrinas são uma característica de muitos tipos diferentes de células-tronco,
00: 25: 18.22 e são expressos em níveis muito elevados nas células-tronco do folículo piloso.
00: 25: 23.11 E então, para uma célula-tronco quiescente, os sinais de nicho basicamente produzem um perfil de expressão gênica
00: 25: 31.09 pelas células-tronco que refletem níveis reduzidos de sinalização Wnt e níveis reduzidos
00: 25: 37.04 de sinalização sonora de ouriço.
00: 25: 39.00 Essas são as pistas pró-ativação para as células-tronco.
00: 25: 42.08 Enquanto os sinais BMP e FGF18, as pistas inibitórias que dizem às células-tronco
00: 25: 48.19 para permanecer em quiescência, esses sinais são regulados positivamente.
00: 25: 53.13 E então a diferenciação, seja diferenciação pela epiderme ou pela glândula sebácea
00: 25: 58.27 ou o folículo piloso, todos esses programas são suprimidos pelas células-tronco.
00: 26: 04.13 Então, seu programa de transcrição reflete o comportamento dessas células-tronco.
00: 26: 11.10 Caracterizamos o programa de transcrição retirando as células-tronco diretamente do tecido,
00: 26: 17.28 usando classificação de células ativadas por fluorescência para purificar essas células,
00: 26: 21.26 e basicamente pegando esses RNAs e traçando o perfil deles diretamente.
00: 26: 26.24 Também usamos uma tecnologia conhecida como tecnologia knockout condicional para poder cortar
00: 26: 34.19 os fatores de transcrição da pele do animal.
00: 26: 39.06 Quando excisamos TCF3 e TCF4 - estas são proteínas de ligação ao DNA que também podem se ligar à beta-catenina,
00: 26: 46.15 que é um efetor Wnt downstream - descobrimos que a perda de TCF3 e 4 basicamente não existe mais.
00: 26: 53.19 as células-tronco não conseguem mais manter os quies. seus. sua atividade.
00: 26: 59.20 Aprendemos que a perda de Lhx2 é necessária para manter as células-tronco.
00: 27: 05.11 E da mesma forma, a perda de Sox9 é necessária para manter as células-tronco.
00: 27: 11.06 Surpreendentemente, quando eliminamos a beta-catenina, o que descobrimos não foi a produção de folículos capilares.
00: 27: 17.15 Então, sem sinalização Wnt não foram feitos folículos capilares.
00: 27: 21.28 Curiosamente, quando eliminamos TCF3 e 4, embora fosse necessário
00: 27: 27.20 para fazer um folículo capilar, o que descobrimos para manter as células-tronco dos folículos capilares. o que encontramos
00: 27: 32.23 é uma explosão de crescimento de cabelo.
00: 27: 35.02 Então, desta forma, aprendemos que TCF3 e 4 antagonizam o que a sinalização Wnt pode fazer,
00: 27: 41.10 e isso mantém as células-tronco em repouso, porque Wnt é tipicamente um fator associado à proliferação.
00: 27: 49.04 Lhx2, na ausência, basicamente produz, onde o nicho de células-tronco estava,
00: 27: 56.01 agora um nicho cheio de glândula sebácea.
00: 27: 58.05 Então, Lhx2 é necessário para reprimir o programa de diferenciação da glândula sebácea enquanto
00: 28: 06.12 as células-tronco são células-tronco em seu nicho nativo.
00: 28: 09.12 Sox9 reprime o programa de diferenciação de células-tronco epidérmicas.
00: 28: 14.26 E sem o Sox9, o nicho de células-tronco do folículo piloso se transforma em um cisto epidérmico.
00: 28: 19,28 Então, entendemos como esses diferentes fatores estão funcionando e como esses diferentes fatores de transcrição.
00: 28: 25.27 para que são necessários.
00: 28: 28.13 Então, vamos juntar tudo isso agora.
00: 28: 31.14 E vou dar um exemplo, e isso é da sinalização BMP, que eu disse que é importante
00: 28: 37.12 para controlar a quiescência das células-tronco.
00: 28: 40.23 Então, aprendemos, ao longo de nossos estudos, que a interação do BMP com
00: 28: 47.09 o receptor de BMP nas células-tronco é suficiente para ativar o fator de transcrição canônico
00: 28: 55.18 chamado fosfo-SMAD1, junto com fosfo. junto com SMAD4, que então controla, downstream,
00: 29: 02.03 um grupo de fatores de transcrição que mostrei aqui.
00: 29: 06.17 Juntos, esses fatores são necessários para controlar a quiescência das células-tronco.
00: 29: 13.11 Então, vimos o que acontece em um rato envelhecido.
00: 29: 18.11 E o que descobrimos foi que no primeiro ciclo do cabelo do rato, isso acontece relativamente rápido.
00: 29: 26.08 Apenas alguns dias separam o momento em que um folículo piloso completou seu ciclo
00: 29: 32.11 e o próximo ciclo do cabelo começa.
00: 29: 34.05 Mas agora, à medida que os animais envelhecem, há tempos cada vez mais longos entre o crescimento dos pelos
00: 29: 40.20 - ou quando o pelo do animal cresce - e quando o pelo, basicamente. quando as células-tronco
00: 29: 46.20 sente-se em silêncio.
00: 29: 48.05 Eles passam muito mais tempo sentados em repouso do que nos camundongos mais jovens.
00: 29: 54.23 E quando rastreamos isso, o que descobrimos é que a derme e a gordura velha,
00: 30: 01.26 ou o tecido adiposo antigo, desses camundongos mais velhos acabou por produzir níveis muito elevados de BMP.
00: 30: 08.15 E foi isso que manteve essas células-tronco em seu estado quiescente.
00: 30: 12.15 Podemos tratar os ratos velhos com um medicamento chamado VIVIT, que é um inibidor de Nfatc1,
00: 30: 21.14 um dos fatores de transcrição a jusante do sinal BMP.
00: 30: 25.23 E poderíamos crescer novamente. reativar as células-tronco do folículo capilar dormente para fazer
00h30: 32,05 uma nova rodada de crescimento do cabelo.
00: 30: 34.07 E então, neste momento em nossos estudos, o que aprendemos é que na verdade o número de células-tronco
00: 30: 39.16 ainda permanecem elevados no animal mais velho, mas é sua atividade que diminui com a idade.
00: 30: 46.10 Então, o grão de cabelo também é um fenômeno que. isso acontece com a idade.
00: 30: 53,26 E neste estudo, quais os outros, maio.
00: 30: 57.11 Mayumi Ito e seus colegas de trabalho, aprenderam foi que as células-tronco dos melanócitos e
00: 31: 04.21 as células-tronco do folículo piloso residem no mesmo nicho e respondem a sinais semelhantes.
00: 31: 09.24 E este também foi o trabalho de Emi Nishimura e seus colegas de trabalho no Japão.
00: 31: 17.19 E então as células-tronco do folículo piloso e dos melanócitos estão no mesmo nicho.
00: 31: 22.18 Eles respondem aos mesmos sinais.
00: 31: 25.02 E a importância disso é que as células-tronco do folículo piloso e as células-tronco dos melanócitos
00: 31: 32.18 será ativado ao mesmo tempo.
00: 31: 35.08 Eles vão se diferenciar para que as células melanócitas comecem a produzir pigmento,
00: 31: 42.06 e as células do folículo capilar começarão a produzir cabelo.
00: 31: 45.27 E nesse momento, os melanócitos diferenciados podem fornecer aquele pigmento para a diferenciação
00: 31: 53,00 células ciliadas.
00: 31: 54.04 E é isso que dá cor ao nosso cabelo.
00: 31: 57.03 E então, quando as células-tronco do folículo piloso são incapazes de produzir cabelo,
00: 32: 04.09 então também, normalmente, as células-tronco dos melanócitos acabam sendo incapazes de ser ativadas,
00: 32: 12.04 porque residem no mesmo nicho.
00: 32: 14.05 Então, um dos meus alunos de pós-graduação, Kenneth Lay, teve a brilhante ideia notável de que talvez
00: 32: 20.28 se ele simplesmente excluiu esses fatores de transcrição que são importantes no controle da quiescência
00: 32: 29.01 a jusante da via BMP, para que ele possa acelerar as diferenças, então,
00: 32: 34.20 que existem entre os ratos mais jovens e os ratos mais velhos
00: 32: 38.06 em relação ao comprimento do ciclo do cabelo.
00: 32: 41.21 Ele poderia reduzir o tempo que as células-tronco passam em quiescência?
00: 32: 47.23 E a resposta a essa experiência foi bastante notável.
00: 32: 51.09 E na verdade, agora, os ratos continuavam a criar cabelos.
00: 32: 54.21 Suas células-tronco eram quase constantemente ativadas.
00: 32: 58.11 Um novo cabelo cresceria, o processo passaria por seu ciclo, e então o ciclo iria
00: 33: 03.22 reinicie novamente, uma e outra e outra vez.
00: 33: 07.13 Então, isso foi muito emocionante para nós.
00: 33: 12.20 E começamos a nos perguntar se a inibição do BMP poderia ser a fonte da juventude
00: 33: 17.26 para o crescimento infinito do cabelo.
00: 33: 19.16 Bem, infelizmente na ciência, as coisas nem sempre são tão simples.
00: 33: 24.14 E o que aconteceu foi que os animais tornaram-se precocemente pardos, mais cedo do que os seus homólogos.
00: 33: 32.14 E descobriu-se que quando o fator de transcrição sofreu mutação, e faltou,
00: 33: 39.05 enquanto os fios de cabelo continuavam sendo arrancados, eventualmente o número de células-tronco diminuía.
00: 33: 45.03 E isso levou a um envelhecimento precoce e a um enfraquecimento precoce do cabelo.
00: 33: 52,07 Então, ainda não chegamos lá.
00: 33: 54.06 Mas temos algumas previsões.
00: 33: 56.15 E as previsões podem ser que a chave para a Fonte da Juventude no que diz respeito ao crescimento do cabelo
00: 34: 00.17 é um BMP bem equilibrado.
00: 34: 03.01 Claramente, acionando e ativando essas células-tronco continuamente. foi deletério
00: 34: 09.12 para a capacidade do rato de produzir cabelo indefinidamente.
00: 34: 14.21 Mas talvez com um equilíbrio moderando o número de ciclos do cabelo, pode-se ser capaz
00: 34: 21.14 para atingir o objetivo de ser capaz de estender a capacidade de. tempo que os indivíduos
00: 34: 27,27 poderiam deixar seu cabelo crescer.
00: 34: 29.17 Portanto, o BMP também desempenha um papel importante no desenvolvimento e desenvolvimento da pele.
00: 34: 37.08 E aqui ficamos fascinados pelo fato de que a derme instrui o destino do que
00: 34: 44.02 o botão epidérmico serviria.
00: 34: 46.06 Assim, no desenvolvimento embrionário, a pele começa como aquela única camada de epitélio e botões epidérmicos
00: 34: 54.09 começam a aparecer.
00: 34: 56.06 E esses botões podem se tornar uma glândula mamária, eles podem se tornar um botão de cabelo, eles podem se tornar
00: 35: 02.02 um botão de glândula sudorípara.
00: 35: 04.14 Depende do que a derme os instrui a fazer.
00: 35: 09.14 E assim, regionalmente, acabamos obtendo esses diferentes apêndices do epitélio,
00: 35: 17.26 gerado como consequência dos diferentes tipos de mesênquima ou derme. derme que temos.
00: 35: 23.10 Acontece que na maioria dos mamíferos há um sinal BMP chamado BMP5 que é
00: 35: 29,27 espetando regionalmente apenas na pele das patas dos animais.
00: 35: 33.00 E então o que acontece é que a maior parte da região do corpo dos animais tem pelos, e há
00: 35: 37.20 muito poucas glândulas sudoríparas.
00: 35: 39.02 Há apenas glândulas sudoríparas, ou glândulas sudoríparas écrinas, em suas patas.
00: 35: 43.04 E as glândulas sudoríparas écrinas são o que nos permite, o que permite ao nosso corpo, termorregular.
00: 35: 48.20 É o que nos permite ir lá e correr uma maratona enquanto suamos três litros de suor
00: 35: 54,18 ao fazê-lo.
00: 35: 56.04 Mas a maioria dos mamíferos não pode fazer isso, e eles não podem fazer porque têm pelos em vez de
00: 36: 02.17 glândulas sudoríparas sobre a superfície do corpo.
00: 36: 05.13 E então começamos a estudar esse processo.
00: 36: 09.07 E, como descobrimos, o BMP5 apresenta picos regionais na derme da pata.
00: 36: 15.22 Não se agarra na derme do corpo e, portanto, os animais recebem exclusivamente pelos.
00: 36: 21.11 Mas então quando olhamos para o desenvolvimento embrionário humano, o que descobrimos é que BMP5
00: 36: 28.22 parece estar desregulado de uma forma diferente em humanos do que mesmo em primatas superiores.
00: 36: 35.15 E, neste caso, BMP5 picos ampla e temporalmente na derme do corpo, de modo que
00: 36: 41.14 as primeiras ondas de desenvolvimento de botões epidérmicos estão formando cabelo em humanos,
00: 36: 50.08 mas depois a última onda, quando o BMP5 atinge o corpo, basicamente acabamos com cabelo.
00: 36: 57.04 recebendo glândulas sudoríparas sobre nosso corpo.
00: 36: 59.17 E é isso que nos dá essas propriedades maravilhosas para correr maratonas e
00: 37: 07.03 para suar e sobreviver em climas extremos em relação a outros. outros animais.
00: 37: 15.02 Então, o que mais podemos fazer com essas células adultas da pele?
00: 37: 19.26 Bem, na parte um da minha discussão, eu já falei sobre a capacidade de mudar o comportamento
00: 37: 29.05 de uma célula adulta da pele, e transformá-la em uma célula-tronco pluripotente induzida, pela atividade
00: 37: 37.28 de quatro fatores de transcrição que são produzidos por, ou expressos por, células-tronco embrionárias.
00: 37: 43.08 E essa foi uma mudança notável e um avanço notável porque nos permitiu, agora,
00: 37: 48.24 para ser capaz de cultivar neurônios, células beta pancreáticas, células cardíacas, etc. in vitro, começando com
00: 37: 56,20 células da pele.
00: 37: 58,23 Então, podemos reprogramar em etapas menores?
00: 38: 02.17 Bem, nossa capacidade de cultivar, por exemplo, células-tronco do folículo capilar.
00: 38: 07.22 agora sabemos que, se simplesmente desligarmos o LHX2, podemos fazer sebócitos em cultura.
00: 38: 13.25 Se desligarmos o fator de transcrição SOX9, podemos fazer epiderme em vez de cabelo.
00: 38: 21.10 E se desligarmos os fatores regulatórios para NFATc1 ou Foxc1, podemos basicamente interromper o tecido.
00: 38: 28.02 podemos. se os ligarmos, podemos interromper a regeneração do tecido.
00: 38: 33.24 Se os desligarmos, podemos favorecer a regeneração do tecido do folículo piloso e a regeneração do cabelo.
00: 38: 40.04 E, por fim, um aspecto interessante é que, se simplesmente dermos ao folículo piloso células-tronco
00: 38: 47.04 um fator regulador da transcrição chamado PAX, um tipo particular de fator de transcrição PAX,
00: 38: 52.07 então podemos instruir as células-tronco do folículo capilar para fazer milho.
00: 38: 56.18 para se tornarem células-tronco da córnea.
00: 38: 59.02 E quando você pensa sobre os casos em que os pacientes têm ambos os olhos cegos por alguma queimadura industrial,
00: 39: 05.05 então este tipo de reprogramação potencial em etapas menores pode oferecer o potencial
00: 39: 12,02 para terapia futura.
00: 39: 14.08 Então, eu gostaria de mudar, agora, para um problema de, o que quero dizer com ligar genes e
00: 39: 21.14 desligando genes?
00: 39: 23.18 E dois dos meus alunos de graduação, Rene Adam e Hanseul Yang, tinham o interesse de poder
00: 39: 31.04 para examinar a paisagem da cromatina, a paisagem da expressão gênica, do. do
00: 39: 40.03 células-tronco do folículo capilar.
00: 39: 41.26 E o que eles aprenderam com isso é que existem cerca de 350 genes que são expressos por
00: 39: 48.04 as células-tronco do folículo piloso, que são reguladas por potenciadores muito grandes
00: 39: 53.00 - Rick Young os cunhou "super potenciadores" -
00: 39: 57.22 que ligam todos os diferentes fatores de transcrição,
00: 40: 00.20, como mostramos, que são expressos pelas células-tronco do folículo piloso.
00: 40: 04,28 Então, Tcf3, Tcf4.
00: 40: 07.21 Falamos sobre Sox9.
00: 40: 09.06 Falamos sobre Lhx2 e Nfatc1.
00: 40: 12.20 E todos eles se ligam a trechos relativamente curtos de DNA que estão contidos nesses grandes
00: 40: 18,27 "super potenciadores".
00: 40: 21,09 Então, esses curtos. trechos curtos de DNA parecem ter. não apenas a ligação de
00: 40: 29.22 todos esses fatores de transcrição, mas eles também têm os motivos de sequência para os quais
00: 40: 35.06 esses fatores de transcrição se ligam.
00: 40: 38.00 Então, esses genes acabam sendo também os genes mais importantes na manutenção
00: 40: 45.26 as células-tronco do folículo piloso em seu estado quiescente e indiferenciado.
00: 40: 50.01 Se dermos uma olhada em alguns dos 350 genes, então, são esses genes especiais
00: 40: 55,27 regulados por super potenciadores, o que descobrimos é que eles incluem o gene Sox9, o gene Lhx2,
00: 41: 03.13 o gene Nfatc1 e o DNA. o gene BMP a jusante. ativadores de fator de transcrição.
00: 41: 12.11 Eles também incluem o inibidor de BMP e o receptor de BMP.
00: 41: 16.24 Eles incluem um inibidor Wnt, Dkk3, e o receptor Wnt, ou Frizzled.
00: 41: 22.17 Eles também incluem os genes integrinas que enfatizei como sendo importantes para a manutenção
00: 41: 28.22 células-tronco do folículo capilar.
00: 41: 30.23 Efetivamente, esta pequena lista de genes regulados por super potenciador contém todas as informações críticas
00: 41: 38.14 que é necessário para que esses genes possam ser essencialmente uma célula-tronco do folículo piloso.
00: 41: 45.21 Também aponto que muitos dos genes desta lista já foram associados
00: 41: 51.00 com doenças genéticas humanas do cabelo e da pele.
00: 41: 56.15 Então, o que eu disse é que existe um grupo mestre de fatores de transcrição para a pele
00: 42: 03.21 células-tronco, mas também acontece que há um grupo mestre de fatores de transcrição
00: 42: 08.04 para cada tipo de célula-tronco.
00: 42: 10.11 E são diferentes para diferentes tipos de células estaminais.
00: 42: 13.09 Então, os primeiros estudos que foram feitos foram em células estaminais embrionárias.
00: 42: 18.15 E Rick Young e seus colegas de trabalho mostraram que os super intensificadores são regulados por
00: 42: 24.09 os fatores de transcrição que são necessários para manter as células-tronco embrionárias.
00: 42: 30.13 O que acabei de mostrar é que, em uma célula-tronco de tecido adulto, a célula-tronco do folículo capilar,
00: 42: 36.02 que há uma coorte diferente de fatores de transcrição que são necessários para manter
00: 42: 41.00 essas células-tronco são células-tronco do folículo capilar.
00: 42: 44.11 Então, estamos começando a nos aprofundar no entendimento de quais são as diferenças entre embrionários e
00: 42: 49,26 células-tronco adultas?
00: 42: 51.26 Outro aspecto interessante é que todos esses fatores de transcrição são apenas expressos
00: 42: 58.03 como uma coorte em células-tronco do folículo capilar.
00: 43: 01.04 Então, você pode ver Tcf3, por exemplo, em células-tronco cerebrais.
00: 43: 05.17 Você verá Tcf4 em células-tronco intestinais, Lhx2 em células-tronco hematopoéticas,
00: 43: 10,20 Sox9 em células-tronco ósseas.
00: 43: 14.08 Mas o único lugar em que você os vê todos juntos em um só lugar no tempo é
00: 43: 17.25 as células-tronco do folículo piloso.
00: 43: 19.21 E acontece que podemos tirar vantagem disso.
00: 43: 22.15 Podemos pegar um desses elementos que contém os locais de ligação para todos esses
00: 43: 29.10 diferentes fatores de transcrição, e podemos usar isso para conduzir a expressão de uma proteína verde fluorescente
00: 43: 34,20 em ratos.
00: 43: 36.22 E agora, a proteína verde fluorescente é expressa apenas pelas células-tronco do folículo piloso
00: 43: 42.05 - muito mais especificidade do que jamais alcançamos simplesmente tomando um pedaço de cromatina ou
00: 43: 49,24 uma região promotora, uma região potenciadora, e usando isso para conduzir a expressão em camundongos.
00: 43: 56.09 Então, este tipo de informação é muito importante para os pesquisadores serem capazes de se aprofundar
00: 44: 02.23 a biologia das células-tronco, neste caso as células-tronco do folículo piloso.
00: 44: 08.05 Também estamos aprendendo que as células-tronco mudam seu programa de expressão gênica fora de seu nicho.
00: 44: 14.05 Já lhes mostrei que uma célula-tronco fora do seu nicho, quando enxertada de volta no.
00: 44: 19.18 para um animal, pode gerar folículos pilosos, epiderme e glândulas sebáceas.
00: 44: 24.25 Mas agora, se tomarmos um intensificador induzido por ferida, se caracterizarmos o estado de cromatina de
00: 44: 31.21 a célula-tronco enquanto está no ato de reparar uma ferida, e agora identifique esses elementos reguladores,
00: 44: 37.25 e usá-los para conduzir eGFP em um mouse. em um mouse, agora o que encontramos é que
00: 44: 45.00 na pele não ferida não há atividade.
00: 44: 48.14 E agora nós ferimos a pele, e a atividade começa.
00: 44: 52.00 Portanto, esses elementos regulatórios contêm as informações necessárias não apenas para
00: 44: 58.27 manter essa célula-tronco, mas, neste caso, para dizer à célula-tronco o que fazer e para mudar
00: 45: 04.16 seu programa de expressão gênica se for para reparar uma ferida versus se for apenas para substituir
00: 45: 10,27 uma célula que está morrendo no tecido.
00: 45: 14.00 Então, também estamos observando como a inflamação da pele provoca mudanças na expressão do gene nas células-tronco epidérmicas.
00: 45: 22.19 Então, quando as células-tronco recebem um ataque inflamatório, como elas respondem?
00: 45: 29.05 E o que aprendemos com nossos estudos é que eles respondem e ativam novos genes.
00: 45: 36.11 E, tomando os elementos reguladores desses genes, podemos usá-los para conduzir
00: 45: 42.01 a expressão de, neste caso, um gene repórter GFP.
00: 45: 45.13 Então, aqui geramos ratos que expressam esses elementos repórter específicos,
00: 45: 52.21, mas só o fazem quando a pele está sujeita a inflamação.
00: 45: 57,24 Portanto, na pele ingênua, não vemos nenhuma expressão da proteína eGFP.
00: 46: 05.03 Na presença de inflamação - se dermos à pele um ataque inflamatório -
00: 46: 09.26 agora vemos a ativação desses elementos potenciadores.
00: 46: 14,27 Portanto, chamamos esses elementos de sensores de inflamação.
00: 46: 18.03 E o que descobrimos é que existem cerca de 2.000 domínios de cromatina sensíveis à inflamação
00: 46: 23.17 que permanecem abertos nas células-tronco da pele muito depois que a inflamação foi resolvida.
00: 46: 30.20 Esses sensores rapidamente, então, são ativados novamente com. e ativar seus genes associados
00: 46: 37.20 quando a pele voltar a ver a inflamação.
00: 46: 40.19 E isso é uma propriedade notável, porque, basicamente, isso confere às células-tronco epidérmicas
00: 46: 47.03 uma memória, uma memória inflamatória, que já viu a inflamação antes.
00: 46: 52.28 E mesmo que o programa de expressão gênica seja normal em. Depois que a informação for resolvida,
00: 47: 00.01 existem esses domínios de cromatina aberta de memória oculta que basicamente permitem
00: 47: 05.24 os genes devem ser posicionados para que os genes possam ser ativados novamente e ativados mais rapidamente,
00: 47: 12,21 na próxima vez que ocorrer uma inflamação.
00: 47: 16,24 E por que achamos que isso é importante ou relevante?
00: 47: 20.17 A inflamação da pele provoca marcas na cromatina das células-tronco epidérmicas.
00: 47: 25.09 Lembre-se de que as células-tronco epidérmicas estão lá para o longo prazo.
00: 47: 28.05 Eles vêem a inflamação que permanecem em seu estado ativo, como células-tronco,
00: 47: 34.16 muito depois de a inflamação ter resolvido.
00: 47: 37,10 Mas eles têm aquela memória de que já viram a inflamação antes.
00: 47: 41,24 Essa memória reside na virtude das marcas epigenéticas.
00: 47: 47,26 E aqui estão alguns exemplos.
00: 47: 49.08 Existem colunas, agora, das marcas epigenéticas que são mostradas, neste caso. na cromatina de controle,
00: 47: 56.12 mostrado em cinza, não há marcas epigenéticas.
00: 48: 00.22 Agora, há inflamação, a pele experimenta inflamação e vemos duas marcas epigenéticas
00: 48: 08.16 aparecem: aqui neste gene à direita.
00: 48: 11.25 E agora, 30 dias depois, o que encontramos é que as marcas epigenéticas ainda estão lá.
00: 48: 19.02 E mesmo 6 meses depois, ainda há traços dessas marcas epigenéticas residindo dentro
00: 48: 26,15 estes. esta cromatina.
00: 48: 29.16 Assim, as células estaminais epidérmicas têm uma memória, alojada na cromatina, que viram
00: 48: 37,07 a inflamação antes.
00: 48: 39.10 E qual a importância disso?
00: 48: 40.21 Bem, vamos pensar sobre psoríase ou dermatite atópica ou infecções por dermatite de contato.
00: 48: 47,24 As infecções geralmente vêm e vão.
00: 48: 53.26 E quando eles voltam, eles geralmente voltam para os mesmos lugares.
00: 48: 58.26 Agora estamos começando a entender por que isso acontece, porque, efetivamente, as células-tronco epidérmicas
00: 49: 04.14 tem uma memória.
00: 49: 06.05 Eles já viram a inflamação antes, então, se virem de novo, respondem mais rápido
00: 49: 11,14 da próxima vez.
00: 49: 12.20 Então, o que eu disse a vocês é que as células-tronco adultas reabastecem as células mortas de um tecido,
00: 49: 19.10 e que reparam feridas.
00: 49: 20.27 Eu disse a você que eles residem em nichos cujo crosstalk dita seu comportamento.
00: 49: 26.15 Já disse que os principais genes das células estaminais são regulados por super potenciadores que ligam as células estaminais
00: 49: 32.13 fatores de transcrição, bem como fatores de transcrição que são induzidos pelo microambiente de nicho.
00: 49: 38,13 Para inflação. inflamação, por exemplo, pode ser um fosforilado,
00: 49: 43.11 versão ativa de STAT3, junto com os fatores de células-tronco epidérmicas.
00: 49: 48.24 Também lhes disse que a imunidade treinada, a memória da inflamação, não é um fenômeno
00: 49: 58.14 que é restrito ao sistema imunológico, mas ocorre na epiderme, e achamos provável
00: 50: 03.26 outras células-tronco epiteliais que suportam o impacto da inflamação.
00: 50: 09.05 Doença inflamatória intestinal, por exemplo, ou certos tipos de inflamação pulmonar.
00: 50: 14.12 De alguma forma, o tecido lembra que já viu a inflamação antes.
00: 50: 18.11 Portanto, para as células do sistema imunológico, a imunidade treinada aumenta a capacidade das células do sistema imunológico
00: 50: 26.04 para eliminar a infecção se a virem novamente.
00: 50: 29.13 Para células-tronco epidérmicas, a imunidade treinada aumenta sua capacidade de restaurar
00: 50: 34.22 a barreira da pele quando violada e para ajudar no recrutamento do sistema imunológico.
00: 50: 39.22 E lembre-se que a coisa mais importante que o epitélio da pele faz é
00: 50: 45.13 basicamente para produzir aquela barreira que mantém os micróbios nocivos do lado de fora e os fluidos corporais essenciais dentro.
00: 50: 51.24 E se estamos ferindo a pele, ou se acabamos com um hiper.
00: 50: 56.02 resposta hiperinflamatória, a barreira está em risco.
00: 51: 01.04 E o epitélio, as células estaminais epidérmicas, respondem tentando reparar essa barreira
00: 51: 06.16 o mais rápido possível.
00: 51: 08.06 Às vezes, eles não são muito eficazes nisso, e isso pode levar à cura de feridas crônicas
00: 51: 13,28 ou inflamação crônica.
00: 51: 15.25 E essas são, obviamente, áreas para as quais gostaríamos de ser capazes de adaptar a nossa compreensão
00: 51: 21.26 para fazer progressos no tratamento dessas doenças no futuro.


Reconhecimentos

Este artigo foi apoiado em parte pela National Nature Science Foundation da China (81121004, 81230041, 81372066, 81571909) e pelo National Basic Science and Development Program (973 Program, 2012CB518105).

Financiamento

Este artigo foi apoiado em parte pela National Nature Science Foundation da China (81121004, 81230041, 81372066, 81571909) e pelo National Basic Science and Development Program (973 Program, 2012CB518105).

Disponibilidade de dados e materiais

Contribuições dos autores

JX foi responsável pelo design e redação do manuscrito. BY e YH contribuíram em partes da redação. SH e XF foram responsáveis ​​pela concepção e revisão do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.


Aplicações de EPSCs

Danos graves que excedem a capacidade regenerativa da pele ameaçam todo o organismo e requerem métodos de tratamento eficazes. O tratamento das feridas deve ser duradouro, requer habilidades médicas específicas e constitui um grande desafio. EPSCs são considerados um alvo conveniente para uso no tratamento de feridas porque suas vantagens incluem acessibilidade, isolamento simples e capacidade regenerativa da pele. As células têm sido de interesse para a cicatrização de feridas desde a década de 1970. Uma série de estratégias terapêuticas já foram desenvolvidas, e algumas delas avançaram na arena clínica (Fig. 4) [100].

Usos potenciais de CEPs no tratamento de feridas na pele e regeneração de outros epitélios no corpo

Aplicação de EPSCs no tratamento de feridas

As células isoladas de biópsias de pele são propagadas e cultivadas em biomateriais, que são chamados de autoenxertos epidérmicos de cultura (CEAs). Os CEAs são derivados de culturas de células epidérmicas não purificadas que supostamente contêm EPSCs, que foram usados ​​pela primeira vez no tratamento de feridas em 1981 e estão disponíveis comercialmente desde 1988. O enriquecimento com EPSCs dentro do CEA tem sido usado para tratar feridas graves [101, 102]. Em comparação com os autoenxertos de pele convencionais, os CEAs não requerem uma segunda lesão de pele, que por si só pode estar sujeita a complicações como dor, infecção, cicatrização retardada e formação de cicatriz [103]. Assim, o couro cabeludo é uma fonte cutânea ideal, pois contém HFs em abundância, o que pode levar a uma melhor epitelização. Um produto autólogo comercialmente disponível gerado a partir de HFSCs, conhecido como EpiDex®, tem sido aplicado clinicamente desde 2004, que é ideal para feridas crônicas exibindo granulação, mas não para reepitelização. Ensaios clínicos de longo prazo relataram que EpiDex pode induzir a cicatrização completa de feridas em um período de vigilância de 9 meses [104]. Estudos demonstraram que quando os EPSCs são cultivados em cola de fibrina derivada de fibrinogênio, as feridas tratadas com esse sistema cicatrizam com contração mínima e mantêm excelente flexibilidade do tecido. Portanto, essa abordagem é viável para feridas sob tensões mecânicas intensas ou complexas, como dedos das mãos e dos pés e pálpebras [105]. Além disso, EPSCs cultivados na matriz de fibrinogênio podem formar uma camada de células estável, que é fácil de operar durante o transplante e exibe adesão à superfície da ferida. A combinação de EPSCs com aloenxertos também é possível, pois a camada superior de silício da aloderme pode ser removida e substituída por um CEA [102]. Outra abordagem é a preparação de suspensões de EPSCs autólogos, que podem ser pulverizados diretamente sobre as feridas [103]. Essas células são adequadas para feridas superficiais de tamanho pequeno a moderado e podem melhorar significativamente a cicatrização de feridas e reduzir a formação de cicatrizes. No entanto, este procedimento não é ideal para feridas grandes ou profundas. Além disso, a injeção subcutânea de EPSCs alogênicos também tem sido usada por nosso grupo de pesquisa, o que pode encurtar o período de cicatrização da ferida [106].

Além da abordagem tradicional de administração de SCs vivos diretamente em feridas, que foi relatado como tendo muitas limitações, incluindo baixa sobrevivência celular, alta taxa de atrito celular, dificuldades no direcionamento de tecido e dano adicional ao tecido, novas tendências surgiram nos últimos anos [ 107]. Uma vez que as SCs têm fortes capacidades parácrinas e secretam muitos fatores no meio, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e outras proteínas bioativas que são bem conhecidas como fatores de intensificação na cicatrização de feridas, aplicação do meio condicionado (cultura) (CM) de SCs foi confirmado para facilitar o processo de regeneração de tecidos [108]. Além disso, as vesículas extracelulares (EVs), como exossomos, podem ser isoladas de sobrenadantes cultivados de muitos tipos de SC e são promissoras como novas terapias contra o retardo da cicatrização de feridas [109]. Estudos demonstraram que exossomos derivados de SC podem promover a migração celular, angiogênese, proliferação e reepitelização por meio da ativação de algumas vias de sinalização, como STAT3, AKT, ERK e a via Wnt / β-catenina, resultando na expressão regulada positivamente de muitos fatores de crescimento [110]. Além disso, estudos in vivo também demonstraram que exossomos derivados de SCs não só podem acelerar o fechamento de feridas e a angiogênese, mas também são essenciais para o rejuvenescimento da pele e mostram aplicações potenciais no campo da regeneração da pele e cosméticos [111].

Uso de EPSCs na reparação de feridas cutâneas

Feridas de queimadura

Em queimaduras extensas, menos pele está disponível para enxertos de pele dividida e substitutos de pele são usados. Os substitutos cutâneos comerciais consistem em um componente de matriz usado com ou sem células. A natureza impermanente e a arquitetura de matriz simplista que carece de propriedades mecânicas adequadas são limitações dos substitutos da pele [112, 113]. Enquanto isso, a falha do enxerto CEA está associada ao baixo conteúdo EPSC. Assim, os transplantes de substitutos de pele e CEAs podem ser melhorados pelo enriquecimento de EPSCs, que podem formar uma epiderme de auto-renovação ideal e manter a capacidade de responder à sinalização local de uma forma espaço-temporal [114, 115]. Além disso, uma cultura de EPSCs em um leito de fibroblastos embutidos com uma matriz de plasma foi usada, o que permite a restauração dos compartimentos epidérmico e dérmico [116]. Além disso, dois estudos recentes com animais apontaram uma possível alternativa ao método tradicionalmente utilizado. A ativação de EPSCs da protuberância de HF em camundongos com queimaduras de terceiro grau induzidas com α-defensina-5 humana derivada do intestino acelerou a cicatrização de feridas e induziu importante regeneração do cabelo [117]. Da mesma forma, o transplante de EPSCs LGR6-positivos isolados por separação de células ativadas por fluorescência e administrados por injeção na ferida promoveu significativamente a reepitelização, o crescimento do cabelo e a angiogênese [118]. O desempenho clínico das EPSCs pode ser melhorado pelo uso de substratos portadores que mimetizam as propriedades mecânicas dos nichos, proporcionando um ambiente fisiológico normal que pode otimizar a função regenerativa das EPSCs.

Feridas crônicas

O número de pacientes com feridas crônicas, mesmo com feridas que não cicatrizam, aumentou com o aumento da prevalência de diabetes, obesidade e doenças vasculares e o envelhecimento da população. As estratégias terapêuticas comumente utilizadas são semelhantes às de queimaduras, como substitutos de pele e CEAs. No entanto, devido à complicada patogênese das feridas crônicas, muitos substitutos de pele e enxertos têm se mostrado inúteis [119]. A inflamação excessiva e a desregulação das metaloproteinases da matriz impedem a remodelação normal da ECM e a cicatrização de feridas. Além disso, feridas crônicas também levam ao comprometimento das populações locais de EPSC que se esgotam por meio de ciclos frequentes e da incapacidade de regenerar a epiderme devido a um microambiente hostil [120]. No entanto, este ciclo negativo pode ser quebrado quando feridas crônicas são transplantadas com CEAs enriquecidos com EPSCs em um substrato compatível com ECM, que pode superar simultaneamente a deficiência de EPSCs e fornecer componentes de ECM para estabilizar o local da ferida [5]. Além disso, uma epiderme funcional também foi regenerada em úlceras de pele previamente infectadas que não cicatrizaram por um número discreto de CEPs corrigidas por genes [121].

Outra regeneração epitelial

A produção de tecidos ou órgãos de substituição e construções biologicamente compatíveis é altamente justificada devido à escassez de órgãos de doadores. EPSCs autólogos exibem plasticidade, que pode se diferenciar em todas as três camadas germinativas embrionárias quando injetadas em blastocistos de camundongo [122]. Além disso, as EPSCs também expressam citoqueratina específica da córnea quando co-cultivadas com células da córnea ou ECM estromal específica do olho [123]. Portanto, EPSCs são considerados uma fonte ideal para a substituição de epitélios danificados.

Regeneração uretral

Os enxertos de pele tornaram-se um método alternativo para a regeneração uretral porque são adaptáveis ​​em um ambiente de exposição à urina. No entanto, o cabelo crescerá no lúmen uretral nos últimos anos após o transplante [123]. O epitélio uretral cultivado da bexiga é outra abordagem, mas é um procedimento invasivo e causa lesões adicionais. Assim, o emprego de CEAs enriquecidos com EPSCs foi considerado uma abordagem ideal para a restauração de uma uretra funcional, que não só fornece células epiteliais que não crescem cabelo, mas também podem ser colhidas facilmente sem danos secundários [124].

Deficiência de células-tronco límbicas (LSCD)

O LSCD é causado por dano ou perda de SCs limbais e freqüentemente leva à cegueira. Existem muitas semelhanças entre os epitélios da córnea e da pele, como uma morfologia epitelial estratificada típica e a expressão do marcador SC p63 [125]. Um estudo em animais indicou que os EPSCs da pele podem restaurar parcialmente ou mesmo totalmente uma córnea clara, e o epitélio da córnea reconstruído expressa os marcadores específicos do olho KRT3, KRT12 e caixa emparelhada (PAX) 6, mas não expressa KRT10 específico da pele [123 ] Além disso, os CEAs com modificação genética anterior, como o PAX6, podem restabelecer uma córnea transparente, mesmo após repetidas raspagens da córnea [126]. A pesquisa acima sugere que a plasticidade e capacidade regenerativa das EPSCs permitem a regeneração do epitélio em outros órgãos.

Vitiligo estável

O vitiligo é uma doença cutânea comum caracterizada pela perda de melanócitos. O enxerto de pele dividida é uma abordagem terapêutica comum que geralmente resulta em uma superfície da pele com caroços e nem sempre melhora a pigmentação. O CEA combinado com ou sem melanócitos tem sido usado em ensaios clínicos. Quando o CEA e um número fisiologicamente relevante de melanócitos são transplantados, eles se integram bem com a pele existente, a combinação de cores é boa e a cicatrização ocorre sem cicatrizes [127]. Além disso, a repigmentação de lesões acromáticas é alcançada em 50–90% dos casos após a aplicação de CEA sem melanócitos seguida de exposição à luz solar [128].

Terapia gênica da epidermólise bolhosa

A epidermólise bolhosa é uma doença cutânea grave causada por mutações genéticas, como a laminina 5 ou o déficit de colágeno 7 [129]. A terapia gênica consiste em extrair EPSCs de pacientes com anormalidades genéticas, corrigindo a mutação in vitro por transferência gênica e transplantando as células de volta para a pele do paciente [130]. Estudos clínicos demonstraram que a laminina-5 funcional pode ser detectada em pacientes, juntamente com uma epiderme aderente normal nas áreas transplantadas [131], sugerindo que a terapia gênica usando EPSCs é uma estratégia terapêutica promissora em doenças genéticas.

Estratégias para melhorar o potencial biológico de EPSCs

O modo tradicional de entrega de células em feridas, incluindo aplicações tópicas de EPSC, injeções diretas e entrega sistêmica na circulação, tem muitas limitações, como baixa sobrevivência, alta taxa de atrito, dano adicional ao tecido e falta de fixação célula-ECM [132] . Assim, a estratégia de entrega de células-tronco baseada em bioscaffold ganhou atenção considerável nesta estratégia, as células são semeadas em uma matriz (como hidrogel, andaime, substituto dérmico) primeiro e a matriz contendo células-tronco é então aplicada à ferida [107 ] Os andaimes baseados em polímero mostram alta bioatividade, biocompatibilidade e biodegradabilidade [133], que podem ser fabricados usando polímeros naturais (por exemplo, hialuronano, quitosano e alginato, colágeno, elastina, fibrina e seda [134]) e polímeros sintéticos (por exemplo, ácido poli (láctico-co-glicólico), polianidridos, polietilenoglicol) ou peptídeos geneticamente modificados [135, 136]. Recentemente, as modificações dos andaimes clássicos, como a adição de proteínas naturais (laminina, fibrina, glicosaminoglicano) ou nanopartículas de prata ao curativo celular, mostraram melhorar ainda mais a cicatrização de feridas, promovendo a atividade biológica das células-tronco [137, 138]. Recentemente, folhas de células epidérmicas cultivadas (CES) foram usadas para tratar pacientes com lesões de pele [139] e estudos sugerem que o enriquecimento para EPSCs dentro de CES pode melhorar ainda mais a cicatrização de feridas, prevenir a formação de cicatriz hipertrófica e fornecer regeneração de longo prazo [140 , 141]. Além disso, a bioimpressão 3D é uma tecnologia emergente que pode gerar produtos de pele compostos personalizados [142]. Ao imitar as estruturas da pele, este método fornece uma arquitetura de nicho microambiental para a manutenção e crescimento de células-tronco [143]. Assim, a pele impressa em 3D é um andaime ideal para EPSCs.

Uma vez que EPSCs têm potencial para regenerar a pele, a modificação genética de EPSCs representa uma nova opção de tratamento. Estudos relataram que a transdução de EPCs com o gene da subunidade β3 da laminina (LAMB3) de um paciente que sofre de epidermólise bolhosa juncional levou à conclusão bem-sucedida da regeneração epidérmica [121]. Nosso grupo de pesquisa também descobriu que EPSCs modificados com fator de crescimento epidérmico (EGF) ou Caveolin-1 mostraram maior capacidade de promover reepitelização, proliferação de fibroblastos e cicatrização de feridas [144]. Além disso, o pré-tratamento de EPSCs com curcumina não só promoveu a capacidade proliferativa de EPSCs, mas também aumentou a capacidade do meio condicionado de EPSCs tratados com curcumina para acelerar o fechamento da ferida [145].

Outra tendência da medicina regenerativa é a utilização de secretomas de células-tronco em vez das próprias células, o que resolve alguns problemas técnicos, como tumorigenicidade, imunogenicidade celular e transmissão de infecções. Por exemplo, exossomos derivados de MSC afetam positivamente a cicatrização de feridas, promovendo a angiogênese, a migração celular, a proliferação e o processo de reepitelização [146]. Como produtos de células-tronco pluripotentes, os exossomos derivados de EPSC são altamente promissores como uma nova terapia contra lesões de pele.


Resultados

As células clonogênicas que expressam Tp63 a partir de epitélios não pilosos têm capacidade de formação de pele

Nós examinamos sistematicamente a capacidade de formação de pele de células epiteliais cultivadas isoladas de epitélios simples, transicionais e estratificados de roedores adultos usando poderosos ensaios morfogenéticos de pele 21 (Fig. 1a). Biópsias de tecido da almofada plantar, mucosa oral, esôfago, vagina, traqueia, bexiga (cúpula e trígono) e próstata foram obtidas de ratos GFP (EGFP) de 6 meses de idade (rato verde SD-Tg (CAG-EGFP) 4 Osb) com exceção das células-tronco intestinais, que foram isoladas de DsRed + de 3 semanas de idade (B6.Cg-Tg (CAG-DsRed * MST) 1Nagy / J) e Lgr5-EGFP (B6.129P2-Lgr5 tm1 (cre / ERT2) Cle / J) ratos. As células de rato foram então cultivadas em uma camada de alimentação irradiada letalmente de células 3T3-J2 sob as condições estritas usadas para a medicina regenerativa da epiderme humana 24,25, enquanto as células-tronco duodenais de camundongos DsRed + foram cultivadas de acordo com Sato et al. 26 (Fig. 1a complementar). Estas experiências confirmaram que todos os epitélios positivos para Tp63 (Tabela 1 suplementar) continham uma população de células epiteliais clonogénicas que podiam ser cultivadas em série 27 (Fig. 1b, Fig. 2a, b suplementar). É importante ressaltar que as células de multiplicação obtidas nessas culturas, independentemente do seu tecido de origem, expressaram isoformas ∆Np63 (Fig. 1c, Fig. 3a Complementar), cuja expressão é crítica para a manutenção de células-tronco epidérmicas in vivo 4,6. Além disso, a expressão dessas isoformas é considerada um importante indicador da presença de células-tronco em cultura de enxertos de epitélio para medicina regenerativa ex vivo 25,28. Além disso, a maioria das células cultivadas tinha um cariótipo diplóide normal de rato, mesmo que algumas células aneuplóides pudessem ser observadas. Como esperado, as células-tronco negativas para Tp63 do duodeno 29 não podem crescer sob um microambiente projetado para a epiderme, mas podem se expandir para formar mini-intestinos sob condições de cultura apropriadas 26 (Fig. 1a suplementar). Em seguida, investigamos o comportamento dessas diferentes células clonogênicas em um poderoso ensaio de xenotransplante no qual as células cultivadas foram expostas a pistas morfogenéticas presentes na pele em desenvolvimento de um camundongo recém-nascido. Usando este ensaio junto com transplantes em série, demonstramos anteriormente que a progênie cultivada de uma única célula-tronco do folículo piloso multipotente pode contribuir para a formação de folículos capilares funcionais e glândulas sebáceas por anos 21. Neste estudo, foram realizados 156 transplantes. Como previsto, células-tronco cultivadas de ectoderma (por exemplo, cavidade oral, almofada plantar, glândulas sudoríparas, alça cervical do incisivo em desenvolvimento) e epitélios escamosos estratificados não relacionados à pele de outra origem embrionária (por exemplo, da vagina e esôfago, respectivamente, do mesoderma e origem da endoderme) bem integrada na pelagem em desenvolvimento do camundongo e contribuiu para a epiderme, folículos capilares funcionais e glândulas sebáceas por meses (Fig. 3b, c suplementar). Surpreendentemente, as células que expressam Tp63 cultivadas a partir do epitélio transicional da bexiga (seja da cúpula ou trígono) e do epitélio glandular da próstata, ambos de origem endodérmica, se integraram muito bem na pelagem em desenvolvimento do camundongo e contribuíram para a formação da epiderme, folículos pilosos e glândulas sebáceas por meses (Fig. 1d, Fig. 3b-e suplementar). Em seguida, examinamos o comportamento das células-tronco isoladas do intestino (epitélio simples de origem endodérmica). Como esperado, as células-tronco do intestino classificadas com DsRed e Lgr5-EGFP não cultivadas foram incapazes de se integrar na pele em desenvolvimento e desaparecer rapidamente do transplante (Fig. 1a, b suplementar). Como as células aneuploides estavam presentes em algumas das culturas primárias, isolamos células individuais individuais e expandimos os clones. Os clones aneuplóides foram então selecionados e transplantados. Nenhum dos clones aneuplóides de EGFP sobreviveu mais do que alguns dias após o transplante e nunca enxertados permanentemente (Fig. 4a, b suplementar), uma situação que lembra muito a falta de enxerto de queratinócitos humanos aneuplóides clonados 30. Essas observações indicaram fortemente que apenas células-tronco epiteliais diplóides normais poderiam enxertar permanentemente in vivo 31, uma noção de suma importância para uma terapia segura com células-tronco. As células de rato EGFP foram então recuperadas dos xenotransplantes e cultivadas novamente como descrito acima. É importante ressaltar que essas células continuaram expressando isoformas ∆Np63 quando examinadas por imunocitoquímica e PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) (Fig. 1e). As análises de cariótipo e hibridização in situ de fluorescência (FISH) revelaram que as células EGFP recuperadas tinham uma contagem normal de cromossomos de rato (n = 42) e não se fundiu com as células epidérmicas dos camundongos receptores (Suplementar Fig. 4c). As células de rato EGFP recuperadas foram então cultivadas em série antes de serem novamente transplantadas na pele de rato recém-nascido. As células de rato EGFP transplantadas contribuíram pela segunda vez para a renovação do folículo capilar a longo prazo da pelagem de camundongo (Fig. 1d, Fig. 3b suplementar). A porcentagem de xenotransplantes bem-sucedidos variou de 12,25-100% (os melhores desempenhos são a bexiga, as glândulas sudoríparas, a cavidade oral e o esôfago) em comparação com 75% para as células-tronco do folículo capilar genuínas (detalhes na Fig. Suplementar 3b) . Para nossa surpresa, o epitélio traqueal derivado do endoderma, classificado como pseudoestratificado, destacou-se entre todos os epitélios que expressam Tp63 que examinamos. Conforme relatado anteriormente, a traqueia continha uma população de células clonogênicas que poderiam crescer por muitas passagens em uma camada de alimentação de células 3T3-J2 (Fig. 2a suplementar). Essas células clonogênicas expressaram as isoformas do fator de transcrição ∆Np63 (Fig. 1e), Nkx2-1, CK-5/14 como relatado anteriormente 32,33, mas não expressou Involucrin (IVL) e LEKTI, marcadores de diferenciação terminal escamosa (Fig. Suplementar 5a). Quando transplantadas, as células epiteliais traqueais nunca contribuíram para a formação de folículos capilares ou glândulas sebáceas (n = 8 e 17 para o 1º e 2º transplantes, respectivamente), mas formaram um epitélio escamoso semelhante à epiderme, achado também observado na segunda rodada de transplantes (Fig. 1d). Este epitélio escamoso estratificado continha células basais Ki67-positivas e podia renovar-se por meses. Além disso, expressou alguns (Loricrin e LEKTI), mas não todos os marcadores clássicos de diferenciação escamosa (por exemplo, IVL e Filagrina) (Fig. Suplementar 5b). Esses resultados lembram metaplasia escamosa, uma condição pré-neoplásica em que um epitélio repetidamente exposto ao estresse torna-se escamoso e estratificado para se assemelhar à epiderme 34. A morfologia e a organização da camada dos folículos pilosos e glândulas sebáceas geradas a partir de células epiteliais não peludas que expressam Tp63 transplantadas eram indistinguíveis dos folículos pilosos normais ou glândulas sebáceas (Figs. 1d e 2a). Em seguida, avaliamos a expressão de vários fatores de transcrição importantes para o desenvolvimento e diferenciação do folículo capilar, ou seja, Lhx2, Foxn1, Gata3, Hr, e Lef1 12,13,14 em células isoladas de coxim plantar, mucosa oral, esôfago, vagina, timo, traqueia e células da bexiga recuperadas vários meses após seu transplante e contribuição para a pele murina. A expressão desses fatores de transcrição foi regulada positivamente em todas as células recuperadas, com exceção da traqueia, na qual a expressão de Lhx2, Gata3, e Hora permaneceu baixo (Fig. 2b). Também descobrimos que as células traqueais transplantadas só podiam regular positivamente as redes de genes associadas à diferenciação escamosa de acordo com seu comportamento no momento do transplante. Em seguida, investigamos a expressão de SOX9, LHX2, CK-15 e CK-31 em folículos capilares gerados por células da bexiga e próstata EGFP por imunocitoquímica. Essas proteínas, ligadas ao nicho de células-tronco do folículo piloso e à diferenciação do folículo piloso 35,36,37 foram expressas no local certo 103 e 238 dias após o transplante (Fig. 2c, Fig. Suplementar 3e), demonstrando que as células da bexiga eram capazes para ativar um programa de transcrição relacionado ao desenvolvimento do folículo piloso em resposta a um microambiente de pele cabeluda. Ao todo, nossos experimentos demonstraram inequivocamente que células-tronco clonogênicas adultas que expressam Tp63, independentemente de sua origem embrionária, tinham capacidade de formação de pele quando expostas a sinais ambientais adequados e que eram capazes de se comportar como células-tronco de folículo capilar multipotentes genuínas, pois contribuíam a todas as linhagens do folículo piloso e das glândulas sebáceas e à renovação do folículo piloso em muitos ciclos capilares.

uma Representação esquemática da estratégia experimental. Várias células epiteliais foram obtidas de ratos EGFP, cultivadas e transplantadas em série na pele de camundongos recém-nascidos do tipo selvagem. Um experimento típico, da biópsia inicial ao final do segundo transplante, geralmente durava mais de um ano. b Aparência típica de colônias iniciadas por células epiteliais do esôfago (10 experimentos independentes). Esquerda: aparência de contraste de fase de uma barra de colônia em crescimento progressivo com 7 dias de idade: 100 μm. À direita: aparência de colônias coradas com Rodamina B com 10 dias de idade (vermelho). c Imunocoloração mostrando que células epiteliais clonogênicas cultivadas de bigode, bexiga e traqueia expressaram ∆Np63 (coloração nuclear vermelha). Os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342. d Transplante em série de células-tronco epiteliais que expressam Tp63 do bigode, bexiga e traqueia para a pele de camundongos recém-nascidos do tipo selvagem 34 camundongos foram transplantados na primeira rodada de transplante, dos quais 21 exibiram um transplante de EGFP de longo prazo 23 camundongos foram transplantados em a segunda rodada de transplante, dos quais 12 exibiram um transplante de EGFP de longo prazo. Microfotografias representativas mostrando que as células EGFP transplantadas do bigode e da bexiga formaram epiderme, folículos capilares e glândulas sebáceas, enquanto as células traqueais formaram apenas um epitélio semelhante à epiderme. A expressão de EGFP nas células transplantadas foi revelada por imunohistoquímica. Primeiro transplante: painéis superior e médio Painel superior: bigode: 236 dias de transplante bexiga (cúpula): 238 dias de transplante traqueia: 122 dias de transplante. Painel do meio: grande aumento mostrando que as células EGFP contribuíram para as camadas diferenciadas da epiderme e dos folículos capilares. Bigode: 100 dias de transplante de bexiga (cúpula e trígono): 238 dias de transplante de traqueia: 122 dias de transplante. Segundo transplante: painel inferior Bigode: 117 dias de transplante de bexiga (trígono): dia 84 de transplante de traqueia: transplante de 100 dias de idade. Os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342 barras: 100 μm. e Gráfico de pontos mostrando a expressão das isoformas Tp63, ΔNp63 e TAp63 determinadas por análise de qPCR antes e após a 1ª rodada de transplante. Os resultados de ΔCt foram normalizados contra genes de manutenção (TBP, SDHA, e Tubb) Média de 3-9 repetições técnicas com dados individuais representados por círculos vazios.

uma Aparência microscópica de um bulbo do folículo piloso (esquerda) e de uma glândula sebácea (direita) gerada por células epiteliais cultivadas na bexiga de um rato EGFP e transplantadas em um microambiente de pele de camundongo recém-nascido (103 e 238 dias após o transplante, respectivamente), n = 3 ratos. A expressão de EGFP (verde) foi revelada por imuno-histoquímica, os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342. Observe que as células EGFP transplantadas contribuíram para todas as linhagens diferenciadas do folículo piloso e das barras das glândulas sebáceas: 100 μm. b Expressão de vários fatores de transcrição importantes para a diferenciação do folículo piloso, conforme determinado pela análise qPCR. Os resultados de ΔCt foram normalizados contra genes de manutenção (TBP, SDHA, e Tubb) Média de 3-9 repetições técnicas com dados individuais representados por círculos vazios. c As células epiteliais da bexiga EGFP-transplantadas expressaram SOX9, LHX2, citoqueratina-15 (CK-15) e citoqueratina-31 (CK-31) no local adequado nos folículos capilares. Para cada marcador, n = 3 experimentos. Folículos capilares e glândulas sebáceas gerados a partir de células-tronco epiteliais multipotentes cultivadas a partir de um folículo de bigode foram usados ​​como controle. SOX9 (vermelho): bigode: dia 103 após o transplante, bexiga: dia 103 LHX2 (vermelho): bigode: dia 238, bexiga: dia 236 CK-15 (vermelho): bigode: dia 103, bexiga: dia 238 CK-31 ( vermelho): bigode: dia 236, bexiga: dia 103. A expressão de EGFP (verde) foi revelada por imunohistoquímica, os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342. Barras: 100 μm.

Análises genéticas

Em seguida, realizamos uma análise de microarray nas células da mucosa oral, almofada plantar, vagina, traquéia, esôfago, timo e folículo do bigode antes e depois de seu transplante em um microambiente de pele de recém-nascido. Todas as células foram cultivadas em paralelo e em duplicado antes de serem classificadas na expressão de EGFP e o RNA total extraído. A análise quantitativa da expressão de RNA foi então realizada usando o Affymetrix GeneChip Rat Expression Array 230 2.0 (31.042 conjuntos de sondas em nível de gene) ou Rat Gene ST 1.0 Array (27.342 conjuntos de sondas em nível de gene). Os resultados da análise do timo que foi usada para comparação foram publicados anteriormente e depositados no banco de dados público do NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) (registro da série GSE21686) 18 (Fig Suplementar . 6a – d). A expressão gênica global nos diferentes tecidos foi comparada com a do folículo piloso e uma lista de genes que foram significativamente regulados para cima ou para baixo foi estabelecida (fold-change & gt2 p valor & lt 0,05) (Dados Suplementares 1). Apenas 43 genes foram identificados como comuns à mucosa oral, almofada plantar, vagina, traqueia, esôfago e células tímicas quando comparados às células foliculares dos bigodes na 1ª rodada de cultura antes do transplante (Tabela Suplementar 3), quando apenas quatro genes (Chst11, Itgb8, Lrat, Rassf4) permaneceram comuns na 2ª rodada de cultura, quando as células foram isoladas dos enxertos. Como esperado, Lhx2 e Gata3 a expressão foi menor em células de tecidos de células não pilosas antes do transplante. Em contraste, Ptges e Ptgs1, ambos implicados na sinalização da prostaglandina, foram significativamente mais expressos nas células na 1ª rodada de cultura. Essa observação é particularmente interessante porque as prostaglandinas interagem com a sinalização Wnt 38, uma via crítica para o desenvolvimento do folículo piloso 12, e também porque são conhecidas por inibir a neogênese do folículo piloso induzida por feridas 39. Em conjunto, nossos resultados fornecem uma possível explicação para o motivo pelo qual a formação de folículos capilares é reprimida em células que expressam Tp63 não cabeludas de origem em tecido não cabeludo. Como o epitélio da bexiga não foi incluído em nossa análise de microarray original, realizamos uma análise de RNA-Seq na bexiga (cúpula), traqueia, vagina, tímico e células epiteliais que expressam Tp63 do folículo do bigode cultivadas antes e após seu transplante em um recém-nascido microambiente da pele. As células epiteliais do timo (PRP04MOThy1 e recuperado PRP04MOThy1 # 907) eram de nosso estoque congelado 18. Todas as células foram cultivadas em paralelo antes de serem classificadas na expressão de EGFP e o RNA total extraído. A análise de componentes principais (PCA) e o agrupamento hierárquico indicaram claramente uma mudança na expressão gênica em direção ao folículo capilar para a exceção da traqueia após as células terem sido recuperadas meses após o transplante (Fig. 3a, b). Devido à maior sensibilidade do RNA-Seq, mais genes (1182 e 629, respectivamente) foram identificados como comuns entre a bexiga (cúpula), traquéia, vagina e timo quando comparados ao folículo de bigode (genes regulados para cima e para baixo, vezes alterar & gt2, ajustado p valor & lt 0,05) (Fig. 3c, listado nos Dados Suplementares 2 e 3). A significância da sobreposição de genes entre as comparações foi testada aos pares usando a distribuição hipergeométrica (função phyper em R) e foi próxima de zero em todos os casos, indicando que as sobreposições observadas foram significativamente maiores do que o esperado ao acaso. Os resultados do teste hipergeométrico são fornecidos nas Tabelas Suplementares 4 e 5. Embora nossos experimentos não tenham identificado formalmente as vias de sinalização envolvidas na anulação da restrição de linhagem em células que expressam Tp63 não cabeludas, nossa análise transcricional global e análise qPCR de Wnt5a, Wnt3, Wnt3a, Wnt10a, Dkk1, e Dkk3 expressão fortemente apontada para as vias Wnt / β-catenina / Lef-1 e Notch (Fig. 3d, e). Isso não é surpreendente, pois há evidências compiladas de que a via de sinalização Wnt / β-catenina / Lef-1 é determinante para a morfogênese do folículo capilar 40,41 e neogênese do folículo capilar 19, e para a formação de folículos capilares na córnea de camundongos deficientes para DKK2 16. Além disso, também há evidências de que uma via Notch 1 deficiente favorece a conversão do epitélio corneano em epiderme em camundongos 17.

Uma análise de RNA-Seq foi realizada em células-tronco epiteliais cultivadas de folículo piloso de bigode (WH), vagina (Va), timo (Thy), bexiga (cúpula) (BL) e traqueia (Tr) antes de serem transplantadas em um recém-nascido microambiente de pele de camundongo (1ª rodada) e depois de recuperados dos transplantes (2ª rodada recuperada). As células foram classificadas por FACS na expressão de EGFP antes de o RNA total ser extraído. uma Análise de componentes principais (PCA) dos transcriptomas completos. b Análise de agrupamento de expressões. c Diagrama de Venn mostrando o número de genes regulados para cima e para baixo, fold-change & gt2, ajustado p valor & lt 0,05 para cada tecido em comparação com o folículo capilar ajustado p valor & lt 0,05. d Mapa de calor para a expressão de alguns genes representativos de diferentes vias importantes para o desenvolvimento e sinalização do folículo piloso. e Gráfico de pontos mostrando a expressão de vários genes das vias de sinalização Wnt e Notch em células epiteliais cultivadas antes e após o transplante (1ª e 2ª rodadas de cultura), determinado por análise de qPCR. Genes domésticos foram usados ​​como normalizadores (TBP, SDHA, e Tubb) Média de 3-9 repetições técnicas com dados individuais representados por círculos vazios. Rec: células recuperadas, 2ª rodada de cultura.

Os epitélios escamosos têm capacidade intrínseca de formação de pele

Para investigar se a capacidade de formação de pele de epitélios não cutâneos observada em nossos experimentos anteriores foi adquirida por meio de cultura de células, pequenas biópsias de tecidos revestidos por escamosos (por exemplo, conjuntiva, córnea, almofada plantar, esôfago), pseudoestratificado (traqueia), transicional ( bexiga), e epitélios simples (intestino) foram obtidos de camundongos Rosa26 adultos (B6129S-Gt (ROSA) 26Sor/ J). Essas biópsias foram então transplantadas juntamente com minúsculos pedaços de carvão diretamente na pele dorsal de camundongos recém-nascidos, na época em que os folículos pilosos ainda estavam em formação 20. Após 4 dias, os filhotes foram mortos e a zona da pele contendo um transplante, identificada pela presença de carvão, foi cuidadosamente dissecada e enxertada in toto no dorso de camundongos atímicos individuais (Fig. 4a). Os transplantes foram colhidos após algumas semanas e examinados quanto à presença de células β-galactosidase-positivas em folículos capilares, epiderme e glândulas sebáceas. Realizamos mais de 200 transplantes, cujos resultados estão resumidos na Tabela Suplementar 6. Em primeiro lugar, demonstramos que as células da córnea foram capazes de formar epiderme, folículos capilares e glândulas sebáceas, confirmando resultados anteriores obtidos por recombinação de curto prazo de uma córnea central adulta epitélio de coelho com derme embrionária de camundongo 15. Mais importante ainda, as células epiteliais da córnea contribuíram para a formação de um novo germe capilar durante o ciclo capilar, demonstrando assim que se comportavam como células-tronco multipotentes genuínas do folículo piloso (Fig. 4b). Curiosamente, células mesenquimais da córnea positivas para β-galactosidase (ceratócitos) nunca foram observadas após o transplante e a papila dérmica era sempre do camundongo receptor (Fig. 4b). Em segundo lugar, demonstramos que todos os epitélios escamosos, isolados de quaisquer tecidos, independentemente de sua origem embrionária, se comportaram de forma semelhante e formaram folículos pilosos, epiderme e glândulas sebáceas. No entanto, a traqueia, a bexiga e o timo não responderam aos sinais morfogenéticos da pele nem o intestino (Fig. 4b, Tabela complementar 6). Embora uma questão técnica não pudesse ser descartada formalmente como uma razão para a falta de resposta do último epitélio, nossos resultados apoiaram fortemente a noção de que as células-tronco de epitélios escamosos têm uma competência natural para responder aos sinais morfogenéticos da pele. Esses dados poderiam explicar por que folículos capilares aberrantes e cistos dermóides são mais observados em tecidos revestidos por epitélio escamoso (Tabela complementar 2).

uma Representação esquemática de um experimento para determinar a capacidade de formação de cabelo de um tecido epitelial não piloso. Um total de 204 camundongos foram transplantados com vários tecidos epiteliais que expressam β-galactosidase. Para cada tecido, o número de camundongos transplantados e o número de transplantes positivos são dados na Tabela Suplementar 6. b Aparência microscópica dos diferentes tecidos antes do transplante e após o transplante em um microambiente de pele de camundongo do tipo selvagem recém-nascido. Tecido de doador que expressa β-galactosidase: coloração azul de X-gal tecido receptor de camundongo recém-nascido: vermelho nuclear rápido rosa. A seta aponta para um fio de cabelo em um folículo capilar gerado na córnea; a presença de um fio de cabelo indica que o folículo capilar foi ciclado. A estrela mostra uma papila folicular rosa, indicando que se originou do mesênquima da pele do camundongo receptor. Barras: 100 μm.

As células epiteliais que expressam Tp63 transplantadas têm uma memória de sua origem

O transplante de células epiteliais autólogas-tronco / progenitoras cultivadas da mucosa oral humana para reparar deficiências corneanas invalidantes aborda a questão fundamental da memória, transdiferenciação e plasticidade das células-tronco 42,43. Nossa análise transcricional também sugere que células-tronco que expressam Tp63 de tecidos não pilosos podem ser facilmente diferenciadas de células-tronco multipotentes de folículos capilares cultivados pela expressão de fatores de transcrição específicos. Por exemplo, Nkx2-1 foi expresso em células traqueais, Foxa1 nas células da bexiga e Foxg1 em células epiteliais tímicas, mas não em células-tronco multipotentes do folículo piloso. Esses fatores de transcrição permaneceram expressos nas células recuperadas após o transplante de pele, identificando as células recuperadas como não originárias do folículo piloso (Fig. 5a). Nesse sentido, a expressão de Foxg1 foi particularmente informativo, pois era absolutamente específico para células epiteliais do timo, ao contrário de Foxn1 que foi expresso em muitas outras células-tronco que expressam Tp63, incluindo células-tronco multipotentes do folículo piloso. Portanto, examinamos o padrão de expressão da citoqueratina 4 (CK-4), uma proteína de filamento intermediário que é expressa em alguns epitélios escamosos, por exemplo, a mucosa oral, a vagina e o esôfago, mas não na pele cabeluda ou em cultura multipotente células-tronco do folículo capilar. A expressão de CK-4 foi prontamente detectável em células-tronco epiteliais cultivadas isoladas da vagina, mucosa oral e esôfago, mas CK-4 tornou-se indetectável depois que as células foram transplantadas na pele de camundongo recém-nascido. A expressão de CK-4 foi novamente facilmente detectável em células-tronco recuperadas de transplantes, mas não na segunda rodada de transplante (Fig. 5b). Um padrão semelhante foi observado com a expressão de CK-8/18 na bexiga (trígono e cúpula) (Fig. 5c). Esses resultados, juntamente com os da análise transcricional global (Dados Suplementares 2), demonstraram que as células mantêm uma "memória" de seu tecido de origem e continuaram expressando genes de seu programa pré-existente, apesar de funcionarem como células-tronco multipotentes de folículo piloso bona fide em ensaios de transplante de pele. Relatos anteriores indicaram que queratinócitos humanos cultivados da planta do pé ou palma da mão 44,45 ou da mucosa oral 43 também mantinham seu fenótipo de origem. No entanto, nos últimos relatórios, o fenótipo original foi mascarado em cultura e revelado apenas depois que as células foram transplantadas in vivo, uma diferença para nossas observações em que o fenótipo original foi desmascarado em cultura, mas mascarado após o transplante. Nichos variados (recém-nascido versus adulto saudável versus doente) podem explicar essa discrepância.

uma Expressão de RNA-Seq de fatores de transcrição relacionados a tecidos para vagina, timo, bexiga e traqueia em comparação com células-tronco multipotentes de folículo piloso antes de as células serem transplantadas em um microambiente de pele de camundongo de tipo selvagem recém-nascido (1ª rodada) e depois de serem recuperadas do transplantes (2ª rodada rec) genes regulados para baixo e para cima, alteração de dobra & gt2, ajustados p valor & lt 0,05, NS: não significativo. Observe que a expressão desses fatores de transcrição é mantida na 2ª rodada de cultura, após as células terem sido recuperadas meses após o transplante. b Imunocoloração de CK-4 (citoqueratina 4, vermelho) e EGFP (verde) em células da mucosa oral, esofágica e vaginal dois experimentos independentes Mucosa oral: dia 100 (1º e 2º transplantes) vagina: dia 84 e 100 (1º e 2º transplantes ) esôfago: dias 99 e 100 (1º e 2º transplantes) bigode: dias 100 e 385 (1º e 2º transplantes). Os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342. Barras: 100 μm. c Imunocoloração de CK-8/18 (vermelho) e EGFP (verde) em células da bexiga dois experimentos independentes. Bexiga (cúpula): dia 238 e 102 (1º e 2º transplantes) bexiga (trígono): dia 238 e 85 (1º e 2º transplantes) bigode: dia 236 e 385 (1º e 2º transplantes). Barras: 100 μm. Observe que as ceratinas CK-4 ou 8/18 são expressas na cultura, mas não nos transplantes. Observe que as células EGFP recuperadas dos transplantes re-expressam CK-4 ou CK-8/18 quando cultivadas. Os núcleos (azul) foram contrastados com Hoechst 33342.


Pensamentos finais

Avanços recentes em nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a homeostase da pele revelaram que uma infinidade de tipos de células na pele interagem para gerar um nicho complexo e multifacetado para células-tronco epiteliais. No futuro, examinar como as células do nicho da pele e os sinais que elas geram ficam errados durante as doenças de pele e cânceres iluminará como o nicho é regulado durante os estados de doença. Para tanto, será fundamental desenvolver ferramentas específicas para visar geneticamente tipos de células não epiteliais. Essas ferramentas nos ajudarão a compreender as células de nicho da pele e também como esses tipos de células contribuem para nichos em outros tecidos, iluminando os componentes dos nichos SC do tecido de mamíferos.

Repórteres fluorescentes e imunomarcação revelam a proximidade de tipos de células não epiteliais ao bojo do folículo piloso (Bu). A e B. As papilas dérmicas (Lef1-RFP) e os melanócitos (TRP2) residem abaixo da protuberância. Em contraste, o músculo eretor do pêlo (integrina & # x003b18) (C) e os neurônios periféricos (neurofilamento) (D) se fixam ao lado das células protuberantes. Os adipócitos (E) são a base da estrutura folicular na derme. (F) Esquema ilustrando as células de nicho na pele. Imagens cortesia de Michael Rendl (Lef1-RFP), Hironobu Fujiwara e Fiona Watt (nefronectina & # x003b18 integrina), Isaac Brownell e Alex Joyner (neurofilamento Gli1-lacZ) e Mayumi Ito (K15-GFP TRP2).


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