Em formação

As RNases / DNases podem sobreviver em soluções de ácido / base fortes de cerca de 10M?

As RNases / DNases podem sobreviver em soluções de ácido / base fortes de cerca de 10M?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Esta pode ser uma pergunta muito estúpida, mas estou preocupado com a contaminação de minhas amostras por RNase / DNase. Como eu uso HCl a 37% e NaOH 10 M para pH quase todos os meus buffers, esta é uma fonte potencial.

Eu li, entretanto, que tanto o NaOH quanto o HCl deveriam hidrolisar as ligações peptídicas nos aminoácidos em altas concentrações. Para o HCl, no entanto, li que uma etapa de aquecimento é necessária para facilitar a hidrólise da proteína, por isso estou um pouco confuso. Talvez alguém com melhor formação em química pudesse ajudar?

Muito obrigado!


Você está seguro aqui. RNase é muito mais estável do que DNase (de qualquer sabor). O pH extremo destruiria até mesmo RNase, especialmente considerando o tempo (ele tem que sentar na garrafa com todo aquele ácido / base ...) Além disso, considere o seguinte: é altamente improvável que produtos químicos de alta tonelagem como HCL ou NaOH possam ser contaminados com enzimas orgânicas . Se você tiver um problema de contaminação por RNase / DNase, eu procuraria em outro lugar a origem disso.


O tratamento com NaOH é um dos métodos usados ​​para preparar o equipamento que precisa estar livre de RNAse. DEPC é o preferido em minha experiência, mas o NaOH certamente funciona bem. O NaOH altamente concentrado, como no seu caso, certamente destruirá todos os RNAs presentes.

Eu presumiria o mesmo para HCl concentrado. A RNAse é muito estável para uma proteína, mas HCl concentrado não é algo que eu esperaria que sobrevivesse.


Autismo e RNA de amplificação.

No NYTimes de hoje há um comentário sobre a nova legislação federal cujo objetivo é impulsionar a pesquisa sobre o autismo. Mas não é sobre isso que quero falar.

Por isso, estive lendo alguns blogs de pesquisadores do autismo para descobrir que existe uma pseudociência próspera do autismo. Para mais informações, visite o blog do BC (Bartholomew Cubbins on Autism). E eu sei que você provavelmente já ouviu falar dos fanáticos por metais pesados ​​(ou seja, o mercúrio nas vacinas causa autismo), mas é pior do que isso.

Basta seguir esta ladeira assustadora e escorregadia dos mal informados.

Então, digamos que você acredite nessa teoria infundada de que metais pesados ​​causam autismo, como você trataria isso? Queladores o fariam por uma tentativa. E sim, alguns charlatães estão lidando com quelantes como o EDTA para pais de crianças autistas. É claro que o EDTA absorverá muito mais átomos abundantes que são NECESSÁRIOS PARA A VIDA. Portanto, os pais de crianças autistas NÃO dão EDTA a seus filhos, pois ele absorve todo o magnésio e o cálcio. Claro que você pode complementá-los. Mas isso é loucura. Você vê que esses "metais ruins" estão em você em níveis residuais, mas você tem muito cálcio e magnésio e precisa deles em um certo nível em seu corpo. Este procedimento de EDTA é como drenar o oceano (EDTA sendo o balde) e então adicionar de volta a água (cálcio e magnésio) para remover um derramamento de óleo na costa do Alasca ("metais ruins"). Boa sorte!

Portanto, o EDTA é perigoso. Que tal vender algo um pouco menos poderoso, mas com toda a magia ainda intacta. Sim (devem ter pensado) vamos vendê-los. RNA! Sim, polímeros de ácido ribonucleico.

Estou supondo que a ideia decorre do fato de que aptâmeros de RNA se ligam a vários compostos. Ou será que os trifosfatos de nucleotídeos se ligam a certos cátions divalentes? Em qualquer caso, se o RNA pode atuar como um quelante ou não, não é importante. Porque? Porque o RNA é instável.

Deixe-me repetir. O RNA é instável.

Não apenas o ambiente está CHEIO de RNAses (isto é, enzimas que destroem o RNA), mas o RNA pode se auto-hidrolisar à temperatura ambiente.

Vamos dar uma olhada na estrutura dos polímeros de RNA e DNA para entender o porquê:

Como você pode ver, o DNA tem uma espinha dorsal de onde o fosfato (PO4) está ligado a um açúcar desoxirribose (que seria a estrutura pentagonal) que se liga ao próximo fosfato e assim por diante. Desoxirribose significa que o grupo hidroxila (o grupo -OH) no segundo carbono do açúcar não está lá. O RNA, por outro lado, tem uma estrutura de açúcar RIBOSE de fosfato. A ribose tem um grupo hidroxila em seu segundo carbono. Este grupo hidroxila é muito reativo. Em parte, esse grupo -OH extra é o que faz com que certas moléculas de RNA atuem como enzimas (por exemplo, o ribossomo). Mas este grupo -OH também é a cura de Aquiles do RNA - ele pode reagir com o grupo fosfato próximo (que está bem ao lado no carbono 3) e, assim, clivar a espinha dorsal. DESTRUINDO assim O RNA. Esta reação pode ser retardada incubando o RNA a uma temperatura muito baixa (eu armazeno o meu a -80'C), mas à temperatura ambiente a maioria dos polímeros de RNA serão picados em um dia ou mais (a menos que tenham alguma estrutura secundária, mas mesmo para moléculas de RNA bem dobradas, você obterá pequenos pedaços em um dia).

Agora, esses chamados terapeutas vão responder que as pessoas descobriram como retardar a reação de hidrólise. Claro que sim. modificando o RNA para que o segundo grupo hidroxila não seja mais reativo. Mas esses tipos de RNAs são todos sintetizados em um laboratório e custam mucho $$. Não, eles obtêm seu RNA da levedura. Em outras palavras, esse tipo de RNA é o tipo que se desfaz espontaneamente em horas.

É claro que essa reação de auto-hidrólise requer H2O (também conhecida como água). Você pode pensar que eles estão pelo menos armazenando seu RNA como pelotas secas no freezer. Mas não! Seu "produto" é uma solução aquosa de RNA armazenado À TEMPERATURA AMBIENTE.

Se houver alguém aí usando este produto para seu filho autista. Pare agora e processe esses caras. Eles estão te enganando cegamente! Sua "ciência" não daria certo em nenhuma aula de bioquímica do primeiro ano!

OK e aqui está mais. Eu estava lendo seus quadros de avisos, e aqui estão alguns trechos de discussão:

Eu estraguei tudo? Acabei de receber RNAs e dar a ele diretamente na boca e seus lábios tocaram os conta-gotas. Por que não está nas instruções para não tocar na boca. Acabei de destruir 2 garrafas novas? Acho que estava muito ansioso. jb

Portanto, os pais estão tratando seus filhos autistas aplicando gotas de RNA direto na boca das crianças. Merda de Holly. Primeiro, sua boca está CHEIA de RNAses. E se você não sabe, os RNAses são enzimas que destroem o RNA e estão EM TODA PARTE. Você os secreta em sua saliva e em seu suor. E se eles sobreviverem à sua boca (o que não acontecerão), NUNCA IRÃO SOBREVIVER AO SEU ESTÔMAGO. Confie em mim. Quando trabalho no laboratório, uso luvas e nunca toco em nada com as mãos porque. meu suor é um inimigo de todos os meus experimentos. As RNAses são uma das enzimas mais estáveis ​​conhecidas pelo homem. Normalmente você pode aquecer enzimas para destruir sua atividade. mas os RNAs são tão estáveis ​​que aquecer seus instrumentos geralmente não é suficiente. A autoclavagem (ou seja, calor + alta pressão) não é suficiente. Todas as minhas pontas de pipeta (os pequenos dispensadores de plástico de líquidos que os funcionários do laboratório usam para manipular líquidos) são CERTIFICADOS DE RNAse GRÁTIS! Ou seja, a empresa realmente testa as pontas logo após serem fabricadas para garantir que não haja nenhum traço de RNAse nelas. Eles testam outras enzimas desagradáveis? Além da DNAse (que são muito mansos em comparação com a RNAse), eles não o fazem. As pontas são embaladas duplamente e enviadas para o laboratório, onde são armazenadas em um gabinete sem RNAse que não pode ser aberto sem luvas. Sim, quando você trabalha com RNA, você tem que ser um pouco paranóico. Alguns até usam pontas com filtros para se certificar de que a RNAse que pode estar no pipetador não será soprada em seu experimento. Agora esse conta-gotas (da mensagem dos pais) tocou a boca da criança! . assim, em cerca de 5min todas as moléculas de RNA na garrafa estão torradas. Então, qual é a resposta padrão?

Não se preocupe, ainda deve ser bom por pelo menos 30 dias, talvez até mais.

Citar:
Eu apenas pensei em contar a todos o que o pessoal da RNA me disse na conferência sobre o uso deste produto. Recentemente, houve um certo susto com o conta-gotas do RNA tocando a boca do seu filho e estragando a garrafa inteira. Isso só é verdade após 30 dias de contaminação. Ela disse que se o conta-gotas tocar na boca deve-se usar água bem quente para esterilizar o conta-gotas. Se você não fizer isso, a contaminação leva 30 dias para estragar a garrafa. Se o conta-gotas ficar escuro (não está mais claro), então você tem um frasco contaminado. Além disso, ela me disse que a dosagem na garrafa está errada. Em vez de 1/2 conta-gotas, deve ser de 0,5 ml, que é 1/4 conta-gotas. Eu estava examinando minhas garrafas em cerca de duas semanas. Agora, espero que durem um mês. Recomendei enfaticamente a ela que inserissem instruções com os frascos e ela disse que examinariam o assunto. Espero que isso ajude

Oh cara . "Se o seu conta-gotas escurecer". tradução "se o seu RNA líquido estiver cheio de bactérias".

Alguns pais nesses fóruns de discussão chegam perto. Aqui está um exemplo:

Queridos pais,

Eu tenho algumas perguntas muito básicas que vocês devem ter resolvido há muito tempo. Como isso ainda me incomoda, ainda quero postá-los aqui e pedir sua ajuda.

Minhas perguntas são:
Nº 1: Na ocasião em que recebi produtos de RNA do Dr. Yasko do meu médico, fui instruído a manuseá-los com cuidado, por exemplo, sem deixar o conta-gotas tocar na boca da criança para evitar degradação e tornar todo o frasco de RNA ineficaz. Isso é compreensível porque os RNAs são muito fáceis de serem degradados e os RNAses existem em quase todos os lugares. É por isso que os biólogos moleculares precisam lidar com RNAs com tanto cuidado intensivo, caso contrário, os experimentos serão arruinados. Mais tarde, liguei para o consultório do meu médico para perguntar se devo dar o medicamento com esse cuidado, como os RNAs podem se manter intactos depois de dar ao meu filho por via oral sem degradação. O consultório do meu médico não conseguiu responder à minha pergunta e apenas disse, uma vez que o Dr. Yasko é um especialista neste campo, deve haver algum motivo. Concordo que, como a Dra. Yasko é a primeira a isolar espécies únicas de RNA há cerca de 20 anos, ela deve ter resolvido esse problema para fazer seus produtos funcionarem, mas ainda espero saber por que temos que lidar com os produtos com cuidado antes de dar à criança, mas não é um problema deixá-los trabalhar depois de tomá-los por via oral?
Nº 2: os RNAs são macromoléculas e não são como as enzimas digestivas (que também são moléculas grandes) que damos aos nossos filhos, as enzimas digestivas só precisam funcionar dentro do trato digestivo sem absorção, os RNAs têm que funcionar não apenas dentro do corpo, mas, no meu entendimento, eles têm que funcionar particularmente dentro das células e núcleos celulares. Visto que os RNAs são moléculas tão grandes, mesmo que tenham sido fabricados como derivados para evitar a degradação pela RNAse geral, como eles poderiam ser absorvidos pelo corpo e penetrar nas células para atuar ali?

Queridos pais, acho que a maioria de vocês deve ter resolvido esse problema antes de tomar os RNAs. Comecei a dar ao meu filho autista vários produtos de RNA, mas sinceramente peço a sua ajuda para esclarecer as questões acima, para que eu continue neste programa com mais confiança em minha mente. Muito obrigado à frente.

Muito bem! Ótimas perguntas!

A informação que você está procurando estaria no livro "The Power of RNA's" e se não estiver lá, você deve tentar fazer uma pesquisa sobre ela. Por exemplo, "RNA E degradar". Continue adicionando palavras à sua pesquisa com E no meio e você poderá encontrar alguma discussão sobre isso. Acredito que a Dra. Amy tenha discutido que algumas das informações sobre RNAs que você tem em mente eram da década de 1970 e, desde então, parte dessa "ciência" não é mais aplicável.

Degradação de RNA, não mais aplicável.

O RNA natural é de fato muito frágil e facilmente degradável. De acordo com o livro "Power of RNA", uma tecnologia chamada antisense foi desenvolvida por produtos farmacêuticos e essa tecnologia estabiliza o RNA significativamente. O livro usa a analogia da cola segurando um colar de contas. Embora o livro fornecesse uma descrição leiga do antisentido, na verdade não o explicava em detalhes. Também não afirmou claramente se a mesma tecnologia é usada para o RNA da longevidade ou se outra tecnologia é usada.

Não obtive uma resposta satisfatória sobre como o RNA atravessa a membrana celular depois de ler o livro. Eu fiz uma leitura rápida de algumas partes, então é possível que eu tenha esquecido.

Estabilizando antisense o RNA? OK, talvez este pai esteja apenas lendo mal o documento. Talvez eles simplesmente não tenham ideia. Mas se você continuar lendo o site (autismanswer.com), nunca obterá uma explicação. Apenas os pais que ficam maravilhados com o incrível efeito placebo (que um pouco de água e RNA degradado fornecem) e alguns "especialistas" respondendo com banalidades.

Então, de quem é essa empresa? É chefiado pela Dra. Amy Yasko. Nunca ouvi falar dela. Pesquisei "Yasko_A" no PubMed e encontrei 56 resultados. tudo por Allan W Yasko. mas não Amy.

E esta não é a única empresa. há um outro na China que faz a mesma coisa.


Resumo

As nucleases de DNA e RNA dependentes de metais são enzimas que clivam os ácidos nucléicos com grande eficiência e precisão. Essas reações hidrolíticas mediadas por enzimas são fundamentais para a replicação, reparo e armazenamento de informações genéticas dentro da célula. Aqui, extensas simulações moleculares de energia livre clássicas e quânticas mostram que uma interação cátion-π é formada transitoriamente no local no núcleo metálico do Bacteriófago −λ Exonuclease (Exo − λ), durante a catálise. Esta interação não covalente (Lys131-Tyr154) desencadeia a ativação de nucleófilos para excisão de nucleotídeos. Então, nossas simulações também mostram a dinâmica oscilatória e oscilação da díade catiônica − π recém-formada, cuja mudança conformacional pode favorecer a liberação de prótons do catiônico Lys131 para a solução em massa, restaurando assim o estado de protonação pré-catalítica em Exo − λ. Ao todo, relatamos o novo caráter mecanicista das interações cátion-π para catálise. Análises estruturais e bioinformáticas apóiam que a orientação flexível e a formação transitória de interações catiônicas − π móveis podem representar uma estratégia catalítica comum para promover a hidrólise de ácido nucleico em nucleases de DNA e RNA.


Tecnologias de amplificação de sinal para a detecção de ácidos nucléicos: da análise livre de células a imagens de células vivas

Devido às suas propriedades exclusivas, como programabilidade, capacidade de ligação de ligante e flexibilidade, os ácidos nucleicos podem servir como analitos e / ou elementos de reconhecimento para biossensor. Para melhorar a sensibilidade do biossensorio baseado em ácido nucleico e, portanto, a detecção de algumas cópias da molécula alvo, diferentes metodologias de amplificação modernas, nomeadamente estratégias de amplificação baseadas em alvo e sinal, já foram desenvolvidas. Essas tecnologias de amplificação de sinal recentes, que são capazes de amplificar a intensidade do sinal sem alterar o número de cópias dos alvos, resultaram em métodos rápidos, confiáveis ​​e sensíveis para a detecção de ácido nucleico. Trabalhando em ambientes sem células, os pesquisadores foram capazes de otimizar uma variedade de métodos complexos e quantitativos adequados para implantação em condições de células vivas. Neste estudo, uma revisão abrangente das tecnologias de amplificação de sinal para a detecção de ácidos nucléicos é fornecida. Classificamos as metodologias de amplificação de sinal em estratégias enzimáticas e não enzimáticas, com foco principal nos métodos que nos permitem mudar da detecção in vitro para a imagem in vivo. Finalmente, os desafios futuros e as limitações da detecção de condições celulares são discutidos.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso por meio de sua instituição.


Aqui, Lau et al. mostram que a nuclease NucC associada a CBASS causa a morte de células infectadas por fago através da destruição do genoma. Eles mostram como o NucC é alostericamente ativado por um segundo mensageiro triadenilato cíclico sintetizado por CBASS após a infecção. NucC também foi integrado em sistemas CRISPR / Cas Tipo III como uma nuclease acessória.

As bactérias estão travando uma luta contínua para proteger a si mesmas e a seus genomas de elementos genéticos móveis estranhos e bacteriófagos e, como tal, desenvolveram defesas sofisticadas contra esses invasores. Dois sistemas de defesa bacteriana bem caracterizados são sistemas de modificação de restrição e sistemas CRISPR / Cas, ambos os quais dependem da atividade de nuclease direcionada para destruir ácidos nucleicos estranhos. Em um sistema de modificação de restrição típico, uma bactéria codifica uma endonuclease de DNA específica para sequência e uma metilase de DNA correspondente que modifica o genoma do hospedeiro para protegê-lo contra a clivagem por endonuclease (Arber e Linn, 1969 Wilson e Murray, 1991). Enquanto os sistemas de restrição-modificação montam uma resposta padrão para todo DNA modificado incorretamente e como tal podem ser comparados a um sistema imunológico & # x0201cinnate & # x0201d, os sistemas CRISPR / Cas mais recentemente caracterizados são mais semelhantes a um & # x0201cadaptivo & # x0201d sistema imunológico. Nestes sistemas, as nucleases efetoras são carregadas com sequências guia que visam especificamente ácidos nucleicos estranhos (Koonin et al., 2017 Sorek et al., 2013 Wright et al., 2016). Em sistemas CRISPR / Cas Tipo III, o complexo efetor multiproteína não só reconhece e cliva RNA e DNA estranho (Koonin et al., 2017 Pyenson e Marraffini, 2017), mas também sintetiza 3 & # x02032 & # x022125 & # x02032 oligoadenilato cíclico ligado segundos mensageiros na ligação ao alvo (Kazlauskiene et al., 2017, Niewoehner et al., 2017). Esses segundos mensageiros, por sua vez, ativam nucleases acessórias não específicas codificadas nos mesmos operons, incluindo as RNases Csm6 e Csx1 e a DNase Can1 (Han et al., 2018 Kazlauskiene et al., 2017 Mcmahon et al., 2019 Niewoehner et al., 2017).

Os sistemas de defesa de bacteriófago CBASS recentemente descritos (C yclic oligonucleotide-B ased A nti-fhage S ignaling System) codificam uma nucleotidiltransferase semelhante a cGAS / DncV (CD-NTase), um de vários efetores diversos e, opcionalmente, um conjunto de reguladores proteínas supostamente responsáveis ​​por detectar uma infecção (Burroughs et al., 2015 Cohen et al., 2019 Whiteley et al., 2019). Em trabalhos relacionados, determinamos os mecanismos moleculares de um sistema CBASS que codifica proteínas regulatórias relacionadas às proteínas do domínio HORMA eucariótica e AAA + ATPase Pch2 / TRIP13 (Ye et al., 2019). Neste sistema, a detecção de peptídeos específicos pela proteína de domínio HORMA codificada por CBASS estimula a síntese do segundo mensageiro trinucleotídeo cíclico AMP-AMP-AMP cíclico (cAAA), que ativa a endonuclease de DNA NucC (N uclease, C D-NTase associada) . Tanto a produção de cAAA quanto a atividade catalítica NucC são necessárias para a imunidade bacteriófago, que é mediada por um mecanismo de infecção abortivo no qual as células infectadas morrem antes da conclusão da replicação do fago (Ye et al., 2019). Ainda sem resposta, no entanto, tem sido como a ativação de NucC leva à morte celular e como essa enzima relacionada à endonuclease de restrição é controlada pelo segundo mensageiro cAAA.

Aqui, mostramos que NucC é uma endonuclease de DNA homotrimérica que se liga ao segundo mensageiro cAAA em um bolso alostérico simétrico de três vezes. Mostramos que a ativação de nuclease envolve a montagem de dois trímeros NucC em um homohexâmero, que justapõe pares de sítios ativos de endonuclease e promove a clivagem de DNA de fita dupla coordenada. NucC é em grande parte não específico de sequência e não é inibido pela metilação do DNA, e sua ativação em células infectadas leva à destruição completa do DNA celular.Finalmente, descobrimos que os homólogos NucC foram incorporados em sistemas CRISPR / Cas Tipo III, definindo uma nova família de nucleases acessórias CRISPR Tipo III ativadas por segundos mensageiros de oligoadenilato cíclico.


Purificações

Após uma imunização, você pode ter incluído a purificação por afinidade dos anticorpos produzidos contra o peptídeo ou seu antígeno em quantidade suficiente. A Eurogentec oferece diferentes formatos de purificações, 5 ml, 20 ml e 50 ml. O ELISA pode ser adicionado opcionalmente a purificações de 5 e 20 ml, mas é uma parte da purificação por afinidade de 50 ml. O ELISA deve ser considerado aqui, como meio de caracterização de anticorpos purificados, e não como ferramenta de controle de qualidade. Como já mencionado acima, os resultados dos testes ELISA são influenciados por

  • A acessibilidade do epítopo para o anticorpo
  • A concentração e adequação de revestimento do antígeno
  • Simplesmente o fato de o anticorpo ter sido purificado com o antígeno acoplado a uma matriz, e agora ser sondado com o antígeno imobilizado em uma placa de ELISA (diferenças estruturais do antígeno em duas aplicações diferentes)

Dados esses fatores, resultados diferentes podem ser possíveis para o ELISA dos anticorpos purificados:

Purificação 3 : uma curva ELISA plana pode sugerir que a purificação não forneceu qualquer anticorpo de trabalho (Exemplo 3). Informamos que também nesse caso o teste vale o esforço, uma vez que ainda pode ser possível que o antígeno pareça diferente na placa de ELISA em comparação com sua estrutura durante a purificação por afinidade e, finalmente, em sua aplicação. Tente caracterizar o anticorpo por Western ou dot blotting & ndash essas aplicações funcionam com muito mais de 70% dos anticorpos personalizados da Eurogentec. Uma diluição inicial pode ser 1: 500. Se o teste for positivo no Western blot & ndash ou dot blot e você quiser usar o novo anticorpo na aplicação desejada, terá que estabelecê-lo de acordo, talvez alterar os protocolos existentes. Compare o desempenho do anticorpo purificado sempre com o soro (1: 500 a 1: 10.000 diluído, dependendo dos resultados de otimização) em testes paralelos em amostras idênticas. Se tiver dificuldades, não hesite em contactar-nos para obter mais conselhos.


BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGO. 1 é um esquema da produção do molde para o suporte de captura e a moldagem do suporte de captura.

FIGO. 2 é um esquema das etapas de captura e lise de células no uso de dispositivos de acordo com a invenção.

FIGO. 3 é um diagrama de poços no suporte de captura.

FIGO. 4 mostra células capturadas em poços no suporte de captura.

FIGO. 5 é um diagrama de poços no suporte de captura cercado por um recesso.

FIGO. 6 mostra células capturadas em poços no suporte de captura rodeado por um recesso.

FIGO. 7 mostra poços padronizados sobrepondo recursos de componentes analíticos muito maiores.

FIGO. 8 mostra poços padronizados sobrepondo recursos de componentes analíticos muito menores.

FIGO. 9 é uma vista em corte transversal de um dispositivo para captura de célula única em que as câmaras compreendem canais.

FIGO. 10 é uma vista de cima para baixo de um dispositivo para captura de célula única de uma pluralidade de células individuais em que os poços cruzam canais.

FIGO. 11 mostra uma modificação no dispositivo para incluir um método para aquecimento localizado da lâmina de vidro, evitando a necessidade de um aparelho externo, como um palco Peltier ou placa de aquecimento.

FIGO. 12 é um gráfico que mostra as medições de temperatura Vs tempo em diferentes tensões de operação para uma lâmina revestida de ITO.

FIGO. 13 mostra uma modificação no dispositivo para incluir um método para 'remoção' forçada de biopolímeros de interesse aprisionados na matriz de polímero / gel.

FIGO. 14 é um gráfico que mostra a% de ocupação de poços de vários diâmetros de poço por células MEL c88.

FIGO. 15 é um gráfico que mostra a porcentagem de poços que estão vazios, ocupados individualmente e multiplicados por células MEL c88 em suportes de captura com diâmetro de poço variável.

FIGO. 16 é uma imagem que mostra a fluorescência Cy3 em um membro da tampa após a transcrição reversa de RNA imobilizado.

FIGO. 17 é uma imagem que mostra os contornos da fluorescência Cy3, numerados consecutivamente, em um membro da tampa após a transcrição reversa do RNA imobilizado.

FIGO. 18 é um gráfico que mostra a intensidade do sinal de entre os poços ocupados e através dos poços ocupados (18A e 18B, respectivamente).

FIGO. 19 é uma imagem que mostra a fluorescência da coloração de aglutinina de germe de trigo (WGA) (FIG. 19A) e marcador Cy3 após a transcrição reversa (FIG. 19B), a partir de poços inicialmente ocupados por células MEL c88 coradas com WGA.


As RNases / DNases podem sobreviver em soluções de ácido / base fortes de cerca de 10M? - Biologia

Este pedido reivindica prioridade no pedido provisório U.S. Ser. No. 60 / 024.343, depositado em 23 de agosto de 1996.

1. Método para preparar uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende um fator com as seguintes características:

c) resistente ao aquecimento a 100 ° C por 10 minutos

d) resistente ao congelamento-descongelamento

e) resistente à liofilização

g) tem um peso molecular aparente entre cerca de 0,5 e 1 kDa

h) tem uma atividade biológica de inibir a proliferação de uma célula tumoral

em que o método compreende as etapas de:

i) contatar uma célula com um vetor de expressão transcricionalmente ativo que expressa um gene supressor de tumor

ii) cultivar a referida célula em meio de cultura de células sob condições em que a expressão do referido vetor ocorre e

iii) purificar o referido fator antiproliferativo submetendo o referido meio de cultura a fracionamento por tamanho.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de remoção da referida célula do referido meio de cultura.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a separação física do referido fator do referido meio de cultura de células.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido tamanho de fracionamento elimina moléculas maiores que 300 kD.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido tamanho de fracionamento elimina moléculas maiores do que cerca de 3 kD.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o tratamento do referido meio de cultura de células com uma protease ou nuclease.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o aquecimento do referido meio de cultura de células.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula é uma célula tumoral.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vetor de expressão é um vetor viral ou plasmídeo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um adenovírus, retrovírus, vírus adeno-associado ou um vírus vaccinia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende um promotor, um gene e um sinal de poliadenilação.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene supressor de tumor codifica p53 de tipo selvagem.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido gene codifica β-galactosidase.

14. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida remoção é realizada por centrifugação.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é cultivada por cerca de 24, cerca de 48 ou cerca de 72 horas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se genericamente ao campo do câncer e da terapia de células hiperproliferativas. Mais particularmente, refere-se a métodos para inibir o crescimento e / ou morte de células por contato das células com um agente citotóxico / citostático.

2. Descrição da Arte Relacionada

A homeostase normal do tecido é obtida por um equilíbrio intrincado entre a taxa de proliferação e morte celular. A interrupção desse equilíbrio, seja aumentando a taxa de proliferação celular ou diminuindo a taxa de morte celular, pode resultar no crescimento anormal das células e é considerada um evento importante no desenvolvimento do câncer, bem como outros distúrbios proliferativos celulares, como restenose.

Os efeitos do câncer são catastróficos, causando mais de meio milhão de mortes por ano apenas nos Estados Unidos. As estratégias convencionais para o tratamento do câncer incluem quimioterapia, radioterapia, cirurgia ou combinações das mesmas, no entanto, avanços adicionais nessas estratégias são limitados pela falta de especificidade e toxicidade excessiva para tecidos normais. Além disso, certos tipos de câncer são refratários a tratamentos como a quimioterapia, e algumas dessas estratégias, como a cirurgia, nem sempre são alternativas viáveis. Por exemplo, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), que inclui carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de células grandes, é responsável por 75-80% de todos os cânceres de pulmão (American Cancer Society, 1993). As estratégias terapêuticas multimodais atuais aplicadas ao NSCLC regionalmente avançado são minimamente eficazes com a taxa de cura geral sendo de apenas cerca de 10% (Belani, 1993 Roth et al., 1994).

O câncer é agora entendido como o resultado de múltiplas mudanças genéticas (Goyette et al., 1992 Klein et al., 1987) e está bem estabelecido que muitos cânceres são causados, pelo menos em parte, por alterações genéticas que resultam em qualquer dos sobre-expressão de um ou mais genes, ou a expressão de gene ou genes anormais ou mutantes. Por exemplo, sabe-se que a expressão de oncogenes desempenha um papel no desenvolvimento do câncer. Oncogenes são definidos como genes geneticamente alterados cujo produto de expressão mutado de alguma forma perturba a função ou controle celular normal (Spandidos et al., 1989). Acredita-se que esses tipos de mutações tenham efeitos sobre o crescimento maligno de células derivadas de praticamente todos os tecidos.

Outro tipo de gene de interesse no desenvolvimento do câncer é o gene supressor de tumor. Mutações nesses genes resultam na perda da função do produto do gene celular normal, que está envolvido na supressão do fenótipo neoplásico. O gene p53 é bem reconhecido como um gene supressor de tumor (Montenarh, 1992). Há evidências consideráveis ​​ligando mutações em p53 na oncogênese de muitos cânceres humanos. Existem muitos relatos que demonstram que o crescimento neoplásico de células tumorais de cólon, glioblastoma, mama, osteossarcoma e pulmão pode ser suprimido pela expressão de p53 de tipo selvagem. Por exemplo, a introdução de p53 de tipo selvagem em uma variedade de tipos de células ou tumores com mutações ou deleções de p53, usando métodos de entrega viral, resultou na expressão do transgene de p53 de tipo selvagem e uma supressão do fenótipo maligno. Além disso, a introdução de 53 de tipo selvagem em certos tipos de células tumorais de tipo selvagem p53 suprime seu crescimento. Esses tipos de observações demonstram que altos níveis de expressão de p53 de tipo selvagem são um efeito desejável para o tratamento de doenças oncogênicas dependentes de p53.

Outros tipos de distúrbios hiperproliferativos também têm sido alvo da terapia gênica. A reestenose, caracterizada pelo novo crescimento das células musculares lisas no lúmen dos vasos sanguíneos após a angioplastia ou outro dano arterial, é um problema frequente e recorrente no sucesso a longo prazo da angioplastia. As taxas de falha de angioplastia como resultado de reestenose dentro de seis meses são relatadas como sendo entre 25-50% (Leimgruber et al., 1986 Gruentzieg et al., 1987 Nobuyoshi et al., 1988 Serruys et al., 1988). A reestenose também ocorre após reconstruções arteriais, aterectomia, implante de stent e angioplastia a laser. A lesão das artérias durante a angioplastia resulta na ativação das células do músculo liso medial, que começam a migrar e proliferar no lúmen da artéria para formar uma neoíntima, ou uma nova camada de células. Acredita-se que a expansão dessa neoíntima, em decorrência da nova camada de células musculares lisas, matriz extracelular e células inflamatórias recrutadas, seja a causa da eventual redução do fluxo sanguíneo pela artéria e recorrência dos sintomas isquêmicos. Atualmente, acredita-se que a administração de construções de terapia gênica que codificam o gene da timidina quinase de HSV ou da citosina desaminase pode ser benéfico para prevenir a restenose. Da mesma forma, prevê-se que a terapia genética pode ser útil para o tratamento de outras doenças celulares hiperproliferativas, incluindo psoríase e artrite reumatóide.

Geralmente, ambas as quimio e radioterapias padrão, bem como a transferência de material genético para as células, têm limitações, permanecendo claramente uma necessidade de estratégias melhoradas de terapia celular anticâncer e antiproliferativa. Em particular, há uma necessidade de aumentar o nível de inibição do crescimento além do induzido pelas modalidades tradicionais de terapia genética.

É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer métodos e composições melhoradas para o tratamento de câncer e outros distúrbios celulares hiperproliferativos. Mais particularmente, é um objetivo fornecer métodos para a produção de um fator ou fatores que exibam atividade antiproliferativa contra células e composições para este tipo de terapia. Estes métodos e composições podem funcionar sozinhos ou potencializar os efeitos da radioterapia, quimioterapia ou terapia genética através do fornecimento ou indução de um fator antiproliferativo citotóxico / citostático.

Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecido um fator anti-proliferativo purificado produzido por um processo que compreende as etapas de (a) contatar uma célula com um vetor de expressão transcricionalmente ativo (b) cultivar a referida célula em meio de cultura de células e ( c) purificar o referido fator antiproliferativo. O processo pode ainda compreender a etapa de remoção da referida célula do referido meio de cultura de células.

Em outra modalidade, é fornecido um método para purificar um fator anti-proliferativo compreendendo as etapas de (a) contatar uma célula com um vetor de expressão transcricionalmente ativo (b) cultivar a referida célula em meio de cultura de células e (c) purificar o referido anti- fator proliferativo. O processo pode compreender ainda a etapa de remoção da referida célula do referido meio de cultura de células

Em ainda outra modalidade, é fornecido um fator antiproliferativo com as seguintes características: (a) resistente à protease (b) resistente à nuclease (c) resistente a altas temperaturas (d) resistente a congelamento-descongelamento (e) resistente a liofilização (f) pH estável e (g) tem um peso molecular aparente inferior a cerca de 3 kDa ou inferior a cerca de 300 kDa.

Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de inibir o crescimento de uma célula que compreende a etapa de contatar a referida célula com um fator antiproliferativo produzido de acordo com os métodos acima.

Em ainda uma outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa compreendendo a etapa de contatar uma célula sem regulação do crescimento celular normal com um fator antiproliferativo produzido de acordo com os métodos acima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos a seguir fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste documento.

FIGO. 1 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após tratamento com sobrenadante de células H1299 infectadas com Adp53. Células H1299 ingênuas foram semeadas em placas de 96 poços em uma confluência de aproximadamente 19% e meio fresco (1ª barra da esquerda em cada conjunto), sobrenadante de células H1299 não infectadas (2ª barra), células H1299 infectadas com Adp53 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 (3ª barra), ou células H1299 infectadas com Adp53 a uma MOI de 20 (4ª barra), foi adicionada a cada poço. O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 8, 29 e 53 horas.

FIGO. 2 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após tratamento com meio condicionado de células fracionadas de células H1299 infectadas com Adβgal. Células H1299 ingênuas foram semeadas em placas de 96 poços a uma confluência de 5% e sobrenadante pós C-100 (1ª série), pós C-3 (2ª série) ou pós C-3 + tratado termicamente (3ª série) de células H1299 não infectadas (1ª barra da esquerda em cada conjunto) ou infectadas com Adβgal (2ª barra). O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 19,25 horas.

FIGO. 3 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após tratamento com sobrenadante de células H1299 transfectadas transitoriamente com pIN2. Células H1299 ingênuas foram semeadas em placas de 96 poços em uma confluência de aproximadamente 5% e sobrenadante de células H1299 não transfectadas (quadrados fechados), células H1299 transitoriamente transfectadas com vetor de controle, p3'SS (círculos abertos), ou células H1299 transitoriamente transfectadas com pIN2 foi adicionado a cada poço. O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 24, 48, 72 e 96 horas.

FIGO. 4 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após tratamento com sobrenadante de células ITIC1 induzidas por IPTG. Células H1299 ingênuas foram semeadas em placas de 96 poços em uma confluência de aproximadamente 5% e sobrenadante de células H1299 não tratadas (1ª barra da esquerda) ou tratadas com IPTG (2ª barra) ou não tratadas (3ª barra), ou tratadas com IPTG ( 4ª barra) foram adicionadas células ITIC1. O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 8, 24, 48 e 72 horas.

FIGO. 5 - Inibição do crescimento de células tumorais com vários fenótipos de p53 após incubação com sobrenadante de células ITIC1 induzidas por IPTG. O sobrenadante de células H1299 após 24 (1ª barra da esquerda), ou 48 (2ª barra) horas, ou células ITIC1 induzidas por IPTG após 24 (3ª barra) ou 48 (4ª barra) horas foi adicionado a células tumorais ingênuas semeado em uma confluência de 5%. As linhas de células de carcinoma de pulmão de células não pequenas testadas foram: H1299 (p53 nulo), H460 (p53 wt), H226Br (p53 mutante), H322 (p53 mutante), H358 (p53 nulo) e Saos-2 (p53 nulo). O crescimento celular foi medido por incorporação de 3H-timidina às 24 e 48 horas e expresso como a percentagem de inibição do crescimento.

FIGO. 6 - Inibição do crescimento de fibroblastos após incubação com meio condicionado de células de células ITIC1 induzidas por IPTG. O sobrenadante foi coletado e passado através de uma membrana de corte de MW 3000. Meio fresco fracionado de (1ª barra da esquerda em cada conjunto), células H1299 tratadas com IPTG (2ª barra) ou células ITIC1 tratadas com IPTG foi adicionado a fibroblastos de prepúcio humano ingênuo a uma confluência de 1,5 × 103 células / ml. O crescimento celular foi medido por incorporação de 3H-timidina às 24 e 48 horas.

FIGO. 7 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após fracionamento de peso molecular bruto de meio condicionado de células. As células H1299 naive foram semeadas em placas de 96 poços a uma confluência de 5% e tratadas com sobrenadante não fracionado de células de controle. Os controles foram CCM de células H1299 não tratadas (1ª barra da esquerda) ou tratadas com IPTG (2ª barra) e células ITIC1 não tratadas (3ª barra) ou tratadas com IPTG (4ª barra). Da mesma forma, o sobrenadante fracionado de células ITIC1 induzidas por IPTG usando membranas de corte de peso molecular que isolaram frações de & gt50 MW (5ª bar), & lt50 MW (6ª bar), & gt30 MW (7ª bar), & lt30 MW (8ª bar) , & gt10 MW (9º bar), & lt10 MW (10º bar), & gt3 MW (11º bar) e & lt3 MW (12º bar) foram adicionados a células H1299 ingênuas. O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 48 horas.

FIGO. 8 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após fracionamento de peso molecular bruto por diálise de meio condicionado de células. Células H1299 ingênuas foram semeadas em placas de 96 poços a uma confluência de 5% e sobrenadante de células H1299 não tratadas (1ª barra da esquerda em cada conjunto), tratadas com IPTG (2ª barra), não tratadas (3ª barra) ou IPTG foram adicionadas células ITIC1 tratadas (4ª barra). O sobrenadante foi não fracionado (1 º conjunto) ou separado em frações de & gt2000 MW (2 º conjunto), & gt1000 MW (3 º conjunto) ou & gt500 MW (4 º conjunto). O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 48 horas.

FIGO. 9 - Inibição do crescimento de células H1299 naive após incubação com CCM tratada com protease ou nuclease a partir de células ITIC1 induzidas por IPTG.Células H1299 ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma confluência de 5% e o sobrenadante de células ITIC1 não induzidas (1ª barra da esquerda) ou induzidas por IPTG (2ª barra) foi adicionado. Antes da adição do sobrenadante, ele foi fracionado através de uma membrana de corte de MW 3000 e sem tratamento (1ª série), incubado a 37 ° C (2ª série), incubado a 45 ° C (3ª série), tratado com 18 μg proteinase K (4º conjunto), 197 μg proteinase K (5º conjunto), 60 μg de pronase (6º conjunto), 10 μg de benzonase (7º conjunto) ou 100 μg de benzonase (8º conjunto). O crescimento celular foi medido como incorporação de 3H-timidina às 48 horas.

FIGO. 10 - Inibição do crescimento de células HUVEC naive após adição de CCM de células ITIC1 induzidas por IPTG. As células HUVEC ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma concentração de 1000 células / poço. O CCM foi coletado de células ITIC1 que foram não induzidas ou induzidas por IPTG e uma porção do CCM foi subsequentemente fracionada ao longo de uma membrana de corte de peso molecular de 3 kD, o restante foi deixado não fracionado. CCM de células não induzidas não fracionadas (2ª barra da esquerda), células induzidas por IPTG não fracionadas (3ª barra), fração & lt3 kD de células não induzidas (4ª barra), fração & lt3 kD de células induzidas por IPTG (5ª barra), fração & gt3 kD ( Concentrado 5 vezes) de células não induzidas (6ª barra) e fração & gt3 kD (5 vezes concentrada) de células induzidas por IPTG (7ª barra) foi adicionado às células HUVEC. A inibição do crescimento foi medida em função da incorporação de timidina tritiada ao longo do tempo. Um controle negativo apenas de mídia também foi usado (1ª barra). Veja o Exemplo VII para detalhes experimentais.

FIGO. 11 - Inibição do crescimento de células FBHE naive após adição de CCM de células ITIC1 induzidas por IPTG. As células FBHE ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma concentração de 1000 células / poço. O CCM foi coletado de células ITIC1 que foram não induzidas ou induzidas por IPTG e subsequentemente fracionadas em uma membrana de corte de peso molecular de 3 kD. CCM de células não induzidas não fracionadas (2ª barra da esquerda), células induzidas por IPTG não fracionadas (3ª barra), fração & lt3 kD de células não induzidas (4ª barra), fração & lt3 kD de células induzidas por IPTG (5ª barra), fração & gt3 kD ( Concentrado 5 vezes) de células não induzidas (6ª barra) e fração & gt3 kD (5 vezes concentrada) de células induzidas por IPTG (7ª barra) foi adicionado às células FBHE. A inibição do crescimento foi medida em função da incorporação de timidina tritiada ao longo do tempo. Um controle negativo apenas da mídia também foi usado (1ª barra). Veja o Exemplo VII para detalhes experimentais.

FIGO. 12 - Inibição do crescimento de células HUVEC naive após adição de CCM de células H1299 transduzidas por Adp53. As células HUVEC ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma concentração de 1000 células / poço. O CCM foi coletado a partir de células H1299 que foram simuladas ou transduzidas com Adp53 e o CCM foi então fracionado em uma membrana de corte de peso molecular de 300 kD e / ou 3 kD. As células HUVEC ingênuas foram então tratadas apenas com meio (1ª barra da esquerda), CCM com transdução simulada de & lt300 kD (2ª barra), CCM transduzida com Adp53 de & lt300 kD (3ª barra), CCM com transdução simulada de & lt3 kD (4a bar), CCM transduzida por Adp53 de & lt3 kD (5a barra), CCM transduzida simulada concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (6a barra), ou CCM transduzida por Adp53 concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (7a barra) ) Veja o Exemplo VII para detalhes experimentais.

FIGO. 13 .-- Inibição do crescimento de células FBHE naive após adição de CCM de células H1299 transduzidas por Adp53. As células FBHE ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma concentração de 1000 células / poço. O CCM foi coletado a partir de células H1299 que foram simuladas ou transduzidas com Adp53, e o CCM foi então fracionado em uma membrana de corte de peso molecular de 300 kD e / ou 3 kD. As células FBHE ingênuas foram então tratadas apenas com meio (1ª barra da esquerda), CCM com transdução simulada de & lt300 kD (2ª barra), CCM transduzida com Adp53 de & lt300 kD (3ª barra), CCM com transdução simulada de & lt3 kD (4a bar), ou CCM transduzida por Adp53 de & lt3 kD (5a barra), CCM transduzida simulada concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (6a barra), ou CCM transduzida por Adp53 concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (7a Barra). Veja o Exemplo VII para detalhes experimentais.

FIGO. 14 - Inibição do crescimento de células EJG naive após adição de CCM de células H1299 transduzidas por Adp53. As células EJG ingênuas foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma concentração de 1000 células / poço. O CCM foi coletado a partir de células H1299 que foram simuladas ou transduzidas com Adp53, e o CCM foi então fracionado em uma membrana de corte de peso molecular de 300 kD e / ou 3 kD. As células EJG ingênuas foram então tratadas apenas com meio (1ª barra da esquerda), CCM simulada transduzida de & lt300 kD (2ª barra), CCM transduzida por Adp53 de & lt300 kD (3ª barra), CCM simulada transduzida de & lt3 kD (4a bar), ou CCM transduzida por Adp53 de & lt3 kD (5a barra), CCM transduzida simulada concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (6a barra), ou CCM transduzida por Adp53 concentrada 15 vezes de & gt3 mas & lt300 kD (7a Barra). Veja o Exemplo VII para detalhes experimentais.

DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS

O câncer é responsável pela morte de mais de meio milhão de pessoas a cada ano apenas nos Estados Unidos. As causas do câncer são multifatoriais, mas sabe-se que as aberrações nos mecanismos que controlam a morte celular, bem como a expressão regulada positivamente de certos genes, podem resultar no aumento da proliferação das células e, consequentemente, no desenvolvimento do estado neoplásico. As estratégias convencionais para o tratamento do câncer incluem radioterapia, quimioterapia e cirurgia, no entanto, essas modalidades de tratamento são limitadas e não são eficazes em alguns tumores. Mais recentemente, foi observado que o direcionamento de lesões genéticas específicas pode permitir a destruição seletiva de células tumorais enquanto limita os efeitos da toxicidade frequentemente associada à quimioterapia ou radioterapia. Essas novas terapias incluem a supressão de oncogenes ativados que impulsionam a proliferação de uma célula tumoral, bem como a restauração da atividade normal de genes supressores tumorais mutantes. A terapia gênica ainda sofre de várias limitações, e métodos para melhorar a eficácia da terapia gênica, bem como a eficácia de regimes terapêuticos mais padronizados, são necessários.

A presente invenção fornece uma nova abordagem para a terapia do câncer, bem como um meio de aumentar a eficácia das terapias existentes do câncer. A presente invenção se baseia, em parte, na observação de que as células tumorais manipuladas de uma maneira particular produzem um fator, encontrado no meio celular, que exibe um efeito antiproliferativo nas células vizinhas. Este fator foi parcialmente purificado e caracterizado.

O fator pode ser empregado de várias maneiras. Em primeiro lugar, o fator pode ser utilizado por si mesmo em um regime terapêutico pela administração do fator isolado a tumores ou outras células hiperproliferativas. Em segundo lugar, a utilização de certos protocolos irá induzir o fator, tal como o tratamento de células com um vetor viral ou plasmídeo, prevê-se que os vetores também codificarão um gene terapêutico que pode ter efeitos antiproliferativos adicionais nas células tratadas. Terceiro, o fator pode ser utilizado em combinação com quimio e radioterapia padrão, administrando o fator a um tumor ou outra célula hiperproliferativa antes, ao mesmo tempo ou após uma quimio ou radioterapia padrão. Quarto, é possível combinar o fator, terapia gênica e quimio ou radioterapia padrão em um único paciente.

Conforme descrito em maior detalhe abaixo, o fator foi identificado no meio celular de células tratadas com vários vetores virais e plasmídicos, onde os vetores expressam vários polipeptídeos exógenos. O termo tratado refere-se à colocação em estreita proximidade (i) de uma célula alvo e (ii) do vetor, de modo que a célula "absorva" ou internalize o vetor e expresse o produto do gene para o qual ele codifica. O peso molecular de um fator é inferior a cerca de 3 kDa, enquanto um segundo é inferior a cerca de 300 kDa. O fator é ainda caracterizado por sua capacidade de inibir o crescimento das células às quais é administrado.

No contexto da presente invenção, os alvos prováveis ​​para terapia baseada em fator são células hiperproliferativas, células essas que se referem não apenas a células cancerosas, mas também a células não malignas que proliferam a taxas maiores do que a taxa de morte celular. Tal terapia pode incluir modalidades ex vivo ou in vivo. Os detalhes dessas modalidades da presente invenção, bem como outras, são descritos em mais detalhes nas seções a seguir.

A. Regulação do crescimento celular

O crescimento celular normal é regulado por vários mecanismos. Lesão ou estresse em uma célula geralmente tem o efeito de prender as células em um ponto específico do ciclo celular para que as células possam se recuperar da lesão ou estresse. Vários fatores celulares são conhecidos por serem ativados ou produzidos em resposta ao estresse celular, incluindo, mas não se limitando a fatores induzidos como resultado de danos no DNA, tais como enzimas de reparo de DNA (dTMP sintetase, DNA polimerase B, topoismerase I, hMTII-A, DNA ligase IV, DNA ligase III, uracil DNA glicosilase, Ref-1), mediadores de apoptose (p53, bcl-2, WAF1, óxido nítrico) e vários segundos mensageiros.

Há algum tempo que se reconhece que os fosfolipídios desempenham um papel importante na regulação celular (Hannun e Bell, 1989). Muitos produtos de degradação de lipídios de membrana, incluindo, mas não se limitando a, diacilglicerol, fator de ativação plaquetária, ácido fosfatídico, ácido araquidônico, prostaglandinas, leucotrienos, eicosanóides, tromboxanos, lipoxinas, fosfatos de inositol e inositol glicanos são segundos mensageiros e mediadores importantes da transdução de sinal. Mais recentemente, a descoberta de que os produtos de degradação dos esfingofosfolipídios são biologicamente ativos gerou considerável interesse na capacidade dessas moléculas de regular a progressão ao longo do ciclo celular (Hannun e Bell, 1994). Esses produtos de degradação, incluindo, mas não se limitando a esfingosina e lisosfingolipídeos, são inibidores da proteína quinase C, uma enzima essencial na regulação celular e na transdução de sinal.

A ativação da esfingomielinase, um esfingolipídeo da membrana celular, resulta na produção de ceramida que atua como um segundo mensageiro para mediar os efeitos na parada, diferenciação e apoptose do ciclo celular. Pensa-se que a função celular normal da ceramida envolve a mediação dos efeitos de fatores antiproliferativos normais, como o fator de necrose tumoral-α. Além disso, a ceramida parece mediar as respostas antiproliferativas e induzir a parada do ciclo celular em resposta à lesão ou estresse celular, permitindo assim o reparo do DNA ou enviando a célula para a via de morte celular programada. Lesão celular leve ou estresse que resulta em níveis baixos de ceramida pode interromper o ciclo celular temporariamente para permitir que a célula se recupere e repare os danos, enquanto níveis mais elevados de lesão celular ou estresse podem induzir níveis mais elevados de ceramida que levariam à indução do via apoptótica para destruir a célula. Recentemente, foi demonstrado que em resposta ao estresse celular, a ceramida inicia a apoptose por meio da via da proteína quinase ativada por estresse (Verheij et al., 1996). Portanto, eventos que lesam ou exercem estresse sobre uma célula podem levar à indução de fatores celulares que medeiam a recuperação ou a destruição da célula afetada.

B. Fator antiproliferativo que suprime o crescimento celular e sua produção

As células cancerosas humanas contendo genes p53 mutantes ou deletados podem ser transduzidas com um vetor retroviral contendo uma proteína p53 de tipo selvagem, resultando em expressão estável de longo prazo da proteína p53 de tipo selvagem e subsequente parada de crescimento (Cai et al., 1993). Uma vez que os vetores virais são deficientes na replicação, nenhuma transmissão do vírus ocorre após a infecção inicial. A diminuição na proliferação celular observada em tais estudos foi maior do que o que teria sido previsto com base na eficiência de transdução calculada dos vetores retrovirais empregados, no entanto.

Quando as células transduzidas com Rv-p53 são misturadas com células não transduzidas, contendo p53 mutante ou deletado, uma redução no número de células e proliferação é observada, este fenômeno é referido como um "efeito espectador". Este efeito também pode ser alcançado misturando células não transduzidas contendo p53 mutante ou deletado com o sobrenadante de células infectadas com Rv-p53. Esse sobrenadante de meio é referido como meio "condicionado por células".

Além do vetor Rv-p53, as células produzem o fator quando tratadas com (i) um vetor adenoviral com defeito de replicação que expressa p53 de tipo selvagem, (ii) um vetor plasmídeo que expressa p53 de tipo selvagem e (iii) um vetor Ad que expressa β-galactosidase. Com base nessas observações, pareceria que o fator não é p53 ou um produto de degradação molecular dele. Além disso, o fato de o efeito ser observado com fibroblastos não malignos e positivos para p53 indica ainda um fenômeno não associado ao p53. Da mesma forma, parece que o fator não é de origem retroviral ou adenoviral.

Assim, a provável fonte candidata para o fator é a própria célula. O fator pode ser produzido pela célula em sua forma ativa. Alternativamente, pode ser sintetizado como um precursor que é processado à medida que passa pela maquinaria excretora da célula ou mesmo depois de estar fora da célula. Também pode ser um complexo de várias moléculas que são produzidas ao mesmo tempo ou em momentos diferentes após a introdução do vetor viral ou plasmídeo na célula. Esses componentes podem então ser montados interna ou externamente, ou ambos.

Curiosamente, a transfecção estável de células com um cassete de expressão lac-repressível que codifica p53 de tipo selvagem não parece induzir o efeito espectador, a menos que a expressão do transgene seja induzida pela adição de IPTG, que se liga ao repressor lac e estimula a transcrição. Essa observação sugere que a mera transferência de material genético para uma célula é insuficiente para produzir o fator, mas, possivelmente, onde também ocorre a expressão do transgene, esse tipo particular de estresse é suficiente para levar à indução da atividade do espectador.

Obviamente, onde se busca produzir uma grande quantidade do fator, as técnicas de cultura de células em grande escala entrarão em ação na produção ou em grandes quantidades de meio condicionado de células contendo fator. As técnicas de cultura de células de mamíferos primárias estão bem documentadas e são aqui divulgadas por referência (Freshner, 1992). Geralmente, as células animais podem ser propagadas in vitro em dois modos: como células não dependentes de ancoragem crescendo em suspensão ao longo da cultura ou como células dependentes de ancoragem que requerem ligação a um substrato sólido para sua propagação (ou seja, um tipo de monocamada de crescimento celular).

Culturas não dependentes de ancoragem ou culturas em suspensão de linhas celulares estabelecidas contínuas são os meios mais amplamente usados ​​de produção em larga escala de células e produtos celulares. No entanto, as células cultivadas em suspensão têm limitações, como menor produção de proteína do que as células aderentes.

A cultura de suspensão em grande escala de células de mamíferos em tanques agitados é um método comum para a produção de proteínas recombinantes. Dois projetos de reator de cultura em suspensão são amplamente utilizados - o reator agitado e o reator de transporte aéreo. O projeto agitado foi usado com sucesso em uma capacidade de 8.000 litros para a produção de interferon (Phillips et al., 1985 Mizrahi, 1983). As células são cultivadas em um tanque de aço inoxidável com uma relação altura-diâmetro de 1: 1 a 3: 1. A cultura é geralmente misturada com um ou mais agitadores, com base em discos laminados ou padrões de hélice marinha. Sistemas de agitador que oferecem menos forças de cisalhamento do que as lâminas foram descritos. A agitação pode ser conduzida direta ou indiretamente por unidades magneticamente acopladas. Os acionamentos indiretos reduzem o risco de contaminação microbiana por meio de vedações nos eixos do agitador.

O reator de transporte aéreo, também inicialmente descrito para fermentação microbiana e posteriormente adaptado para cultura de mamíferos, depende de uma corrente de gás para misturar e oxigenar a cultura. A corrente de gás entra em uma seção de riser do reator e conduz a circulação. O gás desengata na superfície da cultura, fazendo com que o líquido mais denso, livre de bolhas de gás, viaje para baixo na seção inferior do reator. A principal vantagem desse projeto é a simplicidade e a falta de necessidade de mistura mecânica. Normalmente, a relação altura-diâmetro é de 10: 1. O reator de transporte aéreo aumenta com relativa facilidade, tem boa transferência de massa de gases e gera forças de cisalhamento relativamente baixas.

eu. Determinando a "Atividade do Observador"

A atividade antiproliferativa, a atividade citostática e a atividade citotóxica podem ser medidas de várias maneiras. Normalmente, estudos de curso de tempo serão realizados e cada ponto de dados deve ser confirmado por amostras em duplicata ou triplicata. Em primeiro lugar, pode-se realizar contagens simples de células, geralmente realizadas em função do volume da unidade ou com base no número total de células em um recipiente de cultura. A contagem pode ser realizada por análise automatizada, como FACS, ou manualmente por métodos microscópicos. A coloração das células é opcional, mas pode melhorar a facilidade e a precisão de alguns métodos.

De preferência, a inibição da proliferação celular é medida por uma diminuição na incorporação de 3H-timidina. Um estudo típico mede os efeitos observados em meio condicionado de células obtido 24, 48 e 72 horas após a introdução de um plasmídeo transcricionalmente ativo ou vetor viral na célula. O fator parece ser bastante estável, pois sua atividade é retida em meio condicionado de células após 10 dias após a indução com IPTG. Portanto, os estudos não precisam ser realizados imediatamente. É também notado que a atividade do espectador é retida em meio condicionado de células por pelo menos 48 horas após a administração do meio condicionado de células a células não tratadas, permitindo a quantificação da absorção e / ou inativação por certas células.

ii. Fracionamento do tamanho do peso molecular

O fracionamento do meio condicionado de células em bruto em frações solúveis e insolúveis por centrifugação revelou que a atividade antiproliferativa é retida na fração solúvel do meio condicionado de células. O fracionamento do tamanho do meio condicionado de células usando membranas de corte de peso molecular de 300 kD, 100 kD, 50 kD, 30 kD, 10 kD e 3 kD revelou a presença do fator em todas as frações de ruptura, conforme indicado pela redução na proliferação de células tumorais contendo gene ou proteína p53 de tipo selvagem, mutante ou deletado. O fracionamento do meio condicionado de células por diálise através de membranas de aproximadamente 1000 Da e 500 Da de tamanho de poro isolou ainda uma atividade antiproliferativa de uma fração contendo moléculas de menos de 1000 Da, mas maiores que 500 Da. O fracionamento por HPLC adicional em uma coluna Pharmacia Biotech Superdex Peptide com uma faixa de separação efetiva de 100-7000 Da revelou a presença do antiproliferativo em frações de alta condutividade.

iii. Composição do Fator

O fator antiproliferativo é uma molécula pequena com base no fracionamento de tamanho e é improvável que seja de origem viral ou p53, com base na atividade de espectador demonstrável observada quando as células são colocadas em contato com vetores virais ou plasmídeos com ou sem p53. Além disso, os Western blots não revelaram evidências de p53 na fração solúvel do meio condicionado de células. Assim, é necessária uma caracterização adicional da composição do fator.

O tratamento de meio condicionado de células fracionadas contendo a atividade de espectador com benzonase, uma enzima que hidrolisa os ácidos nucléicos de fita simples e dupla, sugere que a atividade não é mediada por uma molécula de RNA ou DNA. No entanto, a modificação bioquímica de um ácido nucleico pela célula de modo que seja resistente a nucleases pode impedir a destruição completa de todos os ácidos nucleicos. Além disso, a atividade antiproliferativa pode ser efetuada por um oligonucleotídeo ou nucleotídeo modificado que não é afetado pela benzonase.

O tratamento de meio condicionado de células com várias proteases, incluindo tripsina, proteinase K e pronase, sugere que a atividade não é de natureza proteica. A pronase, que consiste essencialmente em uma mistura de proteases, deve degradar todos os polipeptídeos em aminoácidos individuais. A tripsina e a proteinase K clivam as ligações amida em locais de reconhecimento específicos e geram peptídeos curtos. No entanto, o fator antiproliferativo pode ser um peptídeo ou molécula proteica quimicamente modificada que é resistente às proteases listadas acima. Com base aproximadamente no fracionamento por tamanho, o tamanho de um peptídeo seria de cerca de 10-12 aminoácidos, mas pode ser consideravelmente maior ou menor devido à inconsistência do tamanho dos poros nas membranas de corte de peso molecular. É contemplado pelos inventores que, se de natureza proteica, o fator antiproliferativo pode estar entre um aminoácido e 50 aminoácidos. A modificação bioquímica de modo que grupos funcionais específicos sejam adicionados ou removidos dos resíduos de aminoácidos, incluindo, mas não se limitando a fosfatos, sulfatos e nitratos, pode resultar em um peptídeo resistente à degradação proteolítica. Da mesma forma, a adição ou deleção de alquil, alquenil, carboxil e outros grupos funcionais podem ser necessários para a ativação funcional do fator antiproliferativo.

4. Estabilidade do fator

A atividade biológica do fator antiproliferativo é muito estável. É resistente a mudanças físicas extremas, incluindo armazenamento de longo prazo e vários ciclos de congelamento / descongelamento a -80 ° C, armazenamento de curto prazo a 4 ° C e fervura a 100 ° C por 10 minutos. No entanto, é contemplado pelos inventores que tratamentos mais severos, como fervura por longos períodos de tempo, podem resultar na perda de atividade anti-proliferativa. A liofilização do meio de condição celular contendo o fator antiproliferativo não resulta em perda de atividade após reconstituição em solução aquosa. Além disso, parece ser estável dentro de uma faixa de pH de dois a 12. A atividade biológica não é retida na presença de pouco ou nenhum sal, conforme evidenciado pela diminuição da atividade antiproliferativa após a diálise contra água ou solução isotônica 1/10 . O fator antiproliferativo é concentrável em aproximadamente seis vezes e parece ter atividade intensificada em níveis de condutividade mais elevados, sugerindo que o fator é estabilizado por altas interações iônicas. Tais interações iônicas podem incluir pontes de sal ou ligação a íons metálicos, no entanto, alta condutividade não é necessária para a retenção da atividade antiproliferativa, uma vez que após a diálise em solução salina tamponada com fosfato, o fator ainda é capaz de suprimir o crescimento de células tumorais H1299 ingênuas.

V. Isolamento, Purificação e Detecção do Fator

Os métodos usados ​​no isolamento, purificação e identificação do fator antiproliferativo podem incluir quaisquer meios que são bem conhecidos na técnica. Os métodos podem ser, de um modo geral, divididos em três categorias diferentes. Essas categorias são métodos baseados nas características físicas, imunológicas e genéticas do fator. Os dois últimos são específicos do fator, ou seja, os reagentes devem ser adaptados ao próprio fator. Os métodos físicos podem ser específicos de um fator, mas não precisam ser. Uma quarta abordagem separativa busca, de fato, não separar fisicamente o fator, mas destruir quaisquer moléculas contaminantes. Isso pode ser realizado usando calor, congelamento, pH alto ou enzimas (lipases, glicosilases, DNAses, RNAses, proteases, etc.). Qualquer um dos métodos anteriores ou seguintes pode ser usado em combinação para produzir vários níveis de fator purificado a partir de uma fração celular em bruto, um fator parcialmente purificado a um fator purificado até a homogeneidade.

uma. Métodos de separação física

A separação do fator dos componentes não-fatoriais das células permitirá uma purificação e caracterização adicionais do fator. Isso pode ser realizado usando metodologia que diferencia as características físicas do fator (tamanho, carga, polaridade) e inclui várias técnicas cromatográficas, eletroforese em gel, partição química, destilação, cristalização e centrifugação.

A eletroforese em gel envolve a migração do fator através de um gel quando submetido a um campo elétrico. Geralmente, o gel é constituído por poliacrilamida ou agarose. A migração é geralmente baseada no tamanho (por exemplo, SDS-PAGE) ou no caráter iônico (focagem isoelétrica). Pode-se combinar dois procedimentos eletroforéticos diferentes realizando separações eletroforéticas bidimensionais em sequência enquanto gira o eixo de migração de 90 °.

Qualquer um de uma ampla variedade de procedimentos cromatográficos pode ser empregado. Por exemplo, podem ser empregues cromatografia de camada fina, cromatografia gasosa, cromatografia líquida de alta resolução, cromatografia em papel, cromatografia de afinidade ou pseudoafinidade, cromatografia de fluxo supercrítico, cromatografia em gel ou cromatografia de troca iônica.

A cromatografia de partição é baseada na teoria de que se duas fases estiverem em contato uma com a outra, e se uma ou ambas as fases constituírem um soluto, o soluto se distribuirá entre as duas fases. Normalmente, a cromatografia de partição emprega uma coluna que é preenchida com um sorvente e um solvente. A solução contendo o soluto é colocada em camadas no topo da coluna. O solvente é então passado pela coluna, continuamente, o que permite o movimento do soluto através do material da coluna. O soluto pode então ser coletado com base em sua taxa de movimento. Os dois tipos mais comuns de cromatógrafo de partição são o cromatógrafo de papel e o cromatógrafo de camada fina (TLC). Juntos, esses são chamados de cromatografia de adsorção. Em ambos os casos, a matriz contém um líquido ligado. Outros exemplos de cromatografia de partição são cromatografia gás-líquido e gel.

A cromatografia de papel é uma variante da cromatografia de partição executada em colunas de celulose na forma de uma folha de papel. A celulose contém uma grande quantidade de água ligada, mesmo quando seca extensivamente. A partição ocorre entre a água ligada e o solvente de desenvolvimento. Freqüentemente, o solvente usado é água. Normalmente, volumes muito pequenos da mistura da solução a ser separada são colocados no topo do papel e deixados secar. O capilar puxa o solvente através do papel, dissolve a amostra e move os componentes na direção do fluxo. Cromatogramas de papel podem ser desenvolvidos para fluxo de solvente ascendente ou descendente. As separações bidimensionais são permitidas alterando o eixo de migração 90 ° após a primeira execução.

A cromatografia em camada fina (TLC) é muito comumente usada para separar lipídios e, portanto, é considerada uma modalidade preferida da presente invenção. A TLC tem as vantagens da cromatografia em papel, mas permite o uso de qualquer substância que pode ser finamente dividida e formada em uma camada uniforme. Na TLC, a fase estacionária é uma camada de sorvente espalhada uniformemente sobre a superfície de uma placa de vidro ou plástico. As placas são geralmente feitas formando uma pasta de sorvente que é derramada sobre a superfície do gel após a criação de um poço, colocando fita a uma altura selecionada ao longo do perímetro da placa. Depois que o sorvente seca, a fita é removida e a placa é tratada como papel na cromatografia de papel. A amostra é aplicada e a placa é colocada em contato com um solvente. Uma vez que o solvente quase atingiu o fim da placa, a placa é removida e seca. Os pontos podem então ser identificados por fluorescência, identificação imunológica, contagem de radioatividade ou pulverizando reagentes variados na superfície para produzir uma mudança de cor.

Na cromatografia gás-líquido (GLC), a fase móvel é um gás e a fase estacionária é um líquido adsorvido na superfície interna de um tubo ou coluna ou em um suporte sólido. O líquido geralmente é aplicado como um sólido dissolvido em um solvente volátil, como o éter. A amostra, que pode ser qualquer amostra que pode ser volatilizada, é introduzida como um líquido com um gás inerte, como hélio, argônio ou nitrogênio, e então aquecida. Essa mistura gasosa passa pela tubulação. Os compostos vaporizados se redistribuem continuamente entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida, de acordo com seus coeficientes de partição.

A vantagem do GLC está na separação de pequenas moléculas. A sensibilidade e a velocidade são muito boas, com velocidades que se aproximam de 1000 vezes as da cromatografia líquida padrão. Usando um detector não destrutivo, o GLC pode ser usado preparativamente para purificar quantidades de gramas de material. O principal uso do GLC tem sido na separação de álcoois, ésteres, ácidos graxos e aminas.

A cromatografia em gel, ou cromatografia de peneira molecular, é um tipo especial de cromatografia de partição baseada no tamanho molecular. A teoria por trás da cromatografia em gel é que a coluna, que é preparada com minúsculas partículas de uma substância inerte que contém pequenos poros, separa moléculas maiores de moléculas menores conforme elas passam através ou ao redor dos poros, dependendo de seu tamanho. Desde que o material do qual as partículas são feitas não adsorva as moléculas, o único fator que determina a taxa de fluxo é o tamanho. Portanto, as moléculas são eluídas da coluna em tamanho decrescente, desde que a forma seja relativamente constante. A cromatografia em gel é insuperável para separar moléculas de tamanhos diferentes porque a separação é independente de todos os outros fatores, como pH, força iônica, temperatura, etc. Também não há praticamente nenhuma adsorção, menos propagação de zona e o volume de eluição está relacionado de forma simples a peso molecular.

O material de gel para cromatografia em gel é uma rede tridimensional cuja estrutura é geralmente aleatória. Os géis consistem em polímeros reticulados que geralmente são inertes, não se ligam ou reagem com o material sendo analisado e não têm carga. O espaço preenchido dentro do gel é preenchido com líquido e este líquido ocupa a maior parte do volume do gel. Os géis comuns são dextrano, agarose e poliacrilamida, eles são usados ​​para solução aquosa.

A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é caracterizada por uma separação muito rápida com resolução extraordinária de picos. Isso é obtido pelo uso de partículas muito finas e alta pressão para manter uma taxa de fluxo adequada. A separação pode ser realizada em questão de minutos ou no máximo uma hora. Além disso, apenas um volume muito pequeno da amostra é necessário porque as partículas são tão pequenas e compactadas que o volume vazio é uma fração muito pequena do volume do leito. Além disso, a concentração da amostra não precisa ser muito grande porque as bandas são tão estreitas que há muito pouca diluição da amostra.

A cromatografia de afinidade é um procedimento cromatográfico que se baseia na afinidade específica entre uma substância a ser isolada e uma molécula à qual ela pode se ligar especificamente. Esta é uma interação do tipo receptor-ligante. O material da coluna é sintetizado por acoplamento covalente de um dos parceiros de ligação a uma matriz insolúvel. O material da coluna é então capaz de adsorver especificamente a substância da solução. A eluição ocorre alterando as condições para aquelas em que a ligação não ocorrerá (alterar o pH, força iônica, temperatura, etc.).

A matriz deve ser uma substância que por si só não adsorva moléculas de forma significativa e que tenha uma ampla faixa de estabilidade química, física e térmica. O ligante deve ser acoplado de forma a não afetar suas propriedades de ligação. O ligando também deve fornecer uma ligação relativamente forte. E deve ser possível eluir a substância sem destruir a amostra ou o ligante. Uma das formas mais comuns de cromatografia de afinidade é a cromatografia de imunoafinidade. A geração de anticorpos que seriam adequados para uso de acordo com a presente invenção é discutida abaixo.

Partição química refere-se à tendência de um composto de se particionar com certos produtos químicos de natureza semelhante. Um exemplo clássico dessa abordagem é o uso de solventes orgânicos e inorgânicos para facilitar a partição de uma espécie química. Usando uma grande variedade de solventes diferentes, com propriedades químicas diferentes, é possível separar diferencialmente um composto químico. Outra forma de partição usa produtos químicos para resultar na separação de fases de um composto de interesse. Um exemplo clássico desta modalidade é o uso de sulfato de amônio para causar a precipitação de certas proteínas (por exemplo, anticorpos) de uma mistura complexa de proteínas. Outras versões desta abordagem são bem conhecidas dos versados ​​na técnica.

Ainda outro método para separar o fator envolve a centrifugação. A centrifugação envolve a separação das espécies com base em sua flutuabilidade / densidade específica ou raio hidrodinâmico. Vários solventes diferentes são usados, dependendo do efeito desejado. Por exemplo, CsCl e Percoll ™ formam soluções comuns para alcançar a separação centrífuga dependente da densidade. Gradientes de sacarose (passo ou contínuo) são usados ​​para explorar as diferenças na flutuabilidade. Outras soluções de centrifugação são conhecidas dos especialistas na técnica.

b. Anticorpos e métodos imunológicos

Os anticorpos contra o fator da presente invenção produzidos e isolados usando a metodologia descrita abaixo serão úteis na presente invenção, principalmente em ensaios para a detecção do fator e no isolamento do fator. Além disso, certos anticorpos podem provar ter atividade por conta própria. Os meios para preparar e caracterizar anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 aqui incorporado por referência).

Os métodos para gerar anticorpos monoclonais (MAbs) geralmente começam nas mesmas linhas que aqueles para preparar anticorpos policlonais. Resumidamente, um anticorpo policlonal é preparado imunizando um animal com uma composição imunogénica de acordo com a presente invenção e recolhendo anti-soros desse animal imunizado. Uma ampla gama de espécies animais pode ser usada para a produção de anti-soros. Normalmente, o animal usado para a produção de anti-anti-soros é um coelho, um camundongo, um rato, um hamster, uma cobaia ou uma cabra.

As composições imunogênicas do fator incluem preparações grosseiramente fracionadas, fator parcialmente purificado e o fator purificado até a homogeneidade. Como é bem conhecido na técnica, uma determinada composição pode variar em sua imunogenicidade. Muitas vezes é necessário, portanto, reforçar o sistema imunológico do hospedeiro, como pode ser conseguido por acoplamento de um imunógeno de peptídeo ou polipeptídeo a um transportador. Os veículos exemplares e preferidos são hemocianina de lapa (KLH) e albumina de soro bovino (BSA). Outras albuminas, como ovalbumina, albumina de soro de camundongo ou albumina de soro de coelho, também podem ser usadas como transportadores. Os meios para conjugar um composto com uma proteína transportadora são bem conhecidos na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimido e benzidina bis-biazotizada.

Como também é bem conhecido na técnica, a imunogenicidade de uma composição imunogênica particular pode ser aumentada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplares e preferidos incluem adjuvante de Freund completo (um estimulador não específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes de Freund incompletos e adjuvante de hidróxido de alumínio.

A quantidade de composição imunogênica usada na produção de anticorpos policlonais varia de acordo com a natureza do imunógeno, bem como do animal usado para a imunização. Uma variedade de vias pode ser usada para administrar o imunógeno (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostragem de sangue do animal imunizado em vários pontos após a imunização. Uma segunda injeção de reforço também pode ser administrada. O processo de reforço e titulação é repetido até que um título adequado seja alcançado. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e o soro isolado e armazenado, e / ou o animal pode ser usado para gerar MAbs.

Os MAbs podem ser facilmente preparados através da utilização de técnicas bem conhecidas, como as exemplificadas na Patente U.S. No. 4.196.265, aqui incorporada por referência. Normalmente, esta técnica envolve a imunização de um animal adequado com uma composição imunogênica selecionada, por exemplo, uma proteína purificada ou parcialmente purificada, polipeptídeo ou peptídeo. A composição imunizante é administrada de uma maneira eficaz para estimular células produtoras de anticorpos. Roedores como camundongos e ratos são animais preferidos, no entanto, o uso de células de coelho e rã de ovelha também é possível. O uso de ratos pode fornecer certas vantagens, mas os ratos são preferidos, com o rato BALB / c sendo o mais preferido, uma vez que é mais rotineiramente usado e geralmente dá uma maior porcentagem de fusões estáveis.

Após a imunização, células somáticas com potencial para produzir anticorpos, especificamente linfócitos B (células B), são selecionadas para uso no protocolo de geração de MAb. Essas células podem ser obtidas de baços, amígdalas ou nódulos linfáticos biopsiados ou de uma amostra de sangue periférico. As células do baço e as células do sangue periférico são preferidas, as primeiras porque são uma fonte rica de células produtoras de anticorpos que estão no estágio de plasmablasto em divisão, e as últimas porque o sangue periférico é facilmente acessível. Freqüentemente, um painel de animais terá sido imunizado e o baço do animal com o título de anticorpo mais alto será removido e os linfócitos do baço obtidos por homogeneização do baço com uma seringa. Normalmente, um baço de um camundongo imunizado contém aproximadamente 5 × 10 7 a 2 × 10 8 linfócitos.

Os linfócitos B produtores de anticorpos do animal imunizado são então fundidos com células de uma célula de mieloma imortal, geralmente uma da mesma espécie do animal que foi imunizado. As linhas celulares de mycloma adequadas para uso em procedimentos de fusão de produção de hibridoma são preferencialmente não produtoras de anticorpos, têm alta eficiência de fusão e deficiências enzimáticas que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas )

Qualquer uma de uma série de células de mieloma pode ser usada, como é conhecido pelos versados ​​na técnica (Campbell, pp. 75-83, 1984). Por exemplo, onde o animal imunizado é um camundongo, pode-se usar P3-X63 / Ag8, X63-Ag8.653, NS1 / 1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO / U, MPC-11, MPC11- X45-GTG 1.7 e S194 / 5XX0 Bul para ratos, pode-se usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210 e U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são todos úteis em conexão com fusões de células humanas.

Métodos para gerar híbridos de células de baço ou linfonodo produtoras de anticorpos e células de mieloma geralmente compreendem a mistura de células somáticas com células de mieloma em uma proporção de 2: 1, embora a proporção possa variar de cerca de 20: 1 a cerca de 1: 1, respectivamente, em a presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promovem a fusão das membranas celulares. Os métodos de fusão usando o vírus Sendai foram descritos por Kohler e Milstein (1976), e aqueles que usam polietilenoglicol (PEG), tais como 37% (v / v) PEG, por Gefter et al. (1977). O uso de métodos de fusão induzidos eletricamente também é apropriado.

Os procedimentos de fusão geralmente produzem híbridos viáveis ​​em baixas frequências, cerca de 1 × 10 -6 a 1 × 10 -8. No entanto, isso não representa um problema, pois os híbridos viáveis ​​e fundidos são diferenciados das células parentais não fundidas (particularmente as células de mieloma não fundidas que normalmente continuariam a se dividir indefinidamente) por cultura em um meio seletivo. O meio seletivo é geralmente aquele que contém um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleotídeos no meio de cultura de tecidos. Agentes exemplares e preferidos são aminopterina, metotrexato e azasserina. Aminopterina e o metotrexato bloqueiam a síntese de novo de purinas e pirimidinas, enquanto a azasserina bloqueia apenas a síntese de purinas. Onde aminopterina ou metotrexato é usado, o meio é suplementado com hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleotídeos (meio HAT). Onde a azasserina é usada, a mídia é suplementada com hipoxantina.

O meio de seleção preferido é HAT. Apenas as células capazes de operar as vias de recuperação de nucleotídeos são capazes de sobreviver em meio HAT. As células de mieloma são defeituosas em enzimas-chave da via de resgate, por exemplo, hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT) e não podem sobreviver. As células B podem operar essa via, mas têm uma vida útil limitada em cultura e geralmente morrem em cerca de duas semanas. Portanto, as únicas células que podem sobreviver no meio seletivo são aquelas híbridas formadas a partir de mieloma e células B.

Esta cultura fornece uma população de hibridomas a partir da qual hibridomas específicos são selecionados. Normalmente, a seleção de hibridomas é realizada cultivando as células por diluição de um único clone em placas de microtitulação, seguido pelo teste dos sobrenadantes clonais individuais (após cerca de duas a três semanas) quanto à reatividade desejada. O ensaio deve ser sensível, simples e rápido. Podem ser usados ​​radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, ensaios de citotoxicidade, ensaios de placa, ensaios de imunoligação de pontos e semelhantes.

Quando se deseja gerar um anticorpo com atividade definida, geralmente se rastreia os hibridomas candidatos para identificar aqueles hibridomas que produzem anticorpos que têm as propriedades inibitórias ou estimuladoras desejadas. Quaisquer hibridomas selecionados seriam então diluídos em série e clonados em linhas de células produtoras de anticorpos individuais, cujos clones podem então ser propagados indefinidamente para fornecer MAbs. As linhas celulares podem ser exploradas para a produção de MAb de duas maneiras básicas. Uma amostra do hibridoma pode ser injetada (geralmente na cavidade peritoneal) em um animal histocompatível do tipo que foi usado para fornecer as células somáticas e de mieloma para a fusão original. O animal injetado desenvolve tumores que secretam o anticorpo monoclonal específico produzido pelo híbrido de células fundidas. Os fluidos corporais do animal, como soro ou fluido ascítico, podem ser aproveitados para fornecer MAbs em alta concentração. As linhas celulares individuais também podem ser cultivadas in vitro, onde os MAbs são secretados naturalmente para o meio de cultura a partir do qual podem ser facilmente obtidos em altas concentrações. Os MAbs produzidos por qualquer um dos meios podem ser posteriormente purificados, se desejado, usando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos, tais como HPLC ou cromatografia de afinidade.

Os imunoensaios abrangidos pela presente invenção incluem, mas não estão limitados àqueles descritos na Pat. No. 4.367.110 (ensaio em sanduíche de anticorpo monoclonal duplo) e Pat. No. 4.452.901 (Western blot). Outros ensaios incluem imunoprecipitação de ligantes marcados e imunocitoquímica, tanto in vitro quanto in vivo.

Os imunoensaios, em seu sentido mais simples e direto, são ensaios de ligação. Certos imunoensaios preferidos são os vários tipos de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) e radioimunoensaios (RIA) conhecidos na técnica. A detecção imunohistoquímica usando seções de tecido também é particularmente útil.

É contemplado que os anticorpos podem ser gerados contra o fator antiproliferativo por quaisquer métodos que são bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a injetar uma fração isolada em coelhos ou camundongos para gerar soro policlonal. É ainda contemplado que em um ELISA, anticorpos reativos com o fator anti-proliferativo são imobilizados em uma superfície selecionada exibindo afinidade de proteína, tal como um poço em uma placa de microtitulação de poliestireno. Em seguida, uma composição de teste contendo o antígeno desejado, tal como um meio condicionado de células, é adicionada aos poços. Após ligação e lavagem para remover complexos imunes não especificamente ligados, o antígeno ligado pode ser detectado. A detecção é geralmente obtida pela adição de outro anticorpo, específico para o antígeno desejado, que está ligado a um marcador detectável. Este tipo de ELISA é um simples "ELISA sanduíche". A detecção também pode ser alcançada pela adição de um segundo anticorpo específico para o antígeno desejado, seguido pela adição de um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação para o segundo anticorpo, com o terceiro anticorpo sendo ligado a um marcador detectável.

As variações das técnicas de ELISA são conhecidas dos especialistas na técnica. Em uma dessas variações, as amostras contendo o antígeno desejado são imobilizadas na superfície do poço e, em seguida, colocadas em contato com os anticorpos da invenção. Após ligação e lavagem apropriada, os complexos imunes ligados são detectados. Quando os anticorpos específicos do antígeno iniciais estão ligados a um marcador detectável, os complexos imunes podem ser detectados diretamente. Novamente, os complexos imunes podem ser detectados usando um segundo anticorpo que tem afinidade de ligação para o primeiro anticorpo específico do antígeno, com o segundo anticorpo sendo ligado a um marcador detectável.

Os ELISAs de competição também são possíveis, nos quais as amostras de teste competem pela ligação com quantidades conhecidas de antígenos ou anticorpos marcados. A quantidade de espécies reativas na amostra desconhecida é determinada misturando a amostra com as espécies marcadas conhecidas antes ou durante a incubação com poços revestidos. A presença de espécies reativas na amostra atua para reduzir a quantidade de espécies marcadas disponíveis para ligação ao poço e, portanto, reduz o sinal final.

Independentemente do formato empregado, os ELISAs têm certas características em comum, tais como revestimento, incubação ou ligação, lavagem para remover espécies não especificamente ligadas e detecção de complexos imunes ligados. Eles são descritos a seguir.

O antígeno ou anticorpos também podem ser ligados a um suporte sólido, tal como na forma de placa, grânulos, vareta, membrana ou matriz de coluna, e a amostra a ser analisada aplicada ao antígeno ou anticorpo imobilizado. Ao revestir uma placa com antígeno ou anticorpo, geralmente os poços da placa são incubados com uma solução do antígeno ou anticorpo, durante a noite ou por um período especificado. Os poços da placa serão então lavados para remover o material não completamente adsorvido. Quaisquer superfícies restantes disponíveis dos poços são então "revestidas" com uma proteína não específica que é antigenicamente neutra em relação aos anti-soros de teste. Estes incluem albumina de soro bovino (BSA), caseína e soluções de leite em pó. O revestimento permite o bloqueio de locais de adsorção não específicos na superfície de imobilização e, assim, reduz o fundo causado pela ligação não específica de anti-soros à superfície.

Em ELISAs, é provavelmente mais comum usar um meio de detecção secundário ou terciário em vez de um procedimento direto. Assim, após a ligação do antígeno ou anticorpo ao poço, revestimento com um material não reativo para reduzir o fundo e lavagem para remover o material não ligado, a superfície de imobilização é colocada em contato com a amostra clínica ou biológica a ser testada sob condições eficazes para permitir formação de imunocomplexos (antígeno / anticorpo). A detecção do complexo imune requer então um ligante de ligação secundária marcado ou anticorpo, ou um ligante de ligação secundária ou anticorpo em conjunto com um anticorpo terciário marcado ou terceiro ligante de ligação.

"Em condições eficazes para permitir a formação de imunocomplexos (antígeno / anticorpo)" significa que as condições incluem preferencialmente a diluição dos antígenos e anticorpos com soluções tais como BSA, gamaglobulina bovina (BGG) e solução salina tamponada com fosfato (PBS) / Tween. Esses agentes adicionados também tendem a auxiliar na redução do background inespecífico.

As condições adequadas também significam que a incubação está a uma temperatura e por um período de tempo suficiente para permitir a ligação eficaz. As etapas de incubação são tipicamente de cerca de 1 a 2 a 4 horas, a temperaturas preferencialmente na ordem de 25 ° a 27 ° C, ou podem ser durante a noite a cerca de 4 ° C.

Após todas as etapas de incubação em um ELISA, a superfície de contato é lavada de modo a remover o material não complexado. A lavagem geralmente inclui a lavagem com uma solução de PBS / Tween ou tampão borato. Após a formação de complexos imunes específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado, e subsequente lavagem, a ocorrência de quantidades mínimas de complexos imunes pode ser determinada.

Para fornecer um meio de detecção, o segundo ou terceiro anticorpo terá um marcador associado para permitir a detecção. De preferência, esta será uma enzima que irá gerar desenvolvimento de cor após incubação com um substrato cromogênico apropriado. Assim, por exemplo, será desejável entrar em contato e incubar o primeiro ou segundo complexo imune com uma urease, glicose oxidase, fosfatase alcalina ou anticorpo conjugado com peroxidase de hidrogênio por um período de tempo e sob condições que favoreçam o desenvolvimento de formação de complexo imunológico adicional , por exemplo, incubação por 2 horas à temperatura ambiente em uma solução contendo PBS, como PBS / Tween.

Após a incubação com o anticorpo marcado e subsequente à lavagem para remover o material não ligado, a quantidade de marcador é quantificada, por exemplo, por incubação com um substrato cromogênico, como uréia e roxo de bromocresol ou 2,2'-azino-di- (3- ácido etil-benztiazolina-6-sulfônico [ABTS] e H2 O2, no caso da peroxidase como marcador da enzima. A quantificação é então alcançada medindo o grau de geração de cor, por exemplo, usando um espectrofotômetro de espectro visível.

Alternativamente, o marcador pode ser quimioluminescente. O uso de tais marcadores é descrito na Pat. Nos. 5.310.687, 5.238.808 e 5.221.605.

Os ensaios para a produção de fator antiproliferativo por uma célula também podem ser determinados em tecido normal / anormal para fins de diagnóstico e como uma medida da eficácia da indução do fator. Os métodos para análise in vitro e in situ são bem conhecidos e envolvem a avaliação da ligação de anticorpos específicos do antígeno a tecidos, células ou extratos celulares. Estas são técnicas convencionais bem ao alcance dos especialistas na técnica. Por exemplo, os anticorpos para o fator antiproliferativo podem ser usados ​​em conjunto com blocos de tecido embebidos em parafina, congelados de fresco e fixados em formalina, preparados para estudo por imunohistoquímica (IHC). Cada bloco de tecido pode consistir em 50 mg de tumor residual "pulverizado". O método de preparação de blocos de tecido a partir desses espécimes particulados foi usado com sucesso em estudos IHC anteriores de vários fatores prognósticos, por exemplo, no câncer de mama, e é bem conhecido pelos versados ​​na técnica. (Abbondanzo et al., 1990 Allred et al., 1990 Brown et al., 1990).

Resumidamente, as seções congeladas podem ser preparadas reidratando 50 ng de tumor pulverizado congelado à temperatura ambiente em PBS em pequenas cápsulas de plástico peletizando as partículas por centrifugação, ressuspendendo-as em um meio de incorporação viscoso (OCT) invertendo a cápsula e peletizando novamente por centrifugação congelamento em -70 ° C isopentano cortando a cápsula de plástico e removendo o cilindro congelado de tecido prendendo o cilindro de tecido em um mandril de micrótomo criostático e cortando 25-50 seções em série contendo uma média de cerca de 500 células tumorais notavelmente intactas.

As seções permanentes podem ser preparadas por um método semelhante envolvendo a reidratação da amostra de 50 mg em um tubo de microcentrífuga de plástico ressuspenso em formalina a 10% por 4 horas, lavagem de fixação / peletização, ressuspensão em agar quente 2,5% resfriamento em água gelada para endurecer o ágar remoção do bloco de tecido / ágar do tubo, infiltrando e embutindo o bloco em parafina e cortando até 50 seções permanentes em série.

c. Técnicas de Southern e Northern Blotting: PCR

Southern e Northern blotting são técnicas comumente usadas em biologia molecular e bem conhecidas ao alcance de um versado na técnica.

Para Southern blots, o DNA das células de teste é recuperado por ruptura celular suave na presença de um quelante de cátions, como o EDTA. As proteínas e outros meios celulares são removidos por mistura com fenol saturado ou fenol / clorofórmio e centrifugação da emulsão. O DNA está na fase aquosa superior, é desproteinizado e misturado com etanol. Esta solução permite que o DNA precipite, e o DNA pode então ser recuperado usando centrifugação.

A eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida é a forma mais comum de separar as moléculas de DNA. O Southern blotting confirmará a identidade do DNA que codifica o fator antiproliferativo. Isso é conseguido transferindo o DNA do gel intacto para o papel de nitrocelulose. O papel de nitrocelulose é então lavado em tampão que tem, por exemplo, um cDNA radiomarcado contendo uma sequência complementar ao DNA do fator antiproliferativo. Tais sondas podem ser identificadas por meio de sequenciamento direto de proteínas ou fragmentos das mesmas e triagem de biblioteca genômica. A sonda liga-se especificamente ao DNA que codifica pelo menos uma porção do fator antiproliferativo e pode ser detectada usando autorradiografia por contato do papel de nitrocelulose com filme fotográfico.

O fator anti-proliferativo que codifica o mRNA pode ser detectado de maneira semelhante por um processo conhecido como Northern blotting. Para uma descrição mais detalhada de tampões, preparação de gel, condições de eletroforese, etc., o especialista na técnica é referido como Sambrook et al. (1989).

O PCR é uma ferramenta poderosa na biologia analítica moderna. São projetadas sequências curtas de oligonucleotídeos geralmente de 15-35 bp de comprimento, homólogas às regiões flanqueadoras de ambos os lados das sequências a serem amplificadas. Os primers são adicionados em excesso ao DNA de origem, na presença de tampão, enzima e nucleotídeos livres. O DNA fonte é desnaturado a 9520 ° C e então resfriado a 40-5020 ° C para permitir que os primers se emparelhem. A temperatura é ajustada para a temperatura ideal para a polimerase para uma fase de extensão. Este ciclo é repetido 25-40 vezes. A técnica de PCR é bem conhecida e os métodos aqui divulgados podem ser facilmente adaptados para cada situação única por um especialista na técnica.

Quaisquer outros métodos que são conhecidos pelos versados ​​na técnica podem ser empregados para o isolamento, purificação e identificação do fator antiproliferativo incluindo, mas não se limitando a técnicas envolvendo separação de fase orgânica e solúvel, cromatografia em coluna usando lectinas, anticorpos, íons resinas de troca, outras matrizes de separação ou etiquetas reativas com espécies químicas específicas, análise de HPLC e espectrofotometria. É também contemplado pelos inventores que uma vez que o fator anti-proliferativo é identificado, ele pode ser rotineiramente isolado de células que foram induzidas para sintetizá-lo biologicamente ou sintetizado quimicamente por qualquer um dos vários meios bem conhecidos, incluindo oligonucleotídeo, peptídeo ou síntese química orgânica .

C. Tratamento de cânceres usando o fator antiproliferativo

Um sujeito que apresenta uma malignidade pode ser tratado com o fator antiproliferativo da presente invenção. Os pacientes podem, mas não precisam, ter recebido quimio-, radioterapia ou terapias genéticas. Idealmente, os pacientes terão função da medula óssea adequada (definida como contagem absoluta de granulócitos periféricos de & gt2.000 / mm 3 e contagem de plaquetas de 100.000 / mm 3), função hepática adequada (bilirrubina ≤1,5 ​​mg / dl) e função renal adequada (creatina & lt1,5 mg / dl). A determinação da adequação para o tratamento, em última análise, caberá ao médico assistente.

O paciente será tratado com uma forma farmaceuticamente aceitável de fator antiproliferativo ou um análogo funcional do mesmo. Esta administração pode ser na forma de, por exemplo, uma injeção intratumoral, ou na verdade qualquer outro método de aplicação que é rotineiramente usado e bem conhecido por um versado na técnica, por exemplo, sistêmica ou intravenosa. Obviamente, a melhor maneira pela qual um determinado tumor é tratado dependerá de sua localização e caráter (por exemplo, invasivo, vascularizado, necrótico). Uma biópsia das lesões a serem injetadas pode ser realizada e o tecido armazenado para análises imunohistoquímicas.

A dose unitária de fator antiproliferativo tipicamente será reconstituída em uma forma farmaceuticamente aceitável imediatamente antes de, ou, devido à estabilidade observada do fator antiproliferativo, dias a semanas antes da administração. A dose inicial pode variar dependendo da atividade específica da preparação particular do fator anti-proliferativo, tamanho do tumor, a taxa na qual o tumor está crescendo, etc. Prevê-se que o tratamento será administrado durante um período de tempo típico de terapias convencionais contra o câncer variando de doses únicas a múltiplas. Durante este tempo, o paciente será monitorado quanto à ausência de progressão tumoral, resposta ou toxicidade e as doses ajustadas de acordo.

eu. Composições farmacêuticas e vias de administração

As composições aquosas da presente invenção terão uma quantidade eficaz do fator ou fatores. Uma quantidade eficaz é definida como a quantidade do fator que alcançará um efeito detectável, como citotoxicidade, citostaticidade ou bloqueio da proliferação celular. Essas composições serão geralmente dissolvidas ou dispersas em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável.

As frases "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitáveis" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal ou humano, conforme apropriado. Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com os ingredientes ativos, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares, como outros agentes anticâncer, também podem ser incorporados nas composições.

Além dos compostos formulados para administração parenteral, tais como aqueles para injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis ​​incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para cápsulas de liberação de tempo de administração oral e qualquer outra forma atualmente usada, incluindo cremes, loções, colutórios , inalantes e semelhantes.

Os compostos activos da presente invenção serão frequentemente formulados para administração parentérica, por exemplo, formulados para injecção por via intravenosa, intramuscular, subcutânea ou mesmo intraperitoneal. A preparação de uma composição aquosa que contém um composto ou compostos que diminuem a taxa de proliferação de células estará dentro dos versados ​​na técnica, à luz da presente divulgação. Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões, formas sólidas adequadas para uso na preparação de soluções ou suspensões após a adição de um líquido antes da injeção também podem ser preparadas e as preparações também podem ser emulsionadas.

As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis ​​podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou formulações de dispersões incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis ​​estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida ao ponto de permitir uma fácil seringa. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos.

Os compostos ativos podem ser formulados em uma composição em uma forma neutra ou salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis ​​incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico , e similar. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.

O transportador também pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis ​​pode ser conseguida pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis ​​estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis ​​estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a vácuo e de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.

Em certos casos, as formulações terapêuticas da invenção também podem ser preparadas em formas adequadas para administração tópica, como em cremes e loções. Essas formas podem ser usadas para tratar doenças associadas à pele, como vários sarcomas.

Após a formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis ​​descritas acima, mesmo com cápsulas de liberação de fármaco e similares sendo empregáveis.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos pelos versados ​​na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do sujeito a ser tratado. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o sujeito individual.

Todos os materiais e reagentes essenciais necessários para a administração do fator antiproliferativo podem ser reunidos em um kit. Quando os componentes do kit são fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, a solução líquida é preferencialmente uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferida.

Para uso in vivo, conforme discutido abaixo, o fator pode ser fornecido em combinação com um vetor de terapia genética ou agente quimio ou radioterapêutico. Estes normalmente serão uma formulação separada, mas podem ser formulados em uma única composição farmaceuticamente aceitável. O recipiente pode ser ele próprio equipado para administração, tal como um inalante, seringa, pipeta, conta-gotas ou outro aparelho semelhante, a partir do qual a formulação pode ser aplicada a uma área infectada do corpo, como os pulmões, ou injetada em um animal, ou mesmo aplicado e misturado com os outros componentes do kit.

As composições desses kits também podem ser fornecidas em formas secas ou liofilizadas. Quando os reagentes ou componentes são fornecidos na forma seca, a reconstituição geralmente é pela adição de um solvente adequado. Prevê-se que o solvente também pode ser fornecido em outros meios de recipiente. Os kits da invenção também podem incluir uma folha de instruções definindo a administração do agente e explicando como o agente diminuirá a proliferação de células e explicando como a expressão dos agentes de terapia gênica faz com que o fator anti-proliferativo seja produzido.

Os kits da presente invenção também incluirão tipicamente um meio para conter os frascos em confinamento fechado para venda comercial, tal como, por exemplo, injeção ou recipientes de plástico moldado por sopro nos quais os frascos desejados são retidos. Independentemente do número ou tipo de recipientes, os kits da invenção também podem compreender, ou ser embalados com um instrumento separado para auxiliar na injeção / administração ou colocação da composição do complexo final dentro do corpo de um animal. Tal instrumento pode ser um inalante, seringa, pipeta, fórceps, colher medida, conta-gotas ou qualquer um desses veículos de distribuição aprovados medicamente. Outra instrumentação inclui dispositivos que permitem a leitura ou monitoramento de reações in vitro.

D. Tratamento de células usando fator antiproliferativo em combinação com terapia gênica

Em uma modalidade separada da presente invenção, prevê-se que o fator antiproliferativo será usado em combinação com terapia genética convencional no tratamento de câncer e outros distúrbios proliferativos celulares.

É claro que a entrega de um plasmídeo ou vetor viral que codifica um gene em uma célula pode resultar na produção de um fator antiproliferativo. Como afirmado acima, em uma modalidade da invenção, o fator antiproliferativo é produzido, isolado e administrado às células. Em ainda outra versão, no entanto, o fator é usado junto com um plasmídeo ou vetor viral que codifica um gene. Isso pode ser feito de duas maneiras. Em primeiro lugar, o fator pode ser isolado conforme descrito e, em seguida, contatado com uma célula que tem, é ou será tratada de acordo com um protocolo de terapia gênica. Assim, a produção do fator como resultado da terapia com transgene não é necessária. Alternativamente, o fator pode ser induzido pela administração do vetor de terapia gênica.

Prevê-se que o vetor de terapia gênica pode codificar p53, no caso de terapia gênica de cânceres com mutação de p53, ou algum outro gene apropriado específico para um determinado câncer ou distúrbio proliferativo. Outros genes atualmente em uso ou contemplados para uso no tratamento de câncer incluem, mas não estão limitados a C-CAM, RB, p16 INK4, p21 WAF1, WT-1, BRCA-1, BRCA-2, bcr-abl, HSV- tk, HLA-B7, K-ras antisense, antisense-myc, antisense-fos, anti-IGF-1, IL-2 e citosina desaminase. Como afirmado acima, o fator antiproliferativo pode ser administrado concomitantemente com a terapia gênica, antes da terapia gênica ou após a terapia gênica. Todos os componentes da terapia gênica e as composições de fator antiproliferativo terapêutico podem ser colocados juntos na forma de kit como descrito acima. Os elementos utilizados para a indução do fator e / ou terapia gênica são descritos abaixo.

Ao longo deste pedido, o termo "construção de expressão" pretende incluir qualquer tipo de construção genética contendo uma codificação de ácido nucleico para um produto gênico em que parte ou toda a sequência de codificação é capaz de ser transcrita e subsequentemente traduzida em uma proteína.

Para que a construção efetue a expressão de um transcrito de gene, o polinucleotídeo que codifica o gene estará sob o controle transcricional de um promotor. Um "promotor" refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula hospedeira, ou maquinaria sintética introduzida, que é necessária para iniciar a transcrição específica de um gene. A frase "sob controle da transcrição" significa que o promotor está na localização correta em relação ao polinucleotídeo para controlar a iniciação da RNA polimerase e a expressão do polinucleotídeo.

O termo promotor será usado aqui para se referir a um grupo de módulos de controle da transcrição que estão agrupados em torno do local de iniciação para a RNA polimerase II. Muito do pensamento sobre como os promotores são organizados deriva de análises de vários promotores virais, incluindo aqueles para a timidina quinase do HSV (tk) e unidades de transcrição precoce do SV40. Esses estudos, aumentados por trabalhos mais recentes, mostraram que os promotores são compostos de módulos funcionais discretos, cada um consistindo de aproximadamente 7-20 pb de DNA e contendo um ou mais locais de reconhecimento para proteínas ativadoras ou repressoras da transcrição.

Pelo menos um módulo em cada função do promotor para posicionar o local de início para a síntese de RNA. O exemplo mais conhecido disso é a caixa TATÁ, mas em alguns promotores sem uma caixa TATÁ, como o promotor para o gene de desoxinucleotidil transferase terminal de mamífero e o promotor para os genes tardios de SV40, um elemento discreto sobreposto ao próprio local de início ajuda a fixe o local de iniciação.

Elementos promotores adicionais regulam a frequência de iniciação da transcrição. Normalmente, estes estão localizados na região 30-110 pb a montante do local de início, embora vários promotores tenham recentemente demonstrado conter também elementos funcionais a jusante do local de início. O espaçamento entre os elementos do promotor frequentemente é flexível, de modo que a função do promotor é preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor tk, o espaçamento entre os elementos do promotor pode ser aumentado para 50 bp antes que a atividade comece a diminuir. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição.

O promotor particular que é empregado para controlar a expressão de um polinucleotídeo não é considerado crítico, desde que seja capaz de expressar o polinucleotídeo na célula-alvo. Assim, quando uma célula humana é direcionada, é preferível posicionar a região de codificação do polinucleotídeo adjacente a e sob o controle de um promotor que seja capaz de ser expresso em uma célula humana. De um modo geral, esse promotor pode incluir um promotor humano ou viral.

Em várias modalidades, o promotor do gene precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV), o promotor precoce do SV40 e a repetição do terminal longo do vírus do sarcoma de Rous podem ser usados ​​para obter a expressão de alto nível do gene p53 ou polinucleotídeo. A utilização de outros promotores de fago bacteriano ou celular viral ou de mamífero que são bem conhecidos na técnica para alcançar a expressão de polinucleotídeos também é contemplada, desde que os níveis de expressão sejam suficientes para produzir um efeito inibidor do crescimento.

Ao empregar um promotor com propriedades bem conhecidas, o nível e o padrão de expressão de um polinucleotídeo após a transfecção podem ser otimizados. Por exemplo, a seleção de um promotor que é ativo em células específicas, tais como tirosinase (melanoma), alfa-fetoproteína e albumina (tumores do fígado), CC10 (tumor de pulmão) e antígeno específico da próstata (tumor da próstata) permitirá tecido específico expressão dos polinucleotídeos. A Tabela 1 lista vários elementos / promotores que podem ser empregados, no contexto da presente invenção, para regular a expressão de construções genéticas. Esta lista não pretende ser exaustiva de todos os elementos possíveis envolvidos na promoção da expressão gênica, mas apenas exemplificativa.

Os potenciadores foram originalmente detectados como elementos genéticos que aumentavam a transcrição de um promotor localizado em uma posição distante na mesma molécula de DNA. Essa capacidade de agir em uma grande distância teve poucos precedentes nos estudos clássicos de regulação da transcrição procariótica. O trabalho subsequente mostrou que as regiões do DNA com atividade intensificadora são organizadas de maneira muito semelhante aos promotores. Ou seja, eles são compostos de muitos elementos individuais, cada um dos quais se liga a uma ou mais proteínas transcricionais.

A distinção básica entre potenciadores e promotores é operacional. Uma região intensificadora como um todo deve ser capaz de estimular a transcrição à distância, o que não precisa ser verdade para uma região promotora ou seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor deve ter um ou mais elementos que direcionam a iniciação da síntese de RNA em um local específico e em uma orientação específica, enquanto os intensificadores não possuem essas especificidades. Os promotores e potencializadores são frequentemente sobrepostos e contíguos, muitas vezes parecendo ter uma organização modular muito semelhante.


PRINCÍPIOS DE MICRODISSECÇÃO A LASER

Um instrumento LMD típico consiste em um microscópio de pesquisa invertido ou vertical equipado com uma câmera CCD e um estágio motorizado controlado por computador. A imagem do microscópio da amostra selecionada para microdissecção é geralmente observável em um monitor colorido de computador e sobreposta com a interface do usuário do software de microdissecção a laser. O posicionamento do micro feixe de laser é feito através do computador via joystick. As células ou fragmentos de tecido desejados para colheita são marcados e cortados manualmente ou automaticamente, movendo a luz laser ao longo de um caminho definido pelo usuário ou padrão geométrico. O processo de corte pode ser acompanhado no monitor do computador em tempo real. O tamanho do ponto, a energia, a duração do pulso e, em alguns instrumentos também, o foco preciso do laser podem ser selecionados para cortes de precisão fina. A maioria dos instrumentos permite a destruição seletiva de células indesejadas, aplicando alguns disparos de laser ao redor do fragmento desejado e, assim, preparando uma lacuna bem definida entre os materiais desejados e indesejados. Dependendo do método de microdissecção a laser usado, a amostra dissecada é transferida para um frasco de coleta. Para confirmar o sucesso dos processos de microdissecção e transferência, os instrumentos LMD fornecem uma maneira de inspecionar visualmente o frasco de coleta com a amostra microdissecada e os remendos vazios na seção de tecido correspondente. Uma vez verificada a identidade e qualidade corretas das áreas microdissecadas, uma estação de trabalho de arquivo permite a documentação fotográfica.

No momento, existem cinco sistemas microdissetores a laser diferentes amplamente disponíveis (Tabela 1). Os diferentes microdissetores de laser podem ser categorizados pelo tipo de laser usado e pelo método como a amostra dissecada é capturada.

Parâmetros Fabricante
PALM (5) Leica (6) Arcturus (7) Máquinas moleculares e indústrias (8) Cell Robotics International (9)
Plataforma de microscópio Microscópio invertido Microscópio vertical Microscópio invertido Microscópio invertido Microscópio invertido
Tipo de luz laser (comprimento de onda) Laser UVa pulsado (337 nm) Laser UV de estado sólido (355 nm) Laser de diodo próximo ao infravermelho de estado sólido (812 nm) Laser UV de estado sólido (~ 350 nm) Laser UVa pulsado (337 nm)
Recuperação de amostra Ejeção da amostra microdissecada em uma tampa de microcentrífuga localizada acima da amostra A amostra microdissecada cai pela força da gravidade em uma tampa de microcentrífuga localizada abaixo da amostra As peças microdisseccionadas aderem a uma tampa de microcentrífuga com revestimento termoplástico que pode ser levantada da amostra Os espécimes são montados em uma estrutura coberta por membrana e uma lâmina de vidro colocada no topo. A tampa de isolamento repousa sobre a membrana e removida com a amostra microdissecada As amostras são montadas em uma lâmina de microscópio especialmente revestida e um receptáculo é colocado no topo. A separação de fragmentos é possibilitada pela ação de forças eletrostáticas entre as lâminas e a tampa do coletor
Mecanismo de foco a laser / tamanho do ponto de laser Mecânica e óptica / 1 μm Ótico / 4–5 μm (± 0,6 μm) Mecânica e óptica / 7,5–30 μm Mecânica e óptica / 1 μm Mecânica e óptica / 1 μm

Com exceção do microdissetor PixCell® da Arcturus, que usa um laser infravermelho (IR), todos esses sistemas são equipados com uma fonte de luz laser UV pulsada. A luz do laser é trazida para as amostras através das objetivas do microscópio ou de uma fonte separada montada no topo. Para um corte preciso, o feixe de laser é focalizado através da ótica do microscópio ou de peças mecânicas especialmente projetadas. O comprimento de onda mais curto dos sistemas UV permite o foco da luz do laser na faixa sub-mícron, enquanto o diâmetro de foco do feixe de laser IR no sistema Arcturus pode ser ajustado de 7,5 (aproximadamente o tamanho de uma célula) a 30 μm.Embora a largura de foco mais estreita dos lasers UV permita um corte mais preciso e, portanto, microdissecção de célula única ou subcelular, havia preocupações sobre o impacto da luz UV nas macromoléculas celulares. Mais recentemente, vários estudos foram publicados mostrando que a faixa de UV-A (320-400 nm), onde esses sistemas operam, não está mudando ou prejudicando os ácidos nucléicos e outras biomoléculas celulares, já que seus picos de absorção estão bem fora desta região (10 , 11). Enquanto, no dispositivo PixCell da Arcturus, por causa da menor energia dos lasers IR, o efeito de dano fotoquímico é menos problemático, mas o que poderia potencialmente prejudicar as células é o calor gerado pela absorção do comprimento de onda do laser IR. No entanto, de acordo com alguns estudos, o efeito térmico que atinge o tecido é transitório (dura apenas alguns milissegundos) e leve, portanto, o conteúdo de DNA, RNA ou proteína da célula não é alterado de forma mensurável (12, 13 )

O que mais determina como o espécime dissecado é coletado é o arranjo espacial do palco, o coletor de espécimes e a luz do laser. No sistema de microscópio invertido da PALM, o coletor de amostras fica acima do palco e a luz do laser vem da parte inferior através da ótica do microscópio. Assim, após o corte, os espécimes isolados precisam ser ejetados para fora do plano do objeto, o que é feito com a ajuda de um único pulso de laser desfocado. A força de pressão do gás que se desenvolve sob a amostra dissecada empurra-a para fora e a transporta por distâncias centimétricas até um frasco de coleta comum acima do palco. O microdissetor de Lecia usa uma arquitetura de microscópio vertical com o laser vindo do topo através das objetivas do microscópio e o coletor de amostra está localizado logo abaixo do palco. O material dissecado neste dispositivo simplesmente cai no receptáculo pela força da gravidade, sem a necessidade de quaisquer forças físicas adicionais. O design do sistema de microscópio invertido do Arcturus é tal que o laser, montado acima do palco, tem que ser direcionado através de tampas especialmente desenvolvidas que são revestidas com um filme termoplástico. As tampas de coleta são colocadas diretamente no topo da amostra e, assim, quando o laser derreteu o filme nas células de interesse, elas permanecem fixadas e podem ser levantadas com a tampa para análise posterior. Alegadamente, a técnica de fusão aplicada no sistema Arcturus apresenta maior risco de contaminação com material não selecionado aderido ao filme adesivo (14). A MMI estreou recentemente com seu novo microdissetor μCUT, construído em torno de um sistema de microscópio invertido. Em resumo, o princípio de seu procedimento de microdissecção é que a amostra seja colocada em um suporte especial, que é coberto por uma membrana, a tampa de coleta repousa sobre a membrana e não tem contato direto com a amostra. Terminado o corte, as amostras isoladas podem ser retiradas com o auxílio de um filme adesivo especial na tampa do tubo de ensaio que garante que apenas as partes recortadas do corpo de prova fiquem aderidas à tampa. Para a coleta de espécimes microdissecados, a Cell Robotics oferece um sistema de recuperação manual de fragmentos que consiste em uma lâmina de microscópio especialmente revestida e um receptáculo coletor colocado na parte superior. A separação dos fragmentos da seção de tecido é possibilitada pela ação de forças eletrostáticas entre as lâminas e a tampa coletora.

Conclui-se das diferenças operacionais descritas anteriormente que alguns desses sistemas são mais propensos à contaminação de fontes ambientais e de tecidos vizinhos do que outros, mas a maioria dos investigadores concorda que a pureza da amostra microdissecada em todos esses sistemas permite a análise downstream de células e componentes subcelulares com precisão sem precedentes.

Aspectos Gerais da Preparação da Amostra

A microdissecção a laser tem sido aplicada em vários tipos de amostras diferentes, como cortes de tecido embutidos em parafina, congelados por pressão ou fixados em formalina, citospins, esfregaços de células e preparações de cromossomos. As vias gerais de recuperação de informações biológicas de material microdissecado são mostradas na Figura 1.

O fluxo de trabalho e as vias de recuperação de informações biológicas de amostras microdissectadas a laser. O painel esquerdo representa o processo de microdissecção de uma seção de tecido manchado. (1) tecido original corado (parte superior), (2) tecido microdissecado que é transferido para um tubo de microcentrífuga (meio), (3) o tecido original após a remoção da área microdissecada (parte inferior). Após a microdissecção, tanto o tecido original quanto a área microdissecada mantêm suas características morfológicas. O painel direito representa o processo de extração de macromoléculas do tecido microdissecado. Para minimizar as etapas de transferência e evitar a perda de amostra, os tampões de extração são geralmente pipetados diretamente na tampa da microcentrífuga. Após algumas etapas de processamento, os lisados ​​celulares estão prontos para subsequente análise molecular qualitativa e quantitativa. Para material de partida muito limitado, kits otimizados para isolamento e amplificação de macromoléculas estão disponíveis na maioria dos fabricantes de LMD. O painel inferior representa vários ensaios moleculares de baixo e alto rendimento para análise downstream de DNA, RNA e proteína.

Antes da microdissecção, dependendo do tipo do espécime e do método de microdissecção, as amostras são depositadas em lâminas de vidro de rotina, lâminas super-congeladas, lâminas carregadas ou lâminas especialmente projetadas para montagem em membrana. Embora este último não seja compatível com todos os procedimentos de microdissecção, facilita o isolamento de grandes áreas de tecido (até vários milímetros de diâmetro) e ajuda a preservar a morfologia original do tecido. Teoricamente, a partir desse ponto, a amostra poderia ser submetida à microdissecção sem qualquer manipulação posterior. No entanto, a amostragem precisa de material microdissecado é freqüentemente complicada pela má visualização da amostra. Isso ocorre porque os protocolos de microdissecção padrão exigem acesso físico direto às amostras e, portanto, precisam ser descobertos e secos ao ar. Distinguir células morfologicamente semelhantes, mas fenotipicamente diferentes ou tipos de células menos proeminentes nessas preparações pode ser muito desafiador. Diferentes estratégias têm sido sugeridas para melhorar a visualização de espécimes microdissecados.

Micke et al. descreveram recentemente o uso de um novo meio de cobertura de fluido que forneceu morfologia de tecido melhorada em seções de tecido congeladas e embebidas em parafina, sem interferir com o procedimento de microdissecção subsequente (15). Com base em seus resultados, o método proposto não afeta as aplicações a jusante dependentes de DNA e RNA.

Outra estratégia para melhorar a distinção dos diferentes tipos de células é aplicar algum tipo de procedimento de coloração antes do LMD. No entanto, as dificuldades com os protocolos de coloração padrão são várias. Em primeiro lugar, para o desempenho bem-sucedido do LMD, é necessário um controle cuidadoso da adesão do tecido à lâmina para evitar o descolamento das seções durante o procedimento de coloração, sem comprometer a captura do laser. Em segundo lugar, os tempos de incubação prolongados e produtos químicos agressivos comprometem a integridade das biomoléculas e, portanto, o procedimento de coloração pode afetar negativamente a recuperação ou a integridade das proteínas celulares e ácidos nucleicos e pode ser especialmente deletério para os RNAs facilmente degradáveis.

Fend et al. desenvolveram um protocolo de imunocoloração rápido e versátil que é suficientemente suave para conservar pequenas quantidades de RNA e pode ser aplicado em seções congeladas antes da microdissecção (16). Isso permite o isolamento direcionado e a análise de populações de células imunofenotipicamente diferentes de lesões complexas, com uma mistura íntima de tipos de células morfologicamente idênticas. A viabilidade desta abordagem imuno-LMD foi demonstrada em seu estudo com a amplificação de transcritos específicos de células com transcrição reversa convencional (RT) -PCR de linfonodos imunocorados normais e neoplásicos, mama e seções congeladas de próstata. Desde então, DNA, RNA e proteínas foram recuperados com sucesso, com protocolos otimizados de quantidades mínimas de espécimes corados por imunohistoquímica ou imunofluorescência (16).

Para evitar a contaminação de tecidos ou células vizinhas em alguns casos, é aconselhável destruir estruturas indesejadas antes de coletar as amostras microdissecadas. Isso pode ser conseguido cortando-se ao redor da amostra alvo, produzindo uma lacuna nítida entre a amostra selecionada e a não selecionada ou queimando objetos indesejados seletivamente com tiros precisos a laser. Uma vez que a amostra desejada foi coletada seletivamente, seu conteúdo de ácido nucleico ou proteína deve ser extraído para análise posterior.

Embora a tecnologia LMD tenha se mostrado um método valioso para o isolamento rápido e eficiente de células específicas livres de contaminantes, existem várias desvantagens potenciais. A tecnologia LMD é examinada a partir de diferentes perspectivas, como facilidade de uso, versatilidade, custos, manuseio de amostras e eficiência de tempo, e as vantagens e desvantagens identificadas estão resumidas na Tabela 2.

Vantagens Desvantagens
Devido ao seu conceito modular e versatilidade, pode ser usado em muitos campos da pesquisa científica da vida O custo do instrumento LMD é relativamente alto. Os custos de consumíveis (como tampas de isolamento especialmente projetadas) também devem ser considerados
Uma ampla gama de material de origem pode ser empregada e várias moléculas podem ser isoladas A visualização da amostra é dificultada pela ausência de lamínula
Manuseio de amostra circunspect é necessário.
O armazenamento de amostra a longo prazo (principalmente para RNA ou proteína) não é recomendado
O processamento adequado da amostra é crucial para resultados reproduzíveis
Homogeneidade sem precedentes do material da amostra Quando a amostra contém uma grande quantidade de tipos de células misturadas, coletar as células de interesse é demorado
A homogeneidade biológica não representa as interações célula-célula e célula-matriz extracelular

Devido ao seu custo relativamente alto, o instrumento LMD faz parte de uma instalação básica na maioria das instituições. Geralmente, os serviços de microdissecção são fornecidos a laboratórios individuais por amostra ou por hora. Para neófitos no campo de LMD, um par de horas de treinamento é geralmente suficiente antes da operação independente de qualquer tipo de instrumento LMD. No entanto, a otimização de protocolos de microdissecção para novos tipos de células ou tecidos pode ser um processo demorado e operadores experientes podem ajudar tremendamente para iniciantes na seleção do instrumento e protocolo mais adequado para uma aplicação particular.

Isolamento e amplificação de DNA de amostra microdissecada a laser

Devido ao complicado procedimento de extração de DNA à base de fenol-clorofórmio, geralmente é considerado inadequado para a extração de ácidos nucléicos de material microdissecado.

No entanto, a maioria dos kits comerciais atualmente disponíveis que usam partículas de vidro magnéticas, membrana de sílica, esferas de gel ou filtro de vidro para ligar o DNA são apropriados para isolar o DNA de uma quantidade mínima de material de partida. Porém, ainda é importante minimizar a possibilidade de degradação do DNA durante o procedimento de isolamento e incluir um inibidor de nuclease (17). O rendimento de DNA de amostras clínicas microdissectadas é frequentemente limitado e, portanto, para estudos genéticos, um método de amplificação do genoma completo (WGA) deve ser usado para substituir o DNA genômico por DNA genômico WGA. No entanto, a amplificação completa e fiel de todo o genoma é difícil, e os requisitos e limites do WGA com relação ao número de células e processamento celular são mal estabelecidos (18). O número de células e a quantidade recuperada de DNA são especialmente críticos ao caracterizar o estado do alelo em loci cromossômicos demonstrando instabilidade de microssatélites (MSI) ou perda de heterozigosidade (LOH), pois quantidades insuficientes de células ou DNA genômico podem resultar em amplificação alélica desigual (19 ) Além disso, perdas artificiais de cromossomos ou partes de cromossomos podem ocorrer durante a microdissecção, levando a perdas alélicas artificiais (pseudo-LOH) (20).

Isolamento e amplificação de RNA de amostra microdissecada a laser

Normalmente, as amostras de microdissecção a laser são tão pequenas que o isolamento eficaz da fração de RNA facilmente degradável se torna um desafio. Purificar o RNA dessas amostras com métodos convencionais costuma ser ineficiente e resulta na perda de um precioso RNA. Para limitar a perda de RNA durante o procedimento de isolamento, muitos fabricantes montaram kits especialmente projetados para amostras microdissecadas. Esses kits geralmente contêm DNAses e inibidores de RNAse e permitem a eluição do RNA total purificado em pequenos volumes (10-30 μl). É sugerido adicionar a solução de lise diretamente à tampa da microcentrífuga, e assim as células capturadas são imediatamente estabilizadas e a purificação pode prosseguir normalmente.

Como os RNAses endógenos também representam um risco para a integridade do RNA, o manuseio adequado do tecido é necessário para evitar que as nucleases endógenas sejam ativadas. Assim, o tempo de processamento e as condições de armazenamento também podem ser fatores importantes na influência da recuperação de RNA.

Embora existam protocolos projetados para extrair qualidade aceitável de RNA de material de tecido microdissecado a laser fixado em formalina, idealmente a recuperação de RNA é melhor realizada em tecido recém-congelado (21, 22). Transcrições de baixa, média e alta abundância são consistentemente recuperadas de tecido fresco congelado em quantidades relativamente altas. Alguns pesquisadores alcançaram uma recuperação de RNA aceitável usando fixadores precipitantes, como etanol e acetona. Como por exemplo, no estudo de Su et al. o rendimento de RNA de tecidos cerebrais fixados em etanol foi 70% do rendimento de amostras congeladas frescas (23). De acordo com quase todos os estudos, os fixadores precipitativos produzem constantemente mais RNA do que os fixadores de reticulação, como a formalina (20, 21, 24).

A quantidade média de RNA total por célula de uma seção de tecido humano é estimada em cerca de 10 pg, enquanto a maioria das plataformas de perfil de expressão requerem quantidades de microgramas (25, 26). Assim, independentemente do método de extração, a quantidade recuperada de RNA geralmente é insuficiente para uma análise confiável de microarranjos. Isto está subjacente à necessidade de empregar métodos de amplificação de RNA que não introduzam grande distorção dos perfis de expressão obtidos após a amplificação. Mais recentemente, várias técnicas foram apresentadas para a amplificação de quantidades escassas de RNA, incluindo amplificação linear e métodos de amplificação exponencial baseados em PCR. Os protocolos de amplificação linear mais usados ​​atualmente são baseados no protocolo de amplificação de RNA antisense (aRNA) patenteado de Eberwine (27). A descrição detalhada dessas abordagens está além do escopo deste artigo de revisão, mas em breve as etapas principais do procedimento de Eberwine é uma transcrição reversa usando um iniciador oligo (dT) contendo uma sequência promotora de polimerase de RNA T7, a seguir os pequenos fragmentos de RNA servem como iniciadores durante a reação de síntese de segunda fita, produzindo um molde de cDNA de fita dupla para transcrição. O molde de cDNA é então usado em grande escala na reação de transcrição in vitro (IVT) para produzir aRNA amplificado linearmente. Ao usar material de amostra microdissecado, a quantidade de aRNA no final do primeiro ciclo de amplificação é geralmente insuficiente para análises de expressão gênica. Então, o aRNA pode ser usado como molde para a síntese de cDNA seguido por uma segunda rodada de amplificação. Como esses primers de segunda rodada são primers aleatórios, os tamanhos dos transcritos geralmente diminuirão. O uso de mais de duas rodadas de amplificação não é recomendado, pois o risco de distorção do perfil de expressão do gene original torna-se muito alto (28). Por causa de sua alta fidelidade, os protocolos de amplificação linear tornaram-se parte integrante de vários protocolos de rotulagem padrão para hibridização de microarranjos.

Um novo método interessante para analisar transcritos de mRNA de seções criostáticas microdissectadas de tecidos congelados sem a necessidade de isolamento de RNA foi publicado por To et al. (29). Em resumo, o princípio da técnica é submeter as células microdissectadas a ciclos de congelamento-descongelamento e coletar o lisado celular em uma solução projetada para minimizar a degradação do RNA. As reações de RT-PCR subsequentes podem ser realizadas a partir do lisado sem a necessidade de qualquer processamento adicional. Com essa técnica, os autores demonstraram que uma pequena região microdissecada, contendo apenas algumas centenas de células, pode fornecer um modelo de RNA adequado para 80–100 reações de RT-PCR. Em seu estudo, eles amplificaram com sucesso fragmentos de cDNA de diferentes tamanhos do microglobulina β-2, p21 Waf1, e BRCA1 genes de regiões microdissecadas de seções congeladas de carcinoma de mama.

Com o uso de controles internos de números de cópias definidos, Luzzi et al. demonstraram que o mRNA de 15.000 células epiteliais de mama isoladas LMD pode ser usado para o perfil de expressão baseado em matriz de oligonucleotídeos de alta densidade com sensibilidade analítica e precisão semelhantes às de metodologias de rotina, usando RNA de entrada 200 e 1.000 vezes maior (30).

Em um estudo recente combinando microdissecção com matriz de oligonucleotídeos de alta densidade no tecido mamário, King et al. mostraram inequivocamente que mesmo quando o material de RNA inicial está na faixa de nanogramas, a variabilidade biológica na expressão gênica entre espécimes independentes e entre amostras histologicamente distintas dentro de um espécime é maior do que a variabilidade técnica associada aos procedimentos (31).

Sanna et al. analisou os perfis de expressão gênica de regiões cerebrais anatomicamente definidas, comparando amostras derivadas de LMD submetidas a 2 rodadas de IVT e regiões cerebrais dissecadas manualmente submetidas a 1 ou 2 rodadas de IVT (32). Como esperado, os RNAs alvo preparados com o protocolo de IVT duplo foram mais curtos (∼200-1.000 bases) do que aqueles preparados com um único ciclo de IVT e, portanto, resultaram em menor número de "chamadas presentes". No entanto, independentemente do número de ciclos de IVT, as taxas de expressão gênica entre amostras dissecadas manualmente e LMD foram altamente concordantes.

Seguindo o acima mencionado, podemos concluir que a viabilidade do uso de cDNA / microarray de oligonucleotídeo em amostras microdissecadas está bem estabelecida. O número de células necessárias para a análise depende de muitos fatores, como preparação de tecido, tipo de laser usado para microdissecção, isolamento de RNA e estratégias de amplificação, etc. Enquanto, as reações de RT-PCR foram realizadas com sucesso a partir de RNA de apenas alguns De 10 a 100 células microdisseccionadas, a análise de microarranjos ainda requer alguns milhares de células. Se o objetivo é atingir um perfil de expressão gênica global menos ruidoso a partir de material microdissecado, os protocolos devem exigir a aquisição de mais de 10.000 células, coleta das quais requer um compromisso de tempo substancial.

Isolamento de proteína de amostra microdissecada a laser

Vários motivos exigem o exame direto de proteínas, em vez do genoma ou transcriptoma. Em primeiro lugar, as modificações pós-tradução afetam significativamente a função e a atividade das proteínas e as modificações pós-tradução específicas da doença podem ter particular importância em aplicações clínicas. Em segundo lugar, os níveis de expressão de mRNA não estão necessariamente correlacionados com as quantidades de proteínas e, por meio de splicing alternativo, diferentes variantes de splicing podem codificar para diversas proteínas.Terceiro, decifrar as mudanças no proteoma poderia potencialmente ajudar na identificação de novos alvos diagnósticos e terapêuticos.

Nos últimos anos, vários pesquisadores estabeleceram condições para a obtenção de informações proteômicas de espécimes microdissecados por captura a laser. As proteínas nesses estudos foram analisadas por eletroforese em gel bidimensional (2D) (33, 34) imunoensaio (35, 36) e, mais recentemente, por tecnologias baseadas em espectrometria de massa (37, 38). No entanto, a quantidade e a qualidade das proteínas recuperadas após a microdissecção impactam principalmente os sucessos da análise downstream. Normalmente, algumas centenas a alguns milhares de células são necessárias para a espectrometria de massa, 20.000–40.000 células por imunoensaio e algumas centenas de milhares de células por experimento de eletroforese em gel. Para acomodar o baixo número de células disponíveis para análise após o LMD, os interesses mudaram para métodos que requerem menos material de amostra. Além disso, a quantidade de proteínas recuperadas é particularmente importante, pois, em contraste com os métodos baseados em ácido nucleico, elas não são amplificáveis. De acordo com a maioria dos estudos, o procedimento LMD em si não interfere na análise proteômica subsequente e o perfil proteico global pode ser obtido a partir do material microdissecado (39). No entanto, o preparo do tecido para microdissecção, como a escolha do fixador e o procedimento de coloração, pode influenciar significativamente tanto a quantidade quanto a qualidade do material recuperado. Como a formalina reticula extensivamente as proteínas, os tecidos fixados com formalina geralmente não podem ser usados. Não há consenso sobre a questão do fixador e agente de coloração, mas a maioria dos pesquisadores defende o uso de tecido fresco congelado com ou sem fixação de etanol e uma baixa concentração de azul de toluidina, verde de metileno ou coloração com hematoxilina (40, 41). Para estar no lado seguro e evitar qualquer possível efeito prejudicial do procedimento de coloração, algumas pessoas sugerem realizar LMD em tecido fresco congelado não manchado enquanto uma seção manchada espelhada é usada para identificação de características arquitetônicas distintas. Este procedimento LMD navegado provou ser um método prático e poderoso para realizar estudos proteômicos em regiões cerebrais especificamente definidas (42).

Isolamento de células vivas e raras a partir de amostra microdissecada a laser

A possibilidade recentemente aberta de isolar especificamente células vivas individuais de culturas mistas abre novas fronteiras na biologia celular e molecular (43). Foi demonstrado que o LMD não tem influência na viabilidade, metabolismo e taxa de proliferação de células vivas isoladas (44). Mesmo colônias de células recultivadas, tripsinizadas e semeadas novamente, ainda são viáveis ​​após várias rodadas de procedimento LMD. O novo equipamento de cultura de células para isolamento e recultivo de células vivas está disponível de vários fabricantes. Até mesmo um organismo vivo inteiro, como o nematóide Elegeans de Caenorhabditis, é transportado com sucesso sem prejudicar a informação biológica ou a viabilidade (45).

Outra aplicação em rápido desenvolvimento é a identificação automatizada combinada de células que ocorrem raramente, seguida por LMD imediato controlado por computador. A combinação de software de escaneamento automatizado com um sistema LMD automatizado permite acesso rápido e agrupamento das células raras desejadas para análise subsequente. Os aplicativos testados incluem, mas não se limitam, ao diagnóstico pré-natal e à detecção de câncer residual mínima (46, 47). Os métodos atuais para o diagnóstico pré-natal de aneuploidia e distúrbios monogênicos requerem testes invasivos, que apresentam um risco significativo de aborto espontâneo relacionado ao procedimento, e o potencial dessa tecnologia pode ser enorme no diagnóstico pré-natal. Com essa abordagem raramente ocorrendo, as células fetais podem ser recuperadas com segurança do sangue materno ou de esfregaços transcervicais e podem ser uma adição atraente ao repertório de diagnóstico pré-natal não invasivo (48, 49). A detecção de células cancerosas circulantes do sangue periférico ou de outros compartimentos extra-tumorais é uma promessa para o diagnóstico precoce do câncer e o monitoramento da eficácia da terapia anticâncer. Vona et al. recuperou células tumorais circulantes em membranas de filtração após isolamento por tamanho de células tumorais epiteliais de sangue periférico de pacientes com câncer (50). Usando este método, as células tumorais epiteliais podem ser isoladas individualmente por filtração devido ao seu tamanho maior em comparação com os leucócitos do sangue periférico. As células tumorais circulantes são retidas em um filtro de sangue de rotina e são circuncidadas pelo laser e catapultadas para um tubo de coleta para análise posterior. Em outro estudo, células displásicas foram coletadas de esfregaços fixados com coloração de Pap de vários graus por microdissecção a laser e analisadas quanto a lesões genéticas típicas de carcinoma cervical (51). O padrão LOH conforme publicado para tecido de carcinoma cervical foi detectado com sucesso a partir de tais amostras.


RECONHECIMENTO

Agradecemos aos Drs. Arthur Kreig, Cy Stein e Peter Glazer pelos comentários úteis durante a preparação deste manuscrito. A assistência editorial de Elizabeth R. Bien também é agradecida.

Apoiado em parte pelos National Institutes of Health Grants No. RO1CA66731, PO1CA72765 para A.M.G., e um Translational Research Grant da Leukemia Society of America (A.M.G.)

Endereçar solicitações de reimpressão a Alan M. Gewirtz, MD, 513B Stellar-Chance Laboratories, Escola de Medicina da Universidade da Pensilvânia, 422 Curie Blvd, Filadélfia, PA, 19104.


Assista o vídeo: Daniel Lopes cerca eletrica rural. aterramento da cerca (Agosto 2022).