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Existe um termo para um procedimento em que a coluna de cromatografia é lavada com álcool a 20%

Existe um termo para um procedimento em que a coluna de cromatografia é lavada com álcool a 20%



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De uma descrição de método em um documento russo:

Após a conclusão da análise cromatográfica, a coluna é lavada com pelo menos 2-3 volumes de água a uma taxa de 0,4 ml / min. A coluna é então naftalina (?) lavando-o com pelo menos 10-15 volumes de álcool a 20% a uma taxa que diminui lentamente de 0,4 ml / min para 0 ml / min.

A palavra que traduzi como "naftalina" é konservirovat (консервировать колонку) em russo. Tem o significado geral de "preparar algo para armazenamento" (por exemplo, "preparar vegetais para armazenamento por decapagem").

Em um esforço para determinar a terminologia correta, Gostaria de saber por que uma coluna de cromatografia seria lavada com etanol 20%. Qualquer recomendação sobre a terminologia bioquímica padrão para este procedimento, se houver, também será bem-vinda.


Preparado ou condicionado para armazenamento provavelmente seria perfeitamente aceitável.

Se você estiver procurando por um equivalente de uma palavra, neste caso, eu traduziria como estabilizado. De dictionary.com:

estabilizar

[stey-buh-lahyz]

verbo (usado com objeto), estabilizado, estabilizando.

  1. para tornar ou manter estável, firme ou constante.

Isso parece adequado, uma vez que se deseja garantir a manutenção do bom estado da coluna para uso posterior, quando retirada do armazenamento.


Este é um procedimento de rotina em FPLC para preparar colunas para armazenamento. 20% de etanol é usado para prevenir o crescimento microbiano. Veja esta nota técnica:

Todas as colunas SEC são fornecidas em etanol a 20% para evitar o crescimento microbiano.


Como as colunas podem ser limpas ou regeneradas?

Aumento da contrapressão, mudanças nos tempos de retenção / perda de desempenho da coluna são sintomas comuns de depósitos na frita de entrada da coluna, na coluna ou na superfície da fase estacionária. Na maioria das vezes, esses problemas podem ser superados pelo uso de um procedimento de lavagem aplicado corretamente. Quanto mais cedo você usar os procedimentos de regeneração da coluna, mais chances terá de recuperar o desempenho original da coluna.

As espécies fortemente adsorvidas são coletadas na extremidade de entrada do solvente da coluna e, em muitos casos, é um benefício usar um fluxo reverso durante a lavagem. Ao contrário da crença popular, a reversão do fluxo nunca prejudicará uma coluna bem embalada. A direção do fluxo mencionada é geralmente a direção na qual a coluna foi originalmente compactada. Por favor, note que as sílicas originais irregulares / amorfas representam, no entanto, um possível problema ao inverter o fluxo, uma vez que a possível reestruturação do leito compactado é então possível. Extremo cuidado sempre deve ser tomado ao reverter o fluxo nessas sílicas irregulares.

Por favor, verifique nossos procedimentos de regeneração sugeridos para as diferentes famílias de fases (RP, NP, troca iônica etc.) e realizar o teste da coluna CoA após esses procedimentos, caso a pressão original seja restaurada, a fim de avaliar o desempenho da coluna / simetria de pico.


12.5.1 Colunas de HPLC

Um HPLC normalmente inclui duas colunas: uma coluna analítica responsável pela separação e uma coluna de guarda. A coluna de guarda é colocada antes da coluna analítica, protegendo-a de contaminação.

Colunas Analíticas

O tipo mais comum de coluna de HPLC é um tubo de aço inoxidável com diâmetro interno entre 2,1 mm e 4,6 mm e comprimento entre 30 mm e 300 mm (Figura 12.39). A coluna é preenchida com partículas de sílica porosa 3 & ndash10 & mum com uma forma irregular ou esférica. As eficiências de coluna típicas são 40.000 e 60.000 pratos teóricos / m. Assumindo um Vmax/Vmin de aproximadamente 50, uma coluna de 25 cm com 50.000 placas / m tem 12.500 placas teóricas e uma capacidade de pico de 110.

Você pode usar a equação 12.16 para estimar a capacidade de pico de uma coluna e rsquos.

Figura 12.39 Coluna empacotada típica para HPLC. Esta coluna em particular tem um diâmetro interno de 4,6 mm e um comprimento de 150 mm, e é embalada com partículas de 5 mm revestidas com fase estacionária.

As colunas capilares usam menos solvente e, como a amostra é diluída em menor grau, produzem sinais maiores no detector. Essas colunas são feitas de capilares de sílica fundida com diâmetros internos de 44 & ndash200 & mum e comprimentos de 50 & ndash250 mm. Colunas capilares empacotadas com partículas 3 & ndash5 & mum foram preparadas com eficiências de coluna de até 250.000 pratos teóricos. 10

Uma limitação de uma coluna capilar empacotada é a contrapressão que se desenvolve ao tentar mover a fase móvel através dos pequenos espaços intersticiais entre o material de empacotamento particulado de tamanho mícron (Figura 12.40). Como a tubulação e os acessórios que transportam a fase móvel têm limites de pressão, uma contrapressão mais alta requer uma taxa de fluxo mais baixa e um tempo de análise mais longo. Colunas monolíticas, em que o suporte sólido é uma única haste porosa, oferece eficiências de coluna equivalentes a uma coluna capilar compactada, permitindo taxas de fluxo mais rápidas. Uma coluna monolítica & mdash que geralmente é semelhante em tamanho a uma coluna empacotada convencional, embora menores, colunas capilares também estão disponíveis & mdashis preparada formando a haste monolítica em um molde e cobrindo-a com tubo de PTFE ou uma resina de polímero. Os bastonetes monolíticos feitos de um polímero de sílica gel normalmente têm macroporos com diâmetros de aproximadamente 2 & mum e mesoporos & mdashporos dentro dos macroporos & mdashpores com diâmetros de aproximadamente 13 nm. 11

Figura 12.40 O empacotamento de partículas menores cria espaços intersticiais menores do que o empacotamento de partículas maiores. Embora a redução do tamanho da partícula em 2 vezes aumente a eficiência por um fator de 1,4, também produz um aumento de 4 vezes na contrapressão.

Colunas de Guarda

Dois problemas tendem a encurtar a vida útil de uma coluna analítica. Em primeiro lugar, os solutos que se ligam irreversivelmente à fase estacionária degradam o desempenho da coluna e rsquos, diminuindo a fase estacionária disponível. Em segundo lugar, o material particulado injetado com a amostra pode obstruir a coluna analítica. Para minimizar esses problemas, colocamos uma coluna de guarda antes da coluna analítica. Colunas de guarda geralmente contêm o mesmo material de embalagem particulado e fase estacionária que a coluna analítica, mas são significativamente mais curtos e menos caros & mdasha com comprimento de 7,5 mm e um custo de um décimo do que para a coluna analítica correspondente é típico. Como elas são destinadas ao sacrifício, as colunas de proteção são substituídas regularmente.

Se você olhar atentamente para a Figura 12.39, verá a pequena coluna de proteção logo acima da coluna analítica.

Fases estacionárias para cromatografia gasosa e líquida

Na cromatografia líquido e líquido, a fase estacionária é um filme líquido revestido em um material de embalagem, normalmente 3 partículas de sílica porosa. Como a fase estacionária pode ser parcialmente solúvel na fase móvel, ela pode eluir ou sangrar da coluna ao longo do tempo. Para evitar a perda de fase estacionária, que encurta a vida útil da coluna e rsquos, ela é ligada covalentemente às partículas de sílica. Fases estacionárias ligadas são criados pela reação das partículas de sílica com um organoclorossilano da forma geral Si (CH3)2RCl, onde R é um alquil ou grupo alquil substituído.

Para evitar interações indesejadas entre os solutos e quaisquer grupos & ndashSiOH restantes, Si (CH3)3Cl é adicionado, convertendo os sites não reagidos em & ndashSiOSi (CH3)3 tais colunas são designadas como terminadas.

As propriedades de uma fase estacionária dependem do grupo organosilano e alquil rsquos. Se R é um grupo funcional polar, a fase estacionária é polar. Exemplos de fases estacionárias polares incluem aquelas em que R contém um ciano (& ndashC2H4CN), um diol (& ndashC3H6OCH2CHOHCH2OH), ou um amino (& ndashC3H6NH2) grupo funcional. Como a fase estacionária é polar, a fase móvel é um solvente apolar ou moderadamente polar. A combinação de uma fase estacionária polar e uma fase móvel não polar é chamada cromatografia de fase normal.

No cromatografia de fase reversa, que é a forma mais comum de HPLC, a fase estacionária é apolar e a fase móvel é polar. As fases estacionárias não polares mais comuns usam um organoclorossilano onde o grupo R é um n-octil (C8) ou n-octildecil (C18) cadeia de hidrocarbonetos. A maioria das separações de fase reversa são realizadas usando uma solução aquosa tamponada como uma fase móvel polar, ou com outros solventes polares, como metanol e acetonitrila. Como o substrato de sílica pode sofrer hidrólise em soluções básicas, o pH da fase móvel deve ser inferior a 7,5.

Pode parecer estranho que a forma menos comum de cromatografia líquida seja identificada como fase normal. Você deve se lembrar que um dos primeiros exemplos de cromatografia foi a separação de pigmentos vegetais por Mikhail Tswett & rsquos usando uma coluna polar de carbonato de cálcio e uma fase móvel não polar de éter de petróleo. A atribuição de normal e invertido, portanto, tem tudo a ver com precedência.


Reguladores de sinalização de proteína G, parte B

D.Scott Witherow, Vladlen Z. Slepak, em Methods in Enzymology, 2004

Conclusões

A purificação de proteínas demonstrou que ocorre a interação entre as proteínas RGS da família Gβ5 e R7 na Vivo. Experimentos de pulse-chase mostraram que as proteínas Gβ5 e RGS7 não associadas sofreram rápida degradação proteolítica nas células, provavelmente fornecendo o mecanismo que mantém a estequiometria 1: 1 das subunidades Gβ5 e RGS nas células. Embora Gβ5-RGS7 tenha demonstrado ter atividade GAP e regular a sinalização mediada pela proteína G, os ensaios pull-down falharam em detectar sua interação de ligação com as subunidades Gα. Em contraste, a interação entre Gβ5 – RGS7 e Gαq foi demonstrado usando FRET em um ensaio baseado em células, indicando que esta abordagem é aplicável a estudos futuros de interações Gβ5-RGS com subunidades Gα.


CROMATOGRAFIA LÍQUIDA | Cromatografia de afinidade

Introdução

A cromatografia de afinidade pode ser definida como um método de cromatografia líquida em que um agente biológico ou ligante biomimético é usado para a retenção seletiva de compostos complementares. Esta forma de cromatografia líquida foi originalmente usada por Starkenstein em 1910 para a purificação da amilase através do uso de amido como suporte sólido. Este método continuou a se desenvolver lentamente nos 50 anos seguintes. No entanto, foi só na década de 1960 que suportes adequados, como agarose em esferas, como desenvolvido por Hjerten, tornaram-se disponíveis, bem como técnicas de imobilização relativamente simples para esses suportes. Um importante avanço nesta última área foi um relatório em 1967 de Axen, Porath e Ernback, no qual o método do brometo de cianogênio para a imobilização de proteínas e peptídeos foi relatado pela primeira vez. Essa abordagem foi então usada em 1968 por Cuatrecasas, Anfinsen e Wilchek para purificar enzimas por meio do uso de inibidores de enzima imobilizados. Foi também nessa época que o termo "cromatografia de afinidade" foi proposto para descrever esta técnica.

A cromatografia de afinidade é relativamente simples de realizar e é uma ferramenta poderosa para a separação de macromoléculas biológicas. A alta seletividade dessa abordagem muitas vezes permite que estratégias de purificação de etapa única sejam desenvolvidas, mesmo quando se trabalha com misturas diluídas e altamente complexas. Essa simplicidade e a variedade de ligantes que podem ser usados ​​com essa abordagem a tornaram uma ferramenta importante nas separações em escala de processo. No entanto, a cromatografia de afinidade moderna também desempenha um papel importante na análise e estudo de sistemas biológicos. Por exemplo, a maioria das formas de cromatografia líquida quiral, como aquelas que usam ciclodextrinas imobilizadas ou proteínas séricas, podem ser consideradas uma subcategoria de cromatografia de afinidade.


Perguntas do laboratório 5

3. Fase estacionária = contém analito / sistema absorvente, permanece na coluna / na placa de TLC
-Fase que não se move durante o TLC
-Na cromatografia em coluna, é o componente seco firmemente compactado da coluna.
- normalmente consiste em um adsorvente finamente dividido usado na forma de uma camada fina sobre um material de suporte.
-A fase móvel (uma solução contendo a amostra) flui sobre ou através da fase estacionária para efetuar a separação.

-Solúvel = Se uma substância pode ser dissolvida em um líquido.

- Frente do solvente = distância acima de uma placa de TLC que o solvente de desenvolvimento viaja.
--usado na determinação do valor Rf.

-Câmara TLC = meio em que o TLC é executado.
- Frasco tampado com solvente de desenvolvimento e placa de TLC em pé para evitar viagens curvas

-Solvente de mancha = solvente usado para dissolver o composto a ser analisado.
- Frequentemente acetato de etila ou cloreto de metileno

- Solvente de desenvolvimento = solvente em que o TLC é colocado dentro da câmara, cria a frente do solvente

-Adsorvente = o que retém o analito, geralmente um sólido
- uma camada fina e uniforme de um material em pó fino e seco aplicada a um suporte adequado

-Rf = Fator de retenção - A proporção da distância percorrida pelo ponto sobre a distância percorrida pela frente do solvente.


Existe algum termo para procedimento em que a coluna cromatográfica é lavada com álcool 20% - Biologia

Esta página é uma introdução à cromatografia em papel - incluindo a cromatografia bidirecional.

Executando cromatografia em papel

A cromatografia é usada para separar misturas de substâncias em seus componentes. Todas as formas de cromatografia funcionam com o mesmo princípio.

Todos eles têm um fase estacionária (um sólido ou um líquido apoiado em um sólido) e um na fase móvel (um líquido ou um gás). A fase móvel flui através da fase estacionária e carrega os componentes da mistura com ela. Componentes diferentes viajam em taxas diferentes. Veremos os motivos para isso mais adiante na página.

Na cromatografia de papel, a fase estacionária é um papel absorvente muito uniforme. A fase móvel é um solvente líquido adequado ou uma mistura de solventes.

Produzindo um cromatograma de papel

Você provavelmente usou a cromatografia de papel como uma das primeiras coisas que você fez em química para separar misturas de corantes coloridos - por exemplo, os corantes que compõem uma tinta específica. Esse é um exemplo fácil de seguir, então vamos começar por aí.

Suponha que você tenha três canetas azuis e queira descobrir qual foi usada para escrever uma mensagem. Amostras de cada tinta são colocadas em uma linha a lápis desenhada em uma folha de papel de cromatografia. Parte da tinta da mensagem é dissolvida na quantidade mínima possível de um solvente adequado, e isso também é espalhado na mesma linha. No diagrama, as canetas são rotuladas 1, 2 e 3, e a tinta da mensagem como M.

Observação: O papel de cromatografia será de fato branco puro - não cinza claro. Sou forçado a mostrá-lo como esbranquiçado por causa da maneira como construo os diagramas. Qualquer coisa que eu desenho como branco puro permite que a cor de fundo da página apareça.

O papel é suspenso em um recipiente com uma camada rasa de um solvente adequado ou mistura de solventes nele. É importante que o nível de solvente esteja abaixo da linha com as manchas. O próximo diagrama não mostra detalhes de como o papel é suspenso porque há muitas maneiras possíveis de fazer isso e isso confunde o diagrama. Às vezes, o papel é apenas enrolado em um cilindro solto e preso com clipes na parte superior e inferior. O cilindro então fica apenas no fundo do recipiente.

O motivo para cobrir o recipiente é certificar-se de que a atmosfera no copo esteja saturada com vapor de solvente. Saturar a atmosfera no copo com vapor impede que o solvente evapore à medida que sobe no papel.

Conforme o solvente viaja lentamente pelo papel, os diferentes componentes das misturas de tinta viajam em taxas diferentes e as misturas são separadas em pontos de cores diferentes.

O diagrama mostra como a placa pode ficar depois que o solvente se move quase para o topo.

É bastante fácil ver no cromatograma final que a caneta que escreveu a mensagem continha os mesmos corantes da caneta 2. Você também pode ver que a caneta 1 contém uma mistura de dois corantes azuis diferentes - um dos quais poderia ser o mesmo que o corante único na caneta 3.

Alguns compostos em uma mistura viajam quase tão longe quanto o solvente, alguns ficam muito mais próximos da linha de base. A distância percorrida em relação ao solvente é uma constante para um determinado composto, desde que você mantenha todo o resto constante - o tipo de papel e a composição exata do solvente, por exemplo.

A distância percorrida em relação ao solvente é chamada de Rf valor. Para cada composto, pode-se calcular usando a fórmula:

Por exemplo, se um componente de uma mistura viajou 9,6 cm da linha de base enquanto o solvente viajou 12,0 cm, então o Rf o valor desse componente é:

No exemplo que vimos com as várias canetas, não foi necessário medir Rf valores porque você está fazendo uma comparação direta apenas olhando para o cromatograma.

Você está pressupondo que, se houver dois pontos no cromatograma final que sejam da mesma cor e tenham percorrido a mesma distância no papel, é mais provável que sejam o mesmo composto. Não é necessariamente verdade, é claro - você poderia ter dois compostos de cores semelhantes com R muito semelhantef valores. Veremos como você pode contornar esse problema mais adiante na página.

E se as substâncias nas quais você está interessado forem incolores?

Em alguns casos, pode ser possível tornar as manchas visíveis, reagindo-as com algo que produza um produto colorido. Um bom exemplo disso são os cromatogramas produzidos a partir de misturas de aminoácidos.

Suponha que você tenha uma mistura de aminoácidos e queira descobrir quais aminoácidos específicos a mistura contém. Para simplificar, presumiremos que você sabe que a mistura pode conter apenas cinco dos aminoácidos comuns.

Uma pequena gota de uma solução da mistura é colocada na linha de base do papel e pequenos pontos semelhantes de aminoácidos conhecidos são colocados ao lado dela. O papel é então colocado em um solvente adequado e deixado para revelar como antes. No diagrama, a mistura é M e os aminoácidos conhecidos são rotulados de 1 a 5.

A posição da frente do solvente é marcada a lápis e o cromatograma pode secar e é então pulverizado com uma solução de ninidrina. A ninidrina reage com os aminoácidos para dar compostos coloridos, principalmente marrom ou roxo.

O diagrama à esquerda mostra o papel depois que a frente do solvente quase atingiu o topo. As manchas ainda estão invisíveis. O segundo diagrama mostra como pode ficar após a pulverização com ninidrina.

Não há necessidade de medir o Rf porque você pode comparar facilmente os pontos na mistura com os dos aminoácidos conhecidos - tanto por suas posições quanto por suas cores.

Neste exemplo, a mistura contém os aminoácidos marcados como 1, 4 e 5.

E se a mistura contivesse aminoácidos diferentes daqueles que usamos para comparação? Haveria manchas na mistura que não correspondiam às dos aminoácidos conhecidos. Você teria que refazer o experimento usando outros aminoácidos para comparação.

Cromatografia de papel bidirecional

A cromatografia em papel bidirecional contorna o problema de separar substâncias que têm R muito semelhantef valores.

Vou voltar a falar sobre compostos coloridos porque é muito mais fácil ver o que está acontecendo. Você pode perfeitamente fazer isso com compostos incolores - mas é preciso usar bastante imaginação para explicar o que está acontecendo!

Desta vez, um cromatograma é feito a partir de um único ponto da mistura colocado em uma extremidade da linha de base. Ele é colocado em um solvente como antes e deixado até que a frente do solvente se aproxime do topo do papel.

No diagrama, a posição da frente do solvente é marcada a lápis antes que o papel seque. É rotulado como SF1 - a frente do solvente para o primeiro solvente. Estaremos usando dois solventes diferentes.

Se você olhar com atenção, poderá ver que o grande ponto central no cromatograma é parcialmente azul e parcialmente verde. Dois corantes na mistura têm quase o mesmo Rf valores. Eles poderiam igualmente bem, é claro, ambos ter sido da mesma cor - nesse caso você não poderia dizer se havia um ou mais corantes presentes naquele local.

O que você faz agora é esperar que o papel seque completamente e, em seguida, girá-lo 90 graus e revelar o cromatograma novamente em um solvente diferente.

É muito improvável que os dois pontos confusos tenham o mesmo Rf valores no segundo solvente, bem como no primeiro e, portanto, os pontos se moverão em uma quantidade diferente.

O próximo diagrama mostra o que pode acontecer com os vários pontos no cromatograma original. A posição da segunda frente do solvente também está marcada.

É claro que você não veria esses pontos em suas posições original e final - eles se moveram! O cromatograma final ficaria assim:

A cromatografia de duas vias separou completamente a mistura em quatro pontos distintos.

Se você deseja identificar as manchas na mistura, obviamente não pode fazê-lo com substâncias de comparação no mesmo cromatograma que examinamos anteriormente com as canetas ou exemplos de aminoácidos. Você acabaria com uma confusão de manchas sem sentido.

Você pode, no entanto, calcular o Rf valores para cada um dos pontos em ambos os solventes e, em seguida, compare-os com os valores que você mediu para compostos conhecidos sob exatamente as mesmas condições.

Como funciona a cromatografia em papel?

Embora a cromatografia em papel seja simples de fazer, é bastante difícil de explicar em comparação com a cromatografia em camada fina. A explicação depende, até certo ponto, do tipo de solvente que você está usando, e muitas fontes encobrem o problema completamente. Se você ainda não fez isso, seria útil se você pudesse ler a explicação de como funciona a cromatografia de camada fina (link abaixo). Isso vai me poupar muita repetição e posso me concentrar nos problemas.

Observação: Você encontrará a explicação de como a cromatografia de camada fina funciona seguindo este link.

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A estrutura essencial do papel

O papel é feito de fibras de celulose e a celulose é um polímero do açúcar simples, a glicose.

O ponto-chave sobre a celulose é que as cadeias de polímero têm grupos -OH projetando-se ao redor delas. Nessa medida, apresenta o mesmo tipo de superfície que a sílica gel ou alumina na cromatografia em camada delgada.

Seria tentador tentar explicar a cromatografia em papel em termos da maneira como diferentes compostos são adsorvidos em diferentes extensões na superfície do papel. Em outras palavras, seria bom ser capaz de usar a mesma explicação para cromatografia em camada fina e em papel. Infelizmente, é mais complicado do que isso!

A complicação surge porque as fibras de celulose atraem o vapor d'água da atmosfera, bem como qualquer água que estava presente quando o papel foi feito. Portanto, você pode pensar no papel como sendo fibras de celulose com uma camada muito fina de moléculas de água ligadas à superfície.

É a interação com essa água o efeito mais importante durante a cromatografia em papel.

Cromatografia de papel usando um solvente não polar

Suponha que você use um solvente apolar, como hexano, para desenvolver seu cromatograma.

As moléculas apolares na mistura que você está tentando separar terão pouca atração pelas moléculas de água ligadas à celulose e, portanto, passarão a maior parte do tempo dissolvidas no solvente em movimento. Moléculas como essa, portanto, viajarão muito pelo papel transportadas pelo solvente. Eles terão um R relativamente altof valores.

Por outro lado, as moléculas polares vai têm alta atração para as moléculas de água e muito menos para o solvente apolar. Portanto, eles tendem a se dissolver na fina camada de água ao redor das fibras de celulose muito mais do que no solvente em movimento.

Por passarem mais tempo dissolvidos na fase estacionária e menos tempo na fase móvel, eles não vão subir muito rápido no papel.

A tendência de um composto dividir seu tempo entre dois solventes imiscíveis (solventes como hexano e água que não se misturam) é conhecida como partição. A cromatografia em papel usando um solvente não polar é, portanto, um tipo de cromatografia de partição.

Cromatografia de papel usando água e outros solventes polares

Um momento de reflexão dirá que a partição não pode ser a explicação se você estiver usando água como solvente para a mistura. Se você tem água como fase móvel e a água ligada à celulose como fase estacionária, não pode haver nenhuma diferença significativa entre a quantidade de tempo que uma substância passa em solução em qualquer uma delas. Todas as substâncias devem ser igualmente solúveis (ou igualmente insolúveis) em ambos.

E, no entanto, os primeiros cromatogramas que você fez provavelmente eram de tintas usando água como solvente.

Se a água funciona como fase móvel e também como fase estacionária, deve haver algum mecanismo bem diferente em funcionamento - e isso deve ser igualmente verdadeiro para outros solventes polares como os álcoois, por exemplo. A partição só acontece entre solventes que não se misturam. Os solventes polares, como os pequenos álcoois, se misturam com a água.

Ao pesquisar este tópico, não encontrei nenhuma explicação fácil para o que acontece nesses casos. A maioria das fontes ignora o problema completamente e apenas cita a explicação da partição sem fazer qualquer concessão para o tipo de solvente que você está usando. Outras fontes citam mecanismos que possuem tantas vertentes que são complicados demais para este nível introdutório. Portanto, não vou levar isso adiante - você não precisa se preocupar com isso no nível A do Reino Unido, ou seus vários equivalentes.

Observação: Se eu perdi algo óbvio em minha pesquisa e você sabe de uma explicação direta (vale cerca de 1 ou 2 pontos em um exame) para o que acontece com água e outros solventes polares, você poderia entrar em contato comigo através do endereço na página sobre este site .

Perguntas para testar sua compreensão

Se este for o primeiro conjunto de perguntas que você fez, leia a página introdutória antes de começar. Você precisará usar o BOTÃO VOLTAR do seu navegador para voltar aqui depois.


Diferenças entre o uso de acetonitrila e metanol para cromatografia de fase reversa

Os solventes orgânicos mais comumente usados ​​para fases móveis em cromatografia reversa são provavelmente acetonitrila e metanol. Os preços de lista (exemplos) para reagentes comerciais desses solventes são indicados abaixo.

Como mostrado, o acetonitrila é muito caro, especialmente para o grau LC. No entanto, as condições analíticas indicadas em materiais de referência e pelos fabricantes de LC usam mais frequentemente acetonitrila. Por que é que? Esse é o assunto desta página.

2. Absorvância - Acetonitrila de grau LC é a mais baixa

As Figuras 1 e 2 são espectros de absorção para LC e classes especiais de reagentes comerciais de acetonitrila e metanol, respectivamente. O grau LC significa que as impurezas que absorvem a luz ultravioleta foram removidas (não que a pureza absoluta seja maior) e a absorbância de comprimentos de onda especificados é mantida dentro de uma faixa especificada. As figuras mostram que, desses quatro reagentes, o acetonitrila grau LC tem a menor absorbância, principalmente para comprimentos de onda mais curtos. Uma vez que quanto menor a absorbância de um solvente orgânico usado para fases móveis, menor o ruído na detecção de UV, o O acetonitrila de grau LC é mais adequado para análises de alta sensibilidade em comprimentos de onda UV curtos. Além disso, o acetonitrila de grau LC resulta em menos fantasma de pico para linhas de base de gradiente. Embora existam vários outros solventes orgânicos com alta compatibilidade com água, aparentemente nenhum tem absorção mais baixa do que o acetonitrila de grau LC.

Como uma digressão, o seguinte descreve um exemplo de um problema que ocorreu com relação aos tipos de reagentes. Uma certa pessoa, "Sr. A", estava medindo efedrina em efedrina a 210 nm, mas só foi capaz de obter dados com ruído mais alto do que seu predecessor. Depois de ficar desanimado com suas habilidades analíticas, ele perguntou ao predecessor novamente sobre a análise e soube que o predecessor havia usado acetonitrila de grau LC, enquanto o Sr. A usava grau especial, devido ao custo. Ele estava lutando para usar uma fase móvel com um valor de fundo várias dezenas de vezes maior do que o da classe LC. Alegadamente, depois disso, ele estabeleceu uma regra estrita de sempre descrever o fabricante e o grau do reagente em condições analíticas.
No caso do metanol, não há diferença significativa nos espectros de LC e classes especiais, mas a absorbância não é garantida para a classe especial, portanto é mais provável que tenha maior variabilidade. Uma vez que o preço não é tão diferente, o grau LC deve ser usado sempre que possível.

3. Pressão - O acetonitrila é inferior

A pressão experimentada pelas colunas varia dependendo do tipo e proporção da mistura de solventes orgânicos. A Figura 3 mostra a relação entre a proporção da mistura e a pressão de entrega para misturas de água / acetonitrila e água / metanol. A pressão para o metanol aumenta quando misturado com água, mas não tanto para o acetonitrila. Consequentemente, dada a mesma taxa de fluxo, as soluções à base de acetonitrila aplicam menos pressão à coluna. Com base nas duas questões discutidas acima, confirmamos as razões para o uso de acetonitrila. Porém, o metanol tem alguma vantagem em relação ao preço? Continuamos nossa comparação abaixo.

4. Força de eluição - O acetonitrila é geralmente mais alto

Quando o acetonitrila e o metanol são respectivamente misturados com água na mesma proporção, a solução à base de acetonitrila geralmente tem uma força de eluição mais alta. Em particular, em alguns casos onde a proporção da mistura é baixa, os mesmos tempos de retenção podem ser alcançados usando acetonitrila com menos da metade da proporção de metanol, como pode ser visto para cafeína e fenóis (Figura 4).
Por outro lado, para solventes orgânicos em ou muito perto de 100%, o metanol geralmente tem uma força de eluição maior, como pode ser visto para o caroteno e o colesterol (Figura 5). As propriedades das soluções de mistura podem ser difíceis de compreender, mas em casos como este, as propriedades (polaridades) dos solventes individuais parecem vir à tona.
Para proporções de mistura mais extremas, como 50: 1, quaisquer erros do operador durante a preparação podem ter um efeito significativo nos tempos de retenção ou aumentar o tempo para atingir o equilíbrio. Se isso ocorrer com uma solução à base de acetonitrila, o uso de metanol permitirá o uso de uma proporção menor, como 10: 1, o que pode facilitar o preparo.

5. Seletividade de separação (eluição) - difere para cada um

A seletividade de separação difere para acetonitrila e metanol. O exemplo na Figura 6 mostra que a ordem de eluição do fenol e do ácido benzóico é invertida. (No entanto, para altas proporções de água, o fenol é eluído primeiro, mesmo para soluções à base de acetonitrila.) Isso provavelmente se deve às diferenças nas propriedades químicas das moléculas do solvente orgânico. (Metanol e etanol são próticos, mas acetonitrila e tetrahidrofurano são apróticos.) Conseqüentemente, se a acetonitrila não fornecer seletividade de separação adequada, tente metanol.

6. Formato do pico - às vezes há diferenças

Para compostos como o ácido salicílico (fenol com grupo carboxila ou metoxi na posição orto), o acetonitrila pode causar cauda significativa, que pode ser suprimida pelo uso de metanol. This is probably caused by differences in the way the mobile phases relate to the mutual interaction (adsorption) between the silica surfaces and target components, due to the chemical properties of the organic solvent molecules.
Also, polymer-based reversed-phase columns generally tend to result in broader peaks than silica-based columns. This is particularly common for aromatic compounds in polystyrene columns. This is especially noticeable when using methanol-based mobile phases, whereas it is not very noticeable for acetonitrile-based mobile phases. Consequently, the latter is recommended for polymer reversed phase columns. The reason is presumably because of an affinity of organic solvents for gels, which causes the pore structure to change.

7. Mobile Phase Degassing - Use Caution With Acetonitrile

The following discusses preparing solvent mixtures ahead of time, in a mobile phase bottle (isocratic), instead of inside the LC system.
When methanol is mixed with water, it releases heat, which tends to facilitate releasing any extraneous dissolved air as bubbles (facilitates degassing). In contrast, acetonitrile cools the temperature by absorbing heat, so air bubbles are generated later, as it gradually returns to room temperature. Consequently, more care is required with respect to degassing. (Refer to LCtalk Special Issue 5 regarding heated stirring, membrane degassers, helium purging, and so on).

8. Summary

The organic solvents most commonly used for mobile phases in reverse chromatography, acetonitrile and methanol, were compared. In general, using LC grade acetonitrile is the safest choice. If selectivity or peak shape is poor, try LC grade methanol, but it can also be effective to set analytical conditions by carefully considering the properties of each solvent.


RESULTS AND DISCUSSION

Fig. 1 outlines the general strategy of the practical protocol in a flow chart. Fig. 2 shows the elution profile of 40–60% ammonium sulfate precipitation protein that was loaded onto a Superdex G-75 column (500 μg of concentrated protein was applied to the column) and eluted out with 10 m M Tris-HCl buffer (pH 7.8). The fractions obtained were tested for their inhibitory activity by the dot-blot method. The tubes (numbers 41–52) showed the inhibitory activity. These tubes were used for electrophoretic analysis.

Fig. 3 shows the gel-x-r ay film contact print photograph. Lane 1 shows the crude extract, lane 2 shows the 0–40% ammonium sulfate precipitation, lane 3 shows the 40–60% ammonium sulfate precipitation, and lane 4 shows the 60–90% ammonium sulfate precipitation. These results show that the crude extract contained all the inhibitors (ou seja, trypsin and chymotrypsin inhibitors) and that the ammonium sulfate fractions showed different isoforms of inhibitors. In particular, the 40–60% ammonium sulfate-precipitated protein showed more specific inhibition toward trypsin than chymotrypsin. Similarly the 60–90% fraction had more affinity for chymotrypsin inhibition. Therefore, from the above observations, we can designate the 40–60%-saturated protein as trypsin inhibitors and the 60–90%-saturated proteins as chymotrypsin inhibitors (em vitro analysis confirms these results). It is evident that the inhibitory activity is distributed among the different isoforms of inhibitors in the legume seeds.

Fig. 4 shows the electrophoretically separated gel filtration fractions (numbers 41–52). These fractions were loaded onto a gel (non-denaturing) and were stained for activity using 0.1% trypsin as a substrate. It was observed that there are about six to eight isoinhibitors depending upon the time of development. No extra bands were detected even when the gel was incubated with the x-ray films for more than 30 min.

There are several reported methods of visualization of protease inhibitors [ 19 ]. The method we described here requires neither ampholytes nor synthetic substrates, so it is cheaper and more convenient. Preparation of gels is simpler than in methods that incorporate substrates in a gel [ 7 ]. X-ray films can be stored as records, and an immediate photograph is not essential. The time required for visualization on inhibitor bands is much shorter (less than 1 h for non-SDS and 2 h for SDS-PAGE) than are most other methods. The protease solution used for visualizing inhibitor bands in the gel can be reused several times, and therefore, the amount of proteases required is much less than in methods involving agarose overlaying [ 20 ]. The protease concentrations for the visualization of protease inhibitors in gels are only indicators of the range, as the protease concentrations and solution volume are changed by repeated use of the same solution. More protease can be added to the used protease solution to restore the activity and the volume to the desired level.

This method is fairly reliable, and gel storage does not appear to cause a serious problem. This method can be applied for visualization of isoelectrophoretically separated protease inhibitors and estimation of their isoelectric points. 2 2 K. Sudheendra, unpublished data. The use of single side-coated x-ray films will obviate the need to remove the coating on one side of the two side-coated film. The inhibitor activity bands are clearly visible even without removing the gelatin coating on the other side of the film. However, removal of coating on the other side of the film improves the contrast for developing the x-ray film.

With exposure to x-ray film and rinsing the gel, the protease concentration goes down, and lower inhibitory activity bands become visible. However, under these conditions higher inhibitory activity bands appear much thicker and broader. So exposing the same gel a few times to fresh films allows the detection of even closely spaced, high activity bands in the beginning and the low activity bands in the later exposures. High activity inhibitor bands can be resolved by increasing, and low activity inhibitor bands by decreasing, gel-x-r ay film incubation time. Even after several exposures, the same gel can be incubated again in protease solution, and inhibitor bands can be visualized.

However, visualization of poorly resolved or closely spaced high and low inhibitory activity bands will be difficult with this method. Protease inhibitors can be detected using photographic paper instead of x-ray film. However, paper needs to be incubated with the x-ray film for a longer time. X-ray film is more sensitive than photographic paper.

Based on our experience with this assay to detect protease inhibitors, there appears to be little variation between different lots of films (x-ray). The results are immediately available after electrophoresis and are rapid and reproducible (after electrophoresis the results can be observed on x-ray film within 1 h). Also this method is inexpensive a box of 25 films (20 × 25 cm) can accommodate up to 50 assays ($5.00 per box). The presence of a well defined end point and the simplicity of the experiment allows this experiment to be carried out by undergraduate and graduate students.


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Ion chromatography has advanced through the accumulation of knowledge over a course of many years. Starting from 1947, Spedding and Powell used displacement ion-exchange chromatography for the separation of the rare earths. Additionally, they showed the ion-exchange separation of 14N and 15N isotopes in ammonia. At the start of the 1950s, Kraus and Nelson demonstrated the use of many analytical methods for metal ions dependent on their separation of their chloride, fluoride, nitrate or sulfate complexes by anion chromatography. Automatic in-line detection was progressively introduced from 1960 to 1980 as well as novel chromatographic methods for metal ion separations. A groundbreaking method by Small, Stevens and Bauman at Dow Chemical Co. unfolded the creation of the modern ion chromatography. Anions and cations could now be separated efficiently by a system of suppressed conductivity detection. In 1979, a method for anion chromatography with non-suppressed conductivity detection was introduced by Gjerde et al. Following it in 1980, was a similar method for cation chromatography. [10]

As a result, a period of extreme competition began within the IC market, with supporters for both suppressed and non-suppressed conductivity detection. This competition led to fast growth of new forms and the fast evolution of IC. [11] A challenge that needs to be overcome in the future development of IC is the preparation of highly efficient monolithic ion-exchange columns and overcoming this challenge would be of great importance to the development of IC. [12]

The boom of Ion exchange chromatography primarily began between 1935–1950 during World War II and it was through the "Manhattan project" that applications and IC were significantly extended. Ion chromatography was originally introduced by two English researchers, agricultural Sir Thompson and chemist J T Way. The works of Thompson and Way involved the action of water-soluble fertilizer salts, ammonium sulfate and potassium chloride. These salts could not easily be extracted from the ground due to the rain. They performed ion methods to treat clays with the salts, resulting in the extraction of ammonia in addition to the release of calcium. [13] [ unreliable source? ] It was in the fifties and sixties that theoretical models were developed for IC for further understanding and it was not until the seventies that continuous detectors were utilized, paving the path for the development from low-pressure to high-performance chromatography. Not until 1975 was "ion chromatography" established as a name in reference to the techniques, and was thereafter used as a name for marketing purposes. Today IC is important for investigating aqueous systems, such as drinking water. It is a popular method for analyzing anionic elements or complexes that help solve environmentally relevant problems. Likewise, it also has great uses in the semiconductor industry.

Because of the abundant separating columns, elution systems, and detectors available, chromatography has developed into the main method for ion analysis. [14]

When this technique was initially developed, it was primarily used for water treatment. Since 1935, ion exchange chromatography rapidly manifested into one of the most heavily leveraged techniques, with its principles often being applied to majority of fields of chemistry, including distillation, adsorption, and filtration. [15]

Ion-exchange chromatography separates molecules based on their respective charged groups. Ion-exchange chromatography retains analyte molecules on the column based on coulombic (ionic) interactions. The ion exchange chromatography matrix consists of positively and negatively charged ions. [16] Essentially, molecules undergo electrostatic interactions with opposite charges on the stationary phase matrix. The stationary phase consists of an immobile matrix that contains charged ionizable functional groups or ligands. [17] The stationary phase surface displays ionic functional groups (R-X) that interact with analyte ions of opposite charge. To achieve electroneutrality, these inert charges couple with exchangeable counterions in the solution. Ionizable molecules that are to be purified compete with these exchangeable counterions for binding to the immobilized charges on the stationary phase. These ionizable molecules are retained or eluted based on their charge. Initially, molecules that do not bind or bind weakly to the stationary phase are first to wash away. Altered conditions are needed for the elution of the molecules that bind to the stationary phase. The concentration of the exchangeable counterions, which competes with the molecules for binding, can be increased or the pH can be changed. A change in pH affects the charge on the particular molecules and, therefore, alters binding. The molecules then start eluting out based on the changes in their charges from the adjustments. Further such adjustments can be used to release the protein of interest. Additionally, concentration of counterions can be gradually varied to separate ionized molecules. This type of elution is called gradient elution. On the other hand, step elution can be used in which the concentration of counterions are varied in one step. [1] This type of chromatography is further subdivided into cation exchange chromatography and anion-exchange chromatography. Positively charged molecules bind to cation exchange resins while negatively charged molecules bind to anion exchange resins. [18] The ionic compound consisting of the cationic species M+ and the anionic species B- can be retained by the stationary phase.

Cation exchange chromatography retains positively charged cations because the stationary phase displays a negatively charged functional group:

Anion exchange chromatography retains anions using positively charged functional group:

Note that the ion strength of either C+ or A- in the mobile phase can be adjusted to shift the equilibrium position, thus retention time.

The ion chromatogram shows a typical chromatogram obtained with an anion exchange column.

Before ion-exchange chromatography can be initiated, it must be equilibrated. The stationary phase must be equilibrated to certain requirements that depend on the experiment that you are working with. Once equilibrated, the charged ions in the stationary phase will be attached to its opposite charged exchangeable ions. Exchangeable ions such as Cl- or Na+. Next, a buffer should be chosen in which the desired protein can bind to. After equilibration, the column needs to be washed. The washing phase will help elute out all impurities that does not bind to the matrix while the protein of interest remains bounded. This sample buffer needs to have the same pH as the buffer used for equilibration to help bind the desired proteins. Uncharged proteins will be eluted out of the column at a similar speed of the buffer flowing through the column. Once the sample has been loaded onto to the column and the column has been washed with the buffer to elute out all non-desired proteins, elution is carried out to elute the desired proteins that are bound to the matrix. Bound proteins are eluted out by utilizing a gradient of linearly increasing salt concentration. With increasing ionic strength of the buffer, the salt ions will compete with the desired proteins in order to bind to charged groups on the surface of the medium. This will cause desired proteins to be eluted out of the column. Proteins that have a low net charge will be eluted out first as the salt concentration increases causing the ionic strength to increase. Proteins with high net charge will need a higher ionic strength for them to be eluted out of the column. [16] It is possible to perform ion exchange chromatography in bulk, on thin layers of medium such as glass or plastic plates coated with a layer of the desired stationary phase, or in chromatography columns. Thin layer chromatography or column chromatography share similarities in that they both act within the same governing principles there is constant and frequent exchange of molecules as the mobile phase travels along the stationary phase. It is not imperative to add the sample in minute volumes as the predetermined conditions for the exchange column have been chosen so that there will be strong interaction between the mobile and stationary phases. Furthermore, the mechanism of the elution process will cause a compartmentalization of the differing molecules based on their respective chemical characteristics. This phenomenon is due to an increase in salt concentrations at or near the top of the column, thereby displacing the molecules at that position, while molecules bound lower are released at a later point when the higher salt concentration reaches that area. These principles are the reasons that ion exchange chromatography is an excellent candidate for initial chromatography steps in a complex purification procedure as it can quickly yield small volumes of target molecules regardless of a greater starting volume. [2]

Comparatively simple devices are often used to apply counterions of increasing gradient to a chromatography column. Counterions such as copper (II) are chosen most often for effectively separating peptides and amino acids through complex formation. [19]

A simple device can be used to create a salt gradient. Elution buffer is consistently being drawn from the chamber into the mixing chamber, thereby altering its buffer concentration. Generally, the buffer placed into the chamber is usually of high initial concentration, whereas the buffer placed into the stirred chamber is usually of low concentration. As the high concentration buffer from the left chamber is mixed and drawn into the column, the buffer concentration of the stirred column gradually increase. Altering the shapes of the stirred chamber, as well as of the limit buffer, allows for the production of concave, linear, or convex gradients of counterion.

A multitude of different mediums are used for the stationary phase. Among the most common immobilized charged groups used are trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoethyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulpho (S), sulphomethyl (SM), sulphopropyl (SP), carboxy (C), and carboxymethyl (CM). [1]

Successful packing of the column is an important aspect of ion chromatography. Stability and efficiency of a final column depends on packing methods, solvent used, and factors that affect mechanical properties of the column. In contrast to early inefficient dry- packing methods, wet slurry packing, in which particles that are suspended in an appropriate solvent are delivered into a column under pressure, shows significant improvement. Three different approaches can be employed in performing wet slurry packing: the balanced density method (solvent’s density is about that of porous silica particles), the high viscosity method (a solvent of high viscosity is used), and the low viscosity slurry method (performed with low viscosity solvents). [20]

Polystyrene is used as a medium for ion- exchange. It is made from the polymerization of styrene with the use of divinylbenzene and benzoyl peroxide. Such exchangers form hydrophobic interactions with proteins which can be irreversible. Due to this property, polystyrene ion exchangers are not suitable for protein separation. They are used on the other hand for the separation of small molecules in amino acid separation and removal of salt from water. Polystyrene ion exchangers with large pores can be used for the separation of protein but must be coated with a hydrophilic substance. [21]

Cellulose based medium can be used for the separation of large molecules as they contain large pores. Protein binding in this medium is high and has low hydrophobic character. DEAE is an anion exchange matrix that is produced from a positive side group of diethylaminoethyl bound to cellulose or Sephadex. [22]

Agarose gel based medium contain large pores as well but their substitution ability is lower in comparison to dextrans. The ability of the medium to swell in liquid is based on the cross-linking of these substances, the pH and the ion concentrations of the buffers used. [21]

Incorporation of high temperature and pressure allows a significant increase in the efficiency of ion chromatography, along with a decrease in time. Temperature has an influence of selectivity due to its effects on retention properties. The retention factor (k = (tR g − tM g )/(tM g − text)) increases with temperature for small ions, and the opposite trend is observed for larger ions. [23] [24]

Despite ion selectivity in different mediums, further research is being done to perform ion exchange chromatography through the range of 40–175 °C. [25]

An appropriate solvent can be chosen based on observations of how column particles behave in a solvent. Using an optical microscope, one can easily distinguish a desirable dispersed state of slurry from aggregated particles. [20]

A "strong" ion exchanger will not lose the charge on its matrix once the column is equilibrated and so a wide range of pH buffers can be used. "Weak" ion exchangers have a range of pH values in which they will maintain their charge. If the pH of the buffer used for a weak ion exchange column goes out of the capacity range of the matrix, the column will lose its charge distribution and the molecule of interest may be lost. [26] Despite the smaller pH range of weak ion exchangers, they are often used over strong ion exchangers due to their having greater specificity. In some experiments, the retention times of weak ion exchangers are just long enough to obtain desired data at a high specificity. [27]

Resins (often termed 'beads') of ion exchange columns may include functional groups such as weak/strong acids and weak/strong bases. There are also special columns that have resins with amphoteric functional groups that can exchange both cations and anions. [28] Some examples of functional groups of strong ion exchange resins are quaternary ammonium cation (Q), which is an anion exchanger, and sulfonic acid (S, -SO2OH), which is a cation exchanger. [29] These types of exchangers can maintain their charge density over a pH range of 0–14. Examples of functional groups of Weak ion exchange resins include diethylaminoethyl (DEAE, -C2H4N(CH2H5)2), which is an anion exchanger, and carboxymethyl (CM, -CH2-COOH), [30] which is a cation exchanger. These two types of exchangers can maintain the charge density of their columns over a pH range of 5–9. [ citação necessária ]

In ion chromatography, the interaction of the solute ions and the stationary phase based on their charges determines which ions will bind and to what degree. When the stationary phase features positive groups which attracts anions, it is called an anion exchanger when there are negative groups on the stationary phase, cations are attracted and it is a cation exchanger. [31] The attraction between ions and stationary phase also depends on the resin, organic particles used as ion exchangers.

Each resin features relative selectivity which varies based on the solute ions present who will compete to bind to the resin group on the stationary phase. The selectivity coefficient, the equivalent to the equilibrium constant, is determined via a ratio of the concentrations between the resin and each ion, however, the general trend is that ion exchangers prefer binding to the ion with a higher charge, smaller hydrated radius, and higher polarizability, or the ability for the electron cloud of an ion to be disrupted by other charges. [32] Despite this selectivity, excess amounts of an ion with a lower selectivity introduced to the column would cause the lesser ion to bind more to the stationary phase as the selectivity coefficient allows fluctuations in the binding reaction that takes place during ion exchange chromatography.

Following table shows the commonly used ion exchangers [33]

Sr. No Nome Modelo Grupo funcional
1 DEAE Cellulose (Anion exchanger) Weakly basic DEAE (Diethylaminoethyl)
2 QAE Sephadex (Anion exchanger) Strongly basic QAE (Quaternary aminoethyl)
3 Q Sepharose (Anion exchanger) Strongly basic Q (Quaternary ammonium)
4 CM- Cellulose (Cation exchanger) Weakly acidic CM (Carboxymethyl)
5 SP Sepharose (Cation exchanger) Strongly acidic SP (Sulfopropyl)
6 SOURCE S (Cation exchanger) Strongly acidic S (Methyl sulfate)

A sample is introduced, either manually or with an autosampler, into a sample loop of known volume. A buffered aqueous solution known as the mobile phase carries the sample from the loop onto a column that contains some form of stationary phase material. This is typically a resin or gel matrix consisting of agarose or cellulose beads with covalently bonded charged functional groups. Equilibration of the stationary phase is needed in order to obtain the desired charge of the column. If the column is not properly equilibrated the desired molecule may not bind strongly to the column. The target analytes (anions or cations) are retained on the stationary phase but can be eluted by increasing the concentration of a similarly charged species that displaces the analyte ions from the stationary phase. For example, in cation exchange chromatography, the positively charged analyte can be displaced by adding positively charged sodium ions. The analytes of interest must then be detected by some means, typically by conductivity or UV/visible light absorbance.

Control an IC system usually requires a chromatography data system (CDS). In addition to IC systems, some of these CDSs can also control gas chromatography (GC) and HPLC.

A type of ion exchange chromatography, membrane exchange [34] [35] is a relatively new method of purification designed to overcome limitations of using columns packed with beads. Membrane Chromatographic [36] [37] devices are cheap to mass-produce and disposable unlike other chromatography devices that require maintenance and time to revalidate. There are three types of membrane absorbers that are typically used when separating substances. The three types are flat sheet, hollow fibre, and radial flow. The most common absorber and best suited for membrane chromatography is multiple flat sheets because it has more absorbent volume. It can be used to overcome mass transfer limitations [38] and pressure drop, [39] making it especially advantageous for isolating and purifying viruses, plasmid DNA, and other large macromolecules. The column is packed with microporous membranes with internal pores which contain adsorptive moieties that can bind the target protein. Adsorptive membranes are available in a variety of geometries and chemistry which allows them to be used for purification and also fractionation, concentration, and clarification in an efficiency that is 10 fold that of using beads. [40] Membranes can be prepared through isolation of the membrane itself, where membranes are cut into squares and immobilized. A more recent method involved the use of live cells that are attached to a support membrane and are used for identification and clarification of signaling molecules. [41]

Ion exchange chromatography can be used to separate proteins because they contain charged functional groups. The ions of interest (in this case charged proteins) are exchanged for another ions (usually H + ) on a charged solid support. The solutes are most commonly in a liquid phase, which tends to be water. Take for example proteins in water, which would be a liquid phase that is passed through a column. The column is commonly known as the solid phase since it is filled with porous synthetic particles that are of a particular charge. These porous particles are also referred to as beads, may be aminated (containing amino groups) or have metal ions in order to have a charge. The column can be prepared using porous polymers, for macromolecules over 100,000 the optimum size of the porous particle is about 1 μm 2 . This is because slow diffusion of the solutes within the pores does not restrict the separation quality. [42] The beads containing positively charged groups, which attract the negatively charged proteins, are commonly referred to as anion exchange resins. The amino acids that have negatively charged side chains at pH 7 (pH of water) are glutamate and aspartate. The beads that are negatively charged are called cation exchange resins, as positively charged proteins will be attracted. The amino acids that have positively charged side chains at pH 7 are lysine, histidine and arginine. [43]

The isoelectric point is the pH at which a compound - in this case a protein - has no net charge. A protein’s isoelectric point or PI can be determined using the pKa of the side chains, if the amino (positive chain) is able to cancel out the carboxyl (negative) chain, the protein would be at its PI. Using buffers instead of water for proteins that do not have a charge at pH 7, is a good idea as it enables the manipulation of pH to alter ionic interactions between the proteins and the beads. [44] Weakly acidic or basic side chains are able to have a charge if the pH is high or low enough respectively. Separation can be achieved based on the natural isoelectric point of the protein. Alternatively a peptide tag can be genetically added to the protein to give the protein an isoelectric point away from most natural proteins (e.g., 6 arginines for binding to a cation-exchange resin or 6 glutamates for binding to an anion-exchange resin such as DEAE-Sepharose).

Elution by increasing ionic strength of the mobile phase is more subtle. It works because ions from the mobile phase interact with the immobilized ions on the stationary phase, thus "shielding" the stationary phase from the protein, and letting the protein elute.

Elution from ion-exchange columns can be sensitive to changes of a single charge- chromatofocusing. Ion-exchange chromatography is also useful in the isolation of specific multimeric protein assemblies, allowing purification of specific complexes according to both the number and the position of charged peptide tags. [45] [46]

Gibbs–Donnan effect Edit

In ion exchange chromatography, the Gibbs–Donnan effect is observed when the pH of the applied buffer and the ion exchanger differ, even up to one pH unit. For example, in anion-exchange columns, the ion exchangers repeal protons so the pH of the buffer near the column differs is higher than the rest of the solvent. [47] As a result, an experimenter has to be careful that the protein(s) of interest is stable and properly charged in the "actual" pH.

This effect comes as a result of two similarly charged particles, one from the resin and one from the solution, failing to distribute properly between the two sides there is a selective uptake of one ion over another. [48] [49] For example, in a sulphonated polystyrene resin, a cation exchange resin, the chlorine ion of a hydrochloric acid buffer should equilibrate into the resin. However, since the concentration of the sulphonic acid in the resin is high, the hydrogen of HCl has no tendency to enter the column. This, combined with the need of electroneutrality, leads to a minimum amount of hydrogen and chlorine entering the resin. [49]

Clinical utility Edit

A use of ion chromatography can be seen in the argentation ion chromatography. [ citação necessária ] Usually, silver and compounds containing acetylenic and ethylenic bonds have very weak interactions. This phenomenon has been widely tested on olefin compounds. The ion complexes the olefins make with silver ions are weak and made based on the overlapping of pi, sigma, and d orbitals and available electrons therefore cause no real changes in the double bond. This behavior was manipulated to separate lipids, mainly fatty acids from mixtures in to fractions with differing number of double bonds using silver ions. The ion resins were impregnated with silver ions, which were then exposed to various acids (silicic acid) to elute fatty acids of different characteristics.

Detection limits as low as 1 μM can be obtained for alkali metal ions. [50] It may be used for measurement of HbA1c, porphyrin and with water purification. Ion Exchange Resins(IER) have been widely used especially in medicines due to its high capacity and the uncomplicated system of the separation process. One of the synthetic uses is to use Ion Exchange Resins for kidney dialysis. This method is used to separate the blood elements by using the cellulose membraned artificial kidney. [51]

Another clinical application of ion chromatography is in the rapid anion exchange chromatography technique used to separate creatine kinase (CK) isoenzymes from human serum and tissue sourced in autopsy material (mostly CK rich tissues were used such as cardiac muscle and brain). [ citação necessária ] These isoenzymes include MM, MB, and BB, which all carry out the same function given different amino acid sequences. The functions of these isoenzymes are to convert creatine, using ATP, into phosphocreatine expelling ADP. Mini columns were filled with DEAE-Sephadex A-50 and further eluted with tris- buffer sodium chloride at various concentrations (each concentration was chosen advantageously to manipulate elution). Human tissue extract was inserted in columns for separation. All fractions were analyzed to see total CK activity and it was found that each source of CK isoenzymes had characteristic isoenzymes found within. Firstly, CK- MM was eluted, then CK-MB, followed by CK-BB. Therefore, the isoenzymes found in each sample could be used to identify the source, as they were tissue specific.

Using the information from results, correlation could be made about the diagnosis of patients and the kind of CK isoenzymes found in most abundant activity. From the finding, about 35 out of 71 patients studied suffered from heart attack (myocardial infarction) also contained an abundant amount of the CK-MM and CK-MB isoenzymes. Findings further show that many other diagnosis including renal failure, cerebrovascular disease, and pulmonary disease were only found to have the CK-MM isoenzyme and no other isoenzyme. The results from this study indicate correlations between various diseases and the CK isoenzymes found which confirms previous test results using various techniques. Studies about CK-MB found in heart attack victims have expanded since this study and application of ion chromatography.

Industrial applications Edit

Since 1975 ion chromatography has been widely used in many branches of industry. The main beneficial advantages are reliability, very good accuracy and precision, high selectivity, high speed, high separation efficiency, and low cost of consumables. The most significant development related to ion chromatography are new sample preparation methods improving the speed and selectivity of analytes separation lowering of limits of detection and limits of quantification extending the scope of applications development of new standard methods miniaturization and extending the scope of the analysis of a new group of substances. Allows for quantitative testing of electrolyte and proprietary additives of electroplating baths. [52] It is an advancement of qualitative hull cell testing or less accurate UV testing. Ions, catalysts, brighteners and accelerators can be measured. [52] Ion exchange chromatography has gradually become a widely known, universal technique for the detection of both anionic and cationic species. Applications for such purposes have been developed, or are under development, for a variety of fields of interest, and in particular, the pharmaceutical industry. The usage of ion exchange chromatography in pharmaceuticals has increased in recent years, and in 2006, a chapter on ion exchange chromatography was officially added to the United States Pharmacopia-National Formulary (USP-NF). Furthermore, in 2009 release of the USP-NF, the United States Pharmacopia made several analyses of ion chromatography available using two techniques: conductivity detection, as well as pulse amperometric detection. Majority of these applications are primarily used for measuring and analyzing residual limits in pharmaceuticals, including detecting the limits of oxalate, iodide, sulfate, sulfamate, phosphate, as well as various electrolytes including potassium, and sodium. In total, the 2009 edition of the USP-NF officially released twenty eight methods of detection for the analysis of active compounds, or components of active compounds, using either conductivity detection or pulse amperometric detection. [53]

Drug development Edit

There has been a growing interest in the application of IC in the analysis of pharmaceutical drugs. IC is used in different aspects of product development and quality control testing. For example, IC is used to improve stabilities and solubility properties of pharmaceutical active drugs molecules as well as used to detect systems that have higher tolerance for organic solvents. IC has been used for the determination of analytes as a part of a dissolution test. For instance, calcium dissolution tests have shown that other ions present in the medium can be well resolved among themselves and also from the calcium ion. Therefore, IC has been employed in drugs in the form of tablets and capsules in order to determine the amount of drug dissolve with time. [54] IC is also widely used for detection and quantification of excipients or inactive ingredients used in pharmaceutical formulations. Detection of sugar and sugar alcohol in such formulations through IC has been done due to these polar groups getting resolved in ion column. IC methodology also established in analysis of impurities in drug substances and products. Impurities or any components that are not part of the drug chemical entity are evaluated and they give insights about the maximum and minimum amounts of drug that should be administered in a patient per day. [55]


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