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6.4B: Cultura Pura - Biologia

6.4B: Cultura Pura - Biologia


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objetivos de aprendizado

  • Descreva como as culturas microbianas puras podem ser cultivadas em meio de crescimento à base de ágar

As culturas microbianas são métodos diagnósticos básicos e fundamentais usados ​​extensivamente como uma ferramenta de pesquisa em biologia molecular. Freqüentemente, é essencial isolar uma cultura pura de microorganismos. Uma cultura pura (ou axênica) é uma população de células ou organismos multicelulares que crescem na ausência de outras espécies ou tipos. Uma cultura pura pode se originar de uma única célula ou organismo, caso em que as células são clones genéticos umas das outras. Para efeito de gelificação da cultura microbiana, é utilizado o meio de gel de agarose (ágar). O ágar é uma substância gelatinosa derivada de algas marinhas. Um substituto barato para o ágar é a goma de guar, que pode ser usada para o isolamento e manutenção de termófilos.

As culturas microbiológicas podem ser cultivadas em placas de Petri de tamanhos diferentes que possuem uma camada fina de meio de crescimento à base de ágar. Uma vez que o meio de crescimento na placa de Petri é inoculado com a bactéria desejada, as placas são incubadas na melhor temperatura para o crescimento da bactéria selecionada (por exemplo, geralmente a 37 graus Celsius para culturas de humanos ou animais ou inferior para culturas ambientais ) Outro método de cultura bacteriana é a cultura líquida, na qual as bactérias desejadas são suspensas em caldo líquido, um meio nutriente. São ideais para a preparação de um ensaio antimicrobiano. O experimentador inocularia caldo líquido com bactérias e deixaria crescer durante a noite (eles podem usar um agitador para crescimento uniforme). Em seguida, eles pegariam alíquotas da amostra para testar a atividade antimicrobiana de uma droga ou proteína específica (peptídeos antimicrobianos). Como alternativa, o microbiologista pode decidir usar culturas líquidas estáticas. Essas culturas não são agitadas e fornecem aos micróbios um gradiente de oxigênio.

Pontos chave

  • Uma cultura pura pode se originar de uma única célula ou organismo, caso em que as células são clones genéticos umas das outras.
  • Culturas microbianas são métodos diagnósticos básicos e fundamentais usados ​​extensivamente como uma ferramenta de pesquisa em biologia molecular.
  • As formas mais comuns de culturas microbianas são líquidas ou sólidas (ágar).

Termos chave

  • ágar: Material gelatinoso obtido a partir de algas marinhas, utilizado como meio de cultura bacteriana, em eletroforese e como aditivo alimentar.

Cocultura de mielinização de neurônios / oligodendrócitos

Os sistemas de cultura de células de mielinização são ferramentas úteis para estudar a biologia da mielina e distúrbios relacionados à mielina. Em comparação com uma série de protocolos estabelecidos para cultura de oligodendrócitos puros dissociados (OL), os métodos para cultura de mielinização são limitados. Recentemente, desenvolvemos um sistema misto de cocultura neurônio-glia que gera mielinização robusta e eficiente. Ao otimizar as condições de cultura de células, células progenitoras neurais dissociadas da medula espinhal de rato embrionário se desenvolvem em neurônios e células gliais, incluindo perfis de linhagem de oligodendrócitos (OL). Dentro de 4 semanas, as células progenitoras OL (OPC) proliferam, diferenciam-se em OLs maduros e axônios mielinizados. A formação da bainha de mielina compacta é confirmada por microscopia eletrônica. Para análise morfológica por microscopia de luz, as células cultivadas em lamelas de vidro são fixadas e imunocoradas para várias proteínas relacionadas à mielina, incluindo aquelas incorporadas na bainha de mielina e aquelas agrupadas no nó de Ranvier. Os axônios mielinizados podem ser quantificados prontamente por contagem manual ou software ImageJ. O sistema de cultura também pode ser usado para análise de microscopia eletrônica, modificando ligeiramente o procedimento de cultura de células.

Palavras-chave: Cultura de células de axônio Embryonic Myelination Oligodendrocyte Spinal med.


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Resultados

Maior produção de hidrogênio pelo consórcio microbiano

Neste estudo, construímos um consórcio microbiano artificial de duas espécies que foi altamente eficiente para a produção de hidrogênio a partir do amido de milho. Conforme mostrado na Fig. 1a, este consórcio microbiano de duas espécies poderia produzir 1698,5 ± 97,1 mL L −1 de hidrogênio, o que era 42,3% e 58,2% maior do que as culturas puras da cepa A1 e da cepa B1, respectivamente. A cultura pura da cepa A1 ou da cepa B1 pode hidrolisar 62,7% e 49,9% do amido total, respectivamente, enquanto o consórcio de co-cultura pode melhorar a eficiência da hidrólise em até 77,4% (Fig. 1b). Uma análise posterior mostrou que o amido foi hidrolisado em glicose dentro de 20 h, mas foi rapidamente utilizado depois (Fig. 1c). A cultura pura da cepa B1 mostrou uma baixa capacidade de hidrólise do amido, com uma produção máxima de glicose de 108,8 ± 15,3 mg L -1, enquanto a cultura pura da cepa A1 poderia produzir 240,9 ± 7,9 mg L -1 de glicose no mesmo tempo. Na co-cultura, descobrimos que a glicose aumentou para 317,1 ± 20,6 mg L -1, um aumento de quase três vezes em comparação com a cultura pura da cepa B1. Embora a cepa A1 exiba uma melhor capacidade de hidrólise de amido do que a cepa B1, o rendimento final de hidrogênio da cultura da cepa A1 pura foi muito menor do que a da cultura da cepa B1 pura (1,19 vs. 1,38 mol H2 por mol de glicose), indicando que a cepa B1 é mais eficiente para a produção de hidrogênio do que a cepa A1. Notavelmente, a co-cultura pode aumentar o rendimento de hidrogênio para 1,61 mol H2 por mol de glicose (Fig. 1d), que pode se beneficiar das interações mútuas desses consórcios microbianos de duas espécies.

O desempenho da produção de hidrogênio a partir do amido entre culturas puras e co-cultura em uma proporção mista de A1: B1 = 1: 1. uma Produção cumulativa de hidrogênio, b consumo total de amido, c reduzindo a produção de glicose, d rendimento de hidrogênio, e e atividades extracelulares de enzimas amilolíticas. Duas bactérias, Bacillus cereus A1 e Brevundimonas naejangsanensis B1, foram usados ​​neste estudo. A produção cumulativa de hidrogênio foi ajustada por um modelo de Gompertz modificado. Barras de erro indicam desvios padrão de pelo menos três experimentos repetidos. Diferenças significativas entre grupos diferentes representam *p & lt 0,05. f Efeitos de diferentes proporções mistas na produção cumulativa de hidrogênio e na taxa de utilização de amido

Em seguida, determinamos a atividade da enzima amilolítica bruta em culturas puras e co-cultura in vitro (Fig. 1e). Antes de 96 h, a atividade amilolítica da cultura pura da cepa B1 permaneceu em um nível baixo de 4,1 ± 0,5 U mL −1, enquanto a cultura pura da cepa A1 mostrou um aumento da atividade amilolítica com a atividade enzimática máxima de 7,5 ± 0,4 U mL - 1, mais de duas vezes maior do que a cultura pura da cepa B1. No entanto, a atividade enzimática da cepa B1 aumentou continuamente para 7,0 ± 0,7 U mL −1 após 144 h, enquanto a da cepa A1 diminuiu para 3,9 ± 0,7 U mL −1. Esses resultados sugerem que a cepa A1 pode desempenhar um papel importante na hidrólise do amido no estágio inicial, enquanto a cepa B1 foi mais importante no estágio posterior. No entanto, durante todo o processo de fermentação, a co-cultura exibiu atividade amilolítica muito maior (9,6-11,6 U mL −1) em comparação com as culturas puras, indicando ainda que a co-cultura dessas duas cepas pode melhorar o processo de hidrólise do amido.

Além disso, testamos os efeitos de diferentes proporções mistas na produção de hidrogênio e na utilização de amido (Fig. 1f). A cepa B1 apresentou menor capacidade de hidrólise do amido do que a cepa A1, mas a co-cultura, na proporção de mistura de 1: 1, aumentou a taxa de utilização do amido em 34,9% e 163,6%, respectivamente, em comparação com a cultura pura da cepa A1 e cepa B1. A co-cultura em diferentes proporções mostrou uma maior taxa de utilização de amido do que as culturas puras, e a maior taxa de utilização de amido foi obtida na proporção A1: B1 de 1: 1 e 2: 1 (v / v), com a maior produção de hidrogênio. de 1698,5 ± 97,1 mL e 1640,8 ± 159,6 mL, respectivamente. No entanto, uma fração inferior da cepa A1 (A1: B1 = 1: 2) diminuiu a taxa de utilização de amido em 20,3% e gerou apenas 644,3 ± 127,2 mL L −1 de hidrogênio, uma redução de 59,0% em comparação com A1: B1 = 1: 1 ou 2: 1. No entanto, uma fração maior da cepa A1 (A1: B1 = 3: 1) não aumentou a extensão da utilização do amido, mas diminuiu ligeiramente a produção de hidrogênio em 11,7% (Fig. 1f).

Análise genômica e identificação metabólica do consórcio microbiano

Para explorar as interações sinérgicas entre as cepas A1 e B1 na co-cultura, as duas cepas foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo. Os mapas do genoma das cepas A1 e B1 são apresentados na Fig. 2a, b. As sequências do genoma das cepas A1 e B1 foram posteriormente submetidas a análise automatizada por Rapid Annotation usando Subsystem Technology 35. Os genes-chave envolvidos na hidrólise do amido e na produção de hidrogênio estão indicados nos mapas do genoma (Tabela Suplementar 1). As vias metabólicas das cepas A1 e B1 foram posteriormente analisadas usando o banco de dados da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto 36. Com base nas informações acima, foram construídas vias metabólicas simplificadas para a produção de hidrogênio a partir do amido pelas cepas A1 e B1 (Fig. 2c).

Mapas do genoma de uma Bacillus cereus A1 e b Brevundimonas naejangsanensis B1. O círculo 1 indica o valor da inclinação do GC (G − C / G + C). O círculo 2 indica a porcentagem de conteúdo GC. A produção de hidrogênio e os genes relacionados à hidrólise do amido estão marcados nos mapas. A cepa A1 possui três genes relacionados à hidrólise do amido (marcados no setor azul), codificando pululanase, neopululanase e α-amilase. A cepa A1 também abriga dois agrupamentos de formiato desidrogenase (marcados no setor verde) e um gene que codifica a piruvato formato-liase (marcado no setor roxo), indicando que o hidrogênio é produzido pela clivagem do formato. A cepa B1 tem um gene relacionado à hidrólise do amido (marcado no setor rosa), que codifica a glucoamilase. Além disso, a cepa B1 tem uma hidrogenase de ligação à membrana (marcada no setor vermelho) e três NAD (P) H-ferredoxina redutases (marcada no setor roxo), sugerindo que o hidrogênio é produzido a partir da ferredoxina reduzida. c Via de metabolismo simplificado para produção de hidrogênio e hidrólise de amido nas cepas A1 e B1. AMY α-amilase, GLU glucoamilase, FDH formato desidrogenase, NFR NAD (P) H-Ferredoxina redutase, MBH hidrogenase ligada à membrana. O amido de milho no presente estudo consiste em aproximadamente 27% de amilose e 63% de amilopectina

O genoma da cepa A1 possui dois genes que codificam pululanase (DA68_09615) e neopululanase (DA68_16145) para hidrólise de amido. A pululanase hidrolisa especificamente as ligações α-1,6 37, enquanto a neopululanase atua nas ligações α-1,4 38 (Fig. 2a). No entanto, esses dois genes foram considerados inativos em cultura pura e co-cultura, conforme verificado pela reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (PCR) (Fig. Suplementar 1) e PCR de transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR Ct valor & gt 40). O genoma da cepa A1 também contém uma α-amilase (DA68_13065, codificada por amyA) (Fig. 2a), que hidrolisa as ligações α-1,4 e quebra o amido insolúvel grande para formar amido solúvel para subsequentemente produzir oligossacarídeos α-1,4 ou α-1,6 menores. No entanto, apenas α-1,4 oligossacarídeos podem ser posteriormente hidrolisados ​​pela α-amilase para produzir maltose e, finalmente, glicose 39 (Fig. 2c). Comparativamente, a cepa B1 possui apenas uma glucoamilase (DA69_13810) que cliva unidades de glicose da extremidade não redutora da amilase e amilopectina hidrolisando as ligações α-1,4 e α-1,6 a uma taxa baixa 10,40 (Fig. 2b , c). Assim, as funções complementares das duas enzimas podem explicar por que a co-cultura mostrou maior taxa de utilização de amido (Fig. 1b) e atividade da enzima amilolítica (Fig. 1e).

Para a produção de hidrogênio, o genoma da cepa A1 tem um cassete que codifica piruvato formato-liase (DA68_25815–25820) e dois cassetes que codificam formato desidrogenase (DA68_13965–13990 e DA68_26295–26305) (Fig. 2a e Tabela Suplementar 1). A informação genética para a cepa A1 indica que o hidrogênio é produzido pela clivagem do formato 41 (Fig. 2c). Em comparação, o genoma da cepa B1 possui uma hidrogenase ligada à membrana (DA69_04835), uma NADPH-ferredoxina redutase (DA69_08100) e duas NADH-ferredoxina redutases (DA69_04910 e DA69_10290) (Fig. 2b). Essas observações sugerem que os elétrons são transferidos para a hidrogenase via ferredoxina reduzida na cepa B1, conduzindo assim a produção de hidrogênio 42 (Fig. 2c).

Mutualismo baseado em metabólitos do consórcio microbiano

As interações metabólicas envolvendo a troca de metabólitos benéficos e nutrientes pelas bactérias são importantes para determinar o comportamento da população no consórcio microbiano 43,44. Descobrimos que a cultura pura da cepa A1 poderia converter amido em 1,08 g L -1 de lactato em 96 h, enquanto o lactato em co-cultura mantido em nível muito baixo (0,17-0,39 g L -1, Fig. 3a), sugerindo que a cepa B1 pode utilizar lactato como fonte de carbono. Para confirmar ainda mais nossa hipótese, alimentamos a cepa B1 com lactato de sódio em vez de amido. Como esperado, a cultura pura da cepa B1 poderia consumir rapidamente 0,75 g L -1 de lactato em 144 h, sugerindo que a cepa B1 também pode receber lactato como fonte de carbono (Fig. 3a).

Mutualismo baseado em metabólitos no consórcio de co-cultura. uma B. cereus A1 pode converter amido em lactato, e B. naejangsanensis B1 poderia usar lactato como fonte de carbono. Asterisco (*) indica que as cepas A1 e B1 não podem ser cultivadas com fonte de nitrogênio inorgânico, e peptona foi adicionada para manter o crescimento celular essencial. b Formate variações em cultura pura e co-cultura. B. naejangsanensis B1 poderia produzir formato para B. cereus A1 como lançadeira de elétrons para a produção de hidrogênio. c Adição de formato a B. cereus A1 aumentou o rendimento de hidrogênio. d B. naejangsanensis B1 poderia produzir anaerobicamente 0,23 g L -1 de formato usando 2 g L -1 de peptona como única fonte de carbono e nitrogênio. e Síntese de formatos a partir de aminoácidos via metabolismo de um carbono mediado por folato em Brevundimonas naejangsanensis B1. THF tetrahidrofolato, MTR 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína metiltransferase, MTHFD metilenotetrahidrofolato desidrogenase, SHMT serina hidroximetiltransferase, sistema de clivagem GCS glicina, TDO triptofanina 2,3-dioxidasigenase, KFA kynurenase. As barras indicam a média ± S.E.M dos resultados de três repetições paralelas. A diferença significativa do grupo de controle é indicada por *p & lt 0,05 ***p & lt 0,001

Além do lactato, descobrimos que a concentração de formato na cultura pura da cepa A1 era baixa (& lt3,6 mM) durante toda a duração da fermentação (Fig. 3b) porque a cepa A1 pode converter formato em hidrogênio via formato desidrogenase (Fig. . 2a). Curiosamente, a cultura pura da cepa B1 pode acumular 0,56 g L-1 (12,2 mM) de formato, que é provavelmente um portador de elétrons para a cepa A1 para a produção de hidrogênio em co-cultura. Conforme mostrado na Fig. 3b, o formiato foi acumulado até 0,48 g L -1 em 96 h em co-cultura, mas foi rapidamente consumido depois. Esta grande diminuição da concentração de formato na co-cultura após 96 h também sugere que a cepa A1 assimila o formato para a produção de hidrogênio (Fig. 3b). Além disso, também testamos se a produção de hidrogênio poderia ser aumentada com o suplemento exógeno de formato em cultura pura da cepa A1. Como mostrado na Fig. 3c, o rendimento de hidrogênio da cepa A1 foi de fato aumentado em 37,9% e 18,3% com a adição de formato de 10 e 15 mM, respectivamente. Tomados em conjunto, sugerimos que a cepa B1 poderia produzir formato como um lançador de elétrons para a cepa A1 e, portanto, aumentar a eficiência geral de produção de hidrogênio. Além disso, observamos que a co-cultura e as culturas puras mostraram alterações de pH muito semelhantes (Fig. 2 suplementar). Os valores de pH de todas as três culturas caíram quase linearmente nas primeiras 24 horas devido à formação de ácidos graxos voláteis (AGV) e então diminuíram gradualmente para um pH final de 3,3–3,4. A co-cultura e as culturas puras produziram quase a mesma concentração de acetato (Fig. Suplementar 2), mas a co-cultura poderia gerar mais butirato do que as culturas puras sem perturbar a estabilidade do valor de pH, provavelmente devido ao consumo de formato e lactato através do supracitado mutualismo interações.

Deve-se notar que a cepa B1 não carrega nenhum gene de piruvato formato-liase, o que implica que o formato não pode ser gerado a partir do piruvato. Outros experimentos descobriram que, sem o fornecimento de amido, a cultura pura da cepa B1 foi capaz de produzir 0,23 g L-1 formato usando 2 g L-1 peptona como a única fonte de carbono e nitrogênio (Fig. 3d), indicando que o formato pode ser produzida pelo catabolismo de alguns aminoácidos. A Figura 3e mostra as possíveis vias de síntese de formato de aminoácidos da cepa B1, e os loci de genes relacionados são indicados na Tabela Suplementar 2. O metabolismo de um carbono é um processo metabólico universal envolvido em reações de metilação e metabolismo de alguns aminoácidos 45. O formato é um dos principais metabólitos produzidos a partir do 10-formil-tetra-hidrofolato (10-formil-THF) pela 10-formil-THF sintetase (DA69_06290) 46. Existem vários metabolismos de aminoácidos envolvidos neste ciclo. A serina e a glicina são as principais fontes de grupos de um carbono. Esses dois aminoácidos podem se interconverter um ao outro via serina hidroximetiltransferase 47 (DA69_03360 e DA69_05470), junto com THF e 5,10-metileno-THF. A glicina também pode ser irreversivelmente clivada em CO2 e NH4 + pelo sistema de clivagem da glicina, acoplado à conversão de THF em 5,10-metileno-THF 48. Além disso, a remetilação de homocisteína a metionina também está envolvida na formação de THF e no metabolismo de um carbono 49. Além de ser um produto do metabolismo de um carbono, a cepa B1 também pode produzir formato por catabolismo de triptofano 50, onde o formato é removido de N-formilquinurenina por quinurenina formamidase (DA69_08900).

A co-cultura redireciona o fluxo metabólico geral para a produção de hidrogênio

Para revelar ainda mais os efeitos sinérgicos das duas cepas em co-cultura, os fluxos metabólicos de culturas puras e co-cultura foram calculados com base na determinação das principais concentrações de metabólitos (Fig. 4a). Além do hidrogênio, os principais metabólitos da cepa B1 foram acetato e butirato, enquanto a cepa A1 também foi capaz de produzir lactato.Na cultura pura de A1, 36,8% do amido permaneceu não hidrolisado devido à limitação de a α-amilase poder apenas hidrolisar as ligações α-1,4 do amido (Fig. 2c). Enquanto isso, 12,4% do amido foi utilizado para o acúmulo de biomassa e síntese de outros metabólitos, e 10,3% do amido foi metabolizado em lactato. Essas vias, no entanto, também distribuíram uma grande proporção do fluxo de carbono, reduzindo assim o rendimento de hidrogênio. O amido residual foi direcionado para acetil-CoA, acoplado à geração de hidrogênio (1,19 mol H2 por mol de glicose), e então acetil-CoA foi usado para produzir acetato (7,5%) e butirato (33,1%). Em contraste, como a glucoamilase só pode hidrolisar o amido em unidades de glicose passo a passo a uma taxa baixa, 50,0% do amido ainda não foi hidrolisado no final da fermentação usando a cultura pura da cepa B1. Notavelmente, a cepa B1 mostrou excelentes propriedades de produção de hidrogênio em comparação com a cepa A1 (1,38 vs. 1,19 mol H2 por mol de glicose), porque nenhum lactato foi produzido e apenas 5,2% de amido foi usado para a síntese de biomassa. Portanto, mais fluxo de carbono foi canalizado para acetil-CoA, resultando em um maior rendimento de hidrogênio. Na co-cultura, a utilização do amido foi aumentada para 77,2% devido aos efeitos sinérgicos das duas cepas. Apenas 1,5% do fluxo foi direcionado ao lactato na co-cultura, apesar do fato de que mais amido foi hidrolisado e usado, o que provou ainda que a cepa B1 poderia usar o lactato como fonte de carbono e doador de elétrons, redirecionando assim o fluxo para hidrogênio produção (1,61 mol H2 por mol de glicose).

Comparação de fluxo metabólico, população de células e perfis de transcrição de genes em culturas puras e co-cultura. uma Análise da distribuição do fluxo metabólico das cepas A1 e B1 em culturas puras e co-cultura para produção de hidrogênio. Os fluxos de três culturas foram normalizados para tornar o amido total igual a 100%. O asterisco (*) indica que a produção de hidrogênio não envolve nenhum fluxo de carbono. b Variações de número de células e c mudanças na composição de cada cepa em culturas puras e co-cultura por gyrAcom base na reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). As eficiências de amplificação E para todos os ensaios qPCR estavam na faixa de 95–97%. Os coeficientes de regressão mostraram uma forte correlação linear (R 2 & gt 0,991) entre o Ct valores e o número de células. Mudanças no nível de transcrição de genes que estavam envolvidos em d utilização de amido e e produção de hidrogênio em culturas puras e co-cultura em momentos diferentes. amyA gene que codifica α-amilase (DA68_13065), gluA gene que codifica glucoamilase (DA69_13810), fdhD gene que codifica a formato desidrogenase (DA68_26295), hid1 gene que codifica a hidrogenase (DA69_04835). Os níveis de expressão relativa foram medidos por análise de transcrição reversa-qPCR. Todos os dados foram normalizados para o serviço de limpeza expresso constante gyrA gene em vez do gene 16S rRNA para eliminar as interferências de similaridade 16S rRNA entre as duas cepas em amostras de co-cultura. Diferença significativa entre a cultura pura e a co-cultura representam *p & lt 0,05 ***p & lt 0,001. As barras indicam a média ± S.E.M dos resultados de seis repetições paralelas

A co-cultura aumenta o crescimento celular de ambas as cepas

A composição bacteriana desempenha papéis importantes nas funções de consórcio 44,51. Neste estudo, um gene da subunidade A da girase do DNA altamente específico da espécie (gyrAO método de PCR quantitativo baseado em) (qPCR) foi usado neste estudo para quantificar as mudanças na composição bacteriana nos sistemas puro e de co-cultura (Fig. 4b, c). Ambas as cepas A1 e B1 continuaram a crescer até 96 h, atingindo um número máximo de células de 9,45 × 10 9 e 7,65 × 10 9 mL −1, respectivamente. Posteriormente, o número de células das cepas A1 e B1 foram mantidos quase constantes, com apenas uma ligeira diminuição. O número de células das espécies individuais foi maior na co-cultura do que nas culturas puras sozinhas (Fig. 4b). Este aumento no número de células pode ser atribuído principalmente ao fato de que a cooperação entre as duas cepas aumentou a hidrólise do amido, fornecendo assim mais carbono para o crescimento da cepa. Como resultado, o número final de células da cepa A1 aumentou 82,2%. Vale ressaltar que o crescimento da cepa B1 foi acelerado durante todo o processo de fermentação, e o número final de células aumentou 284,4%. Isso pode ser porque a cepa A1 também produziu lactato como uma fonte adicional de carbono para a cepa B1 (Fig. 3a).

A Figura 4c mostra ainda as mudanças de composição das duas cepas na co-cultura. Embora as duas cepas tenham sido inoculadas na proporção de 1: 1 (v / v), os números reais de células eram bastante diferentes por causa das diferentes taxas de crescimento na semente. A cepa A1 cresce muito mais rápido do que a cepa B1, a cepa A1 dominada no início da fermentação, sendo responsável por & gt90% do número total de células. Esta alta proporção da cepa A1 durante o estágio inicial pode converter rapidamente o amido em lactato (Fig. 3a), apoiando assim o crescimento da cepa B1. Como resultado, a proporção da cepa B1 aumentou rapidamente para 36,8% em 48 h, e continuou a aumentar para 62,8% -65,4% com o aumento no tempo de fermentação. O aumento na população da cepa B1, por sua vez, poderia digerir rapidamente as proteínas e produzir formiato para a cepa A1.

A co-cultura regula positivamente os genes-chave da hidrólise do amido e produção de hidrogênio

Antes do experimento RT-qPCR, um gene de manutenção constantemente expresso, gyrA, foi usado para eliminar a interferência causada pela similaridade de sequência do gene 16S rRNA. Os resultados mostraram que o gyrA gene foi mais específico do que o gene 16S rRNA (Suplementar Fig. 3). A análise de RT-qPCR mostrou que os genes relacionados à hidrólise do amido e à produção de hidrogênio, presentes nas cepas A1 e B1, pareciam ser regulados positivamente de forma diferente na co-cultura (Fig. 4d, e). Para utilização de amido, o nível de transcrição do amyA gene (que codifica α-amilase) foi aumentado em 2,5 vezes na co-cultura, em comparação com a cultura pura da cepa A1, antes de 96 h, indicando que a cepa A1 desempenha um papel importante na hidrólise do amido em um estágio inicial. No entanto, este nível na co-cultura reduziu para o mesmo grau que o observado no caso da cultura pura da cepa A1, até que o formato foi usado em 192 h (Fig. 4d). O nível de transcrição do gene que codifica a glucoamilase gluA na co-cultura não mostrou nenhum aumento óbvio durante as fases iniciais. Em um estágio posterior, no entanto, a expressão desse gene foi aumentada em 4,7 vezes na co-cultura, em comparação com a cultura pura da cepa B1.

Algumas bactérias são conhecidas por carregar vários genes que codificam a formato desidrogenase. Por exemplo, o E. coli genoma codifica três desidrogenases de formato, mas apenas o hycE gene (também conhecido como hid3) é responsável pela produção de hidrogênio 41,52. Da mesma forma, porque a cepa A1 abriga dois cassetes de formato desidrogenase, ambos os fdhD genes (DA68_13975 e DA68_26295) foram testados por RT-qPCR. Verificou-se que o nível transcricional de fdhD1 (DA68_13975) foi baixo e não mostrou nenhuma mudança significativa na cultura pura e co-cultura durante toda a fermentação, enquanto fdhD2 (DA68_26295) foi altamente expresso em 1,7 vezes, em comparação com o observado para a cultura pura de A1 em 96 h. No entanto, este nível de expressão diminuiu no mesmo grau depois que o formato foi usado em 192 h (Fig. 4e). Em contraste, a transcrição de hyd1 na co-cultura foi aumentada em 11,9 e 7,5 vezes em 96 e 192 h, respectivamente, indicando que a produção de hidrogênio da cepa B1 foi aumentada na co-cultura.


4 Principais características de crescimento de uma cultura pura de bactérias

Este artigo lança luz sobre as quatro principais características de crescimento de uma cultura pura de bactérias. As características de crescimento são: 1. Colônias em Agar Media 2. Crescimento em Agar Inclinado 3. Crescimento em Gelatina ou Agar Stabs 4. Crescimento em caldo.

Cultura pura: característica nº 1. Colônias em meio de ágar:

A cultura bacteriana é misturada com gelatina ou ágar previamente fundido por calor e parcialmente resfriado. A mistura é então deixada esfriar, colocada em petridish e incubada para o desenvolvimento das colônias.

As seguintes características das colônias são geralmente observadas:

Normalmente as colônias são circulares, mas outras formas como rizóide, irregular etc. também podem ser observadas.

As colônias apresentam uma grande variação em seu tamanho. Eles podem ser muito pequenos e restritos a grandes espalhamento ocupando toda a superfície do petridish.

As colônias podem ser planas e finas ou espessas com convexas, pulvinadas ou outros tipos de superfície.

A superfície das colônias pode ser lisa ou enrugada. Eles também podem exibir elevação semelhante a um ponto.

Normalmente, a superfície das colônias é brilhante. No entanto, colônias com superfície opaca também podem ser encontradas.

A maioria das colônias é macia e viscosa, mas algumas são secas e quebradiças, enquanto poucas são viscosas.

Geralmente as colônias de bactérias são brancas acinzentadas. Vários tons de amarelo e branco puro são comumente observados.

Outras colônias com as cores vermelha, laranja, azul, verde, etc. também ocorrem.

Cultura pura: Característica # 2. Crescimento em Agar Inclinado:

As culturas inclinadas de ágar são preparadas riscando a superfície inclinada do meio em um tubo com um golpe de uma agulha de inoculação.

Cultura pura: Característica # 3. Crescimento em Gelatina ou Agar Stabs:

A agulha de inoculação contendo o inóculo é perfurada em linha reta de cima para baixo do tubo e retirada ao longo do mesmo caminho.

Cultura pura: Característica # 4. Crescimento em caldo:

Os tubos contendo caldo nutriente são inoculados com o auxílio da agulha ou alça de transferência.


1 resposta 1

A resposta é que ele permite que você verifique a viabilidade do estoque principalmente e, portanto, também tenha uma população que você sabe que está crescendo. Culturas a granel de líquido sempre conterão uma proporção de organismos não viáveis, pois não há maneiras fáceis de separá-los dos viáveis.

Também permite que você verifique se a preparação não foi acidentalmente contaminada (ou os tubos trocados, etc.) por outro formador de colônia morfologicamente diferente - ter o tipo certo de organismo é muito importante experimentalmente. Se você deseja verificar a morfologia do organismo por meio de testes morfológicos (ou seja, microscópio + manchas) ou bioquímicos, ambos precisam começar com uma cultura pura. É difícil obter bactérias suficientes para a maioria desses testes, a menos que você as selecione nas colônias - a cultura líquida simplesmente não é concentrada o suficiente e pode ser heterogênea se um inóculo misto for adicionado (acidentalmente ou não).

Outra razão é que há alguma heterogeneidade na cultura de qualquer maneira, não importa o que você faça para caracterizá-la após o crescimento. O isolamento de colônias únicas, que devem ser derivadas de unidades formadoras de colônias únicas, permite algum controle sobre essa população para sua preparação a granel, seja o crescimento sob certas condições (por exemplo, resistência a antibióticos) ou a taxa de crescimento.

Por exemplo, pode permitir que você selecione uma grande colônia, o que pode indicar uma taxa de crescimento ligeiramente mais alta para aquele fundador. Se você tem algo que é cultivado em meio seletivo, então pode ser que uma parte de uma cultura em massa tenha perdido a característica de crescimento neste meio, o que significa que quando você inocula a partir da massa, o que você coloca pode não ser o que você esperava. Isso pode levar a desvios nos cálculos do tempo de geração esperado e medidas fisiológicas ou fenotípicas semelhantes.


Métodos

Pesquisa humana

Uma pesquisa foi conduzida entre os trabalhadores da loja de pesticidas, aplicadores de pesticidas e proprietários de terras em Vadapalanji Panchayat Union, distrito de Madurai, Tamil Nadu, Índia (latitude 9.9272, longitude 78.0092 Arquivo adicional 1: Figura S1). Detalhes sobre nome, frequência e volume de inseticidas comumente usados ​​foram coletados. Os fungicidas, herbicidas, bactericidas e suplementos minerais não foram considerados. Em um estudo subsequente, as pessoas (n = 3.080) das aldeias na União Vadapalanji Panchayat que incorpora Vadapalanji, Manapatti, Thenpalanji, Sundarajapuram, Nagamalai puthur e Palkalainagar, Vellaparaipatti e Meenatchipatti nas aldeias do distrito de Madurai, Tamil Nadu, na Índia, foram pesquisadas em seus distritos de Tamil Nadu, Índia status diabético e histórico de exposição a POs usando um questionário (arquivo adicional 3). Participantes com idade inferior a 35 anos e gestantes foram excluídos do estudo. Além disso, sexo, idade e história familiar de diabetes também foram coletados. O estado diabético dos participantes foi autorrelatado respondendo “Sim” ou “Não”. Os participantes envolvidos na pulverização, mistura e trabalhadores de campo do OP na agricultura baseada no OP foram definidos como tendo exposição direta aos OPs e aqueles que não estavam associados a trabalhos agrícolas baseados no OP foram definidos como tendo exposição indireta aos OPs.

Coleta de sangue humano

Amostras de sangue de 5 mL foram coletadas em tubos revestidos com EDTA de um subconjunto aleatório da população (n = 802) envolvida em uma pesquisa anterior. Os detalhes de idade, sexo, altura, peso, ocupação, hábitos alimentares, tabagismo, consumo de álcool e tabaco, história de exposição a pesticidas, prevalência de diabetes ou qualquer outra doença e história familiar de diabetes foram coletados por meio de um questionário padrão (Arquivo adicional 5 ) A obesidade foi definida como índice de massa corporal (IMC) & gt 30 kg / m 2. O protocolo de coleta foi aprovado pela pesquisa interna e conselho de revisão, autorização ética, biossegurança e comitê de bem-estar animal da Universidade Madurai Kamaraj. O pessoal do laboratório que realiza análises de parâmetros sanguíneos foi cego e recebeu apenas a identificação da amostra e nenhum detalhe do participante.

HbA1c análise

O estado diabético foi confirmado por HbA1c análise em sangue total por HPLC (D10, Biorad Inc., EUA). Diabetes foi definido como tendo uma história de diabetes em uso de medicamentos ou hemoglobina glicada (HbA1c) de ≥ 6,5% com base nas recomendações do International Expert Committee (IEC).

Ensaio de acetilcolina esterase

O ensaio de AChE foi realizado em plasma / soro sanguíneo usando o kit Amplex Red acetilcolinesterase (Invitrogen Inc., EUA A12217) de acordo com as instruções do fabricante. Neste ensaio, a atividade da AChE é monitorada indiretamente usando 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (Amplex Red), uma sonda fluorogênica sensível para peróxido de hidrogênio. Primeiro, a AChE converte o substrato de acetilcolina em colina, que é oxidada pela colina oxidase em betaína e H2O2. Este último, na presença de peroxidase de rábano, reage com Amplex Red em uma estequiometria 1: 1 e gera um produto altamente fluorescente, a resorufina [37]. A fluorescência foi medida usando excitação na faixa de 545 nm e emissão em 590 nm. As reações foram realizadas com triplicados técnicos. Os valores de referência são 3334–7031 mU / L para homens e 2504–6297 mU / L para mulheres.

Análise de resíduos de OP por GC / MS

As amostras de plasma sanguíneo foram extraídas por uma técnica de microextração líquido-líquido dispersiva [38] por um método modificado. Resumidamente, 200 μL de amostra de plasma foram enriquecidos com 1 mg / mL de azobenzeno como padrão interno seguido pela adição de 20 μL de HCl 5 N e completado até 1 mL com água desionizada. Posteriormente, a amostra é incubada a 70 ° C por 30 min para evitar a interação de OPs com proteínas. Depois de resfriar até a temperatura ambiente, 150 μL de mistura de acetonitrila (solvente dispersivo) e 50 μL de clorofórmio (solvente de extração) foram adicionados à amostra usando seringa e sonicada por 3 min, seguida por centrifugação a 10.000 rpm por 5 min. A fase orgânica no fundo do tubo é cuidadosamente coletada e seca sob um fluxo suave de gás nitrogênio e dissolvida em 20 μL de hexano. A preparação e análise das amostras foram feitas de forma cega.

Soluções estoque primárias de cada inseticida (1 mg / mL) foram preparadas em metanol. As soluções padrão de trabalho dos compostos foram preparadas combinando as alíquotas de cada solução primária e diluindo com hexano. As soluções estoque foram armazenadas a -20 ° C no escuro quando não estavam em uso. Os padrões foram executados em diferentes concentrações e a área do pico foi observada e, subsequentemente, a linearidade foi estabelecida. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram determinados por métodos padrão. A eficiência de recuperação para cada inseticida individual foi determinada pelo aumento de concentrações conhecidas de inseticida e medição por GC / MS (Clarus 680 / 600C Perkin Elmer Inc., EUA).

A temperatura do injetor GC foi fixada em 200 ° C. O programa de temperatura do forno foi otimizado para manter a 120 ° C por 1 min e então aumentar em 10 ° C min -1 até 220 ° C [39]. O gás hélio foi usado como gás portador. A temperatura da linha de transferência foi ajustada para 280 ° C. As condições de espectrometria de massa foram as seguintes: fonte de ionização de elétrons ajustada para 70 eV, corrente de emissão 500 la, MS Quad 150 C, MS Fonte 200 ° C. O espectrômetro de massa foi executado no modo de varredura completa e no modo de monitoramento de íon único. Os fragmentos m / z monitorados para cada inseticida são fornecidos no arquivo adicional 1: Figura S2C.

Manutenção e criação de animais

Ratos de BALB / c cepa (RRID: IMSR_HAR: 1255) foram obtidas na Madras University, Chennai e mantidas e criadas em um biotério a 25–28 ° C com 12 h dia / noite ciclos. Os animais foram alimentados com água desionizada e ração padrão para ratos (Hindustan Lever Limited, India) ab libitum. Todos os experimentos neste estudo foram realizados com camundongos fêmeas com oito semanas de idade, pesando 20–28 ge mantidos em um ambiente constante a 25–28 ° C com umidade de 45–60%. O estado de saúde dos ratos foi confirmado pelo monitoramento contínuo de suas atividades, comportamento, peso corporal e fezes. Os protocolos com animais usados ​​neste estudo foram aprovados pela pesquisa interna e conselho de revisão, liberação ética, biossegurança e comitê de bem-estar animal da Universidade Madurai Kamaraj.

Administração de monocrotofos em animais

Os camundongos receberam MCP (Sigma-Aldrich Inc., EUA 361173) na dose de 10 × TMDI [6] (28 μg / kg de peso corporal / dia) diretamente na água potável por 180 dias. A ingestão de alimentos e líquidos e a atividade dos animais foram monitoradas diariamente. O peso corporal dos animais foi documentado a cada 30 dias.

Medição de glicose no sangue em jejum

Os animais foram deixados em jejum durante a noite antes da medição da glicose no sangue.A glicose em jejum foi medida usando um glicosensor baseado em biossensor [40] (Johnson & amp Johnson Inc., EUA OneTouch) com uma gota de sangue da veia da cauda e expressa em mg / dL.

Teste de tolerância oral à glicose

OGTT foi realizado para analisar a rapidez com que a glicose é eliminada do sangue [41]. Os animais jejuaram durante a noite antes da execução do OGTT, o sangue foi coletado pela veia da cauda e a glicose foi medida usando o glicosímetro (0 min). Posteriormente, os animais foram administrados por gavagem com solução glicosada (1,5 g / kg de peso corporal) e a glicemia foi monitorada aos 15, 30, 60, 90 e 120 min. Os dados foram plotados na curva de glicose no sangue versus tempo e a resposta glicêmica foi expressa como área sob a curva (AUC, × 10 3).

Colheita de órgãos

Os animais foram anestesiados por injeção subcutânea de cetamina (100 mg / kg de peso corporal). O sangue foi coletado por punção cardíaca e os órgãos, incluindo cérebro, coração, fígado, rins e intestino grosso foram colhidos e perfundidos em PBS estéril (10 × g / l: 25,6 Na2HPO4, 80 NaCl, 2,0 KCl, 2,0 KH2PO4. pH 7,2) e armazenado a -80 ° C.

Insulina sérica

O nível de insulina no soro foi determinado pelo kit baseado em ensaio imunoenzimométrico (Monobind Inc., EUA 5825–300) de acordo com as instruções do fabricante.

Preparação de homogenato de tecido

Um total de 100 mg do tecido foi homogeneizado em 1 mL de tampão RIPA (Sigma-Aldrich Inc., EUA R0278), suplementado com 100 μL de inibidores de protease de coquetel (Sigma-Aldrich Inc., EUA P8340) e incubado em gelo por 20 minutos. O homogenato foi centrifugado a 12.000 rpm por 20 min a 4 ° C e o sobrenadante foi coletado, aliquotado e armazenado a -80 ° C.

Estimativa de proteína

A quantidade de proteína no homogenato de soro / tecido foi estimada pelo ensaio de Bradford [42] (Sigma-Aldrich Inc., EUA B6926) de acordo com as instruções do fabricante. A albumina sérica bovina foi utilizada como padrão e as reações foram realizadas em triplicatas técnicas.

Ensaio de carbonilação de proteínas

Os carbonilos produzidos pela oxidação de proteínas medidos espectrofotometricamente pelo método da dinitrofenil hidrazina (DNPH) [43]. Resumidamente, 100 μL do homogenato de soro / tecido foram misturados com 400 μL de DNPH 10 mM dissolvido em HCl 2,5 M e incubados por 60 min e a proteína foi precipitada com um volume igual de ácido tricloroacético (TCA) (10%). O sedimento resultante foi lavado com mistura 1: 1 de etanol: acetato de etila e ressuspenso em 250 μL de 6 M de guanidina HCl. As hidrozonas proteicas foram medidas espectrofotometricamente a 370 nm. A absorbância corrigida (CA) para cada amostra foi calculada pela diferença entre o controle correspondente. A concentração de carbonilos de proteína (nM) foi determinada como se segue: ((CA) / 0,011) (250/100)). As reações foram realizadas com triplicados técnicos.

Ensaio de peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi determinada estimando malondialdeído (MDA) [44] com pequenas modificações. Resumidamente, 100 μL de homogenato de tecido foram adicionados com 200 μL de TCA a 10% resfriado em gelo para precipitar a proteína e mantidos em gelo por 15 min. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 2200 rpm por 15 min a 4 ° C. Um total de 200 μL de sobrenadante foi adicionado com igual volume de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67% e então incubado em banho-maria por 10 min. 1,1,3,3'-tetrametoxipropano foi usado como o padrão. A cor desenvolvida foi lida a 532 nm e a quantidade de MDA foi expressa em nM / mg de proteína. As reações foram realizadas com triplicados técnicos.

Ensaio de antioxidante total

O ensaio de antioxidante total no soro foi executado usando o kit de antioxidante total (Sigma-Aldrich Inc., EUA CS0790) de acordo com as instruções do fabricante. O princípio deste ensaio é a formação de um radical ferril mioglobina a partir da metamioglobina e peróxido de hidrogênio, que oxida o ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) para produzir um cátion radical, ABTS • +, um cromógeno verde solúvel que pode ser determinado espectrofotometricamente a 405 nm [45]. Trolox, um análogo da vitamina E solúvel em água, serve como padrão. As reações foram realizadas com triplicados técnicos. A concentração de antioxidante foi expressa em mM relativo à concentração do padrão Trolox.

Histopatologia

O tecido hepático perfundido foi fixado com formaldeído a 10% e parafina embebida por métodos padrão. Os tecidos incorporados foram fatiados em seções finas de 5 μm usando micrótomo rotatório. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina e montados em lâminas. Finalmente, a morfologia do tecido foi examinada por microscopia de luz, registrada e analisada por um patologista clínico qualificado de forma cega.

Transplante fecal

Após 180 dias de experimento, 200 mg do material fecal dos animais que beberam água pura ou água misturada com MCP foram coletados e suspensos em 5 mL de PBS, misturados e incubados por 5 min em temperatura ambiente para separação por gravidade, e a fase superior foi coletados. Os camundongos foram selecionados aleatoriamente para o estudo e tiveram jejum de 4 horas antes do transplante fecal. Os camundongos foram administrados por gavagem com 200 μL de suspensão por dia durante sete dias consecutivos [27]. Os camundongos administrados por sonda com suspensão fecal foram mantidos em câmaras de vidro adjacentes separadas para evitar contaminação cruzada. Condições semelhantes de temperatura, umidade, água e ração foram mantidas entre o grupo controle e o grupo transplantado fecal. No final da semana, um OGTT foi conduzido conforme descrito acima. Vinte e quatro horas após OGTT, os camundongos foram sacrificados e o intestino e o fígado foram coletados para outros ensaios.

Cultura ex vivo e alimentação

Um total de 200 mg de conteúdo fecal de camundongos selecionados aleatoriamente em gaiolas diferentes foi coletado e suspenso em 5 mL de PBS estéril e agitado em vórtice. A mistura foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 5 min para separação por gravidade e o sobrenadante foi recolhido. Um mililitro do sobrenadante foi inoculado em 9 mL de meio de carne cozida Robertson (composição g / L: sólidos de coração de bovino 98 proteose peptona 20 dextrose 2 cloreto de sódio 5. pH 7,2) suplementado com diferentes OPs (MCP, CHL, MAL e M .PAR) (Sigma-Aldrich Inc., USA 36173, 45395, 36143, 36187) na concentração de 0,2 mg / mL e incubado em condição anaeróbia a 37 ° C por nove dias [22, 27]. Para manter o crescimento logarítmico, a cultura foi subcultivada a cada três dias. Após nove dias de crescimento, parte da cultura foi centrifugada a 3000 rpm por 5 min e o sobrenadante foi coletado enquanto o sedimento remanescente foi dissolvido no mesmo volume de PBS. Conforme mencionado acima no protocolo de transplante fecal, os camundongos foram administrados com 200 μL de cultura inteira / células suspensas / sobrenadante continuamente por sete dias e, finalmente, OGTT foi realizado. Conforme descrito acima, os camundongos alimentados com culturas foram mantidos em câmaras de vidro adjacentes separadas com o mesmo ambiente de temperatura, umidade, água e ração. Vinte e quatro horas após OGTT, os camundongos foram sacrificados e o intestino e o fígado foram coletados para outros ensaios.

Isolamento de RNA metagenômico

O RNA total foi extraído do tecido ceacal junto com seu conteúdo usando o reagente TRI (Sigma-Aldrich Inc., EUA T9424) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade foi verificada no gel de agarose e a qualidade e a quantidade foram determinadas espectrofotometricamente.

Enriquecimento de RNA bacteriano

O RNA bacteriano foi enriquecido a partir do RNA total usando o kit MICROBEnrich (Ambion Inc., EUA AM1901) de acordo com o protocolo do fabricante. Aqui, a tecnologia de captura de hibridização foi usada para remover RNA humano, de camundongo e de rato (tanto mRNA quanto rRNA) de populações de RNA de bactérias hospedeiras complexas, deixando para trás RNA microbiano total enriquecido. Na primeira etapa do procedimento, o RNA total da bactéria hospedeira é incubado com uma mistura de oligonucleotídeos de captura que se ligam aos rRNAs 18S e 28S de mamíferos e aos RNAs poliadenilados. Em seguida, os híbridos de rRNA / oligo nucleotídeo e todos os mRNAs poliadenilados são removidos da mistura com esferas magnéticas derivadas de oligonucleotídeo. Para garantir a remoção completa de mRNAs eucarióticos, DNA complementar foi construído com oligo-d (T) primers e a reação em cadeia da polimerase para o gene GAPDH de camundongo foi executada e verificada.

Enriquecimento de mRNA bacteriano

O mRNA bacteriano foi enriquecido no RNA purificado removendo os rRNAs 16S e 23S usando um kit MICROBExpress (Ambion Inc., EUA AM1905) de acordo com as instruções do fabricante. O método emprega uma modificação nos protocolos de hibridização de captura em sanduíche que foram desenvolvidos para a captura e detecção de moléculas de ácido nucleico específicas com sondas conjugadas a esferas magnéticas. O RNA ligado foi separado usando campo magnético e o RNA não ligado foi dissolvido em água livre de RNase. O enriquecimento de mRNAs bacterianos e a remoção de rRNAs foram confirmados por análise de bioanalyzer (Agilent Inc., EUA).

Sequenciamento e análise de RNA

A biblioteca de RNA foi construída usando o kit TruSeq (Illumina Inc., EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA-seq foi feito no Center for Cellular & amp Molecular Platforms (Governo da Índia), Bangalore com leituras emparelhadas na máquina Illumina HiSeq 1000. O sequenciamento foi realizado de forma cega. Os dados brutos foram processados ​​no software Solexa. As leituras de baixa qualidade foram filtradas de acordo com o valor de qualidade base. As leituras foram mapeadas com genoma de camundongo, mRNAs murinos, RNAs de transferência e rRNAs por Bowtie 2 [46] e as sequências anotadas foram removidas.

Usamos um banco de dados de referência do microbioma humano para realizar a análise funcional dos dados de RNA-seq. Esta referência incluiu 538 esboços e genomas bacterianos finalizados do consórcio de microbioma humano. Leituras de alta qualidade foram mapeadas usando Bowtie 2 para nosso banco de dados bacteriano de referência. Posteriormente, usando o banco de dados KEGG, todas as proteínas previstas do banco de dados do genoma de referência foram anotadas com grupos ortólogos (KOs) KEGG. Para genes de consulta com várias correspondências, o gene de referência anotado com o menor valor de e foi usado. Quando vários genes anotados com um valor e idêntico foram encontrados após uma consulta BLAST, incluímos todos os KOs atribuídos a esses genes. O número de transcritos atribuídos a cada gene foi então computado e normalizado para RPKM. Para contabilizar os genes que não foram detectados devido à profundidade de sequenciamento limitada, uma pseudoconta de 0,01 foi adicionada a todas as amostras. Os genes foram agrupados por táxons, genomas e KO calculando o RPKM cumulativo para cada amostra. HUMAnN [47] foi usado para reconstrução metabólica a partir de dados metagenômicos seguido por análise LefSe [48] com bootstraping para identificar biomarcadores significativos. As leituras foram anotadas no banco de dados de enzimas metacíclicas do consórcio do microbioma humano usando BLASTN. O número de transcritos atribuídos a cada enzima foi então computado e normalizado para RPKM. As enzimas da mesma classe foram somadas e expressas como uma única enzima.

Ensaio Esterase

Um total de 200 μL da cultura foi centrifugado a 12.000 × rpm por 10 min e o pellet foi suspenso em 200 μL de PBS estéril. Oitenta microlitros de suspensão foram usados ​​para ensaio de esterase com butirato de etila como substrato de acordo com Lisboa et al. [49]. A formação de ácido carboxílico devido à hidrólise de substratos mediada pela esterase provoca uma redução do pH, que muda a cor do meio de azul para amarelo. Esta reação pode ser observada ou monitorada espectrofotometricamente a 616 nm. Usamos etil butirato (Sigma Aldrich Inc., EUA 109959) como substrato e azul de bromotimol (Himedia labs, Índia GRM120) como indicador de pH.

Metabolômica

O processamento do tecido para metabolômica foi realizado no NIH Center for Metabolomics, University of California, EUA, de acordo com o procedimento operacional padrão [50]. Os analistas não tinham conhecimento das informações da amostra. Um total de 50 mg de tecido ceco depurado da matéria fecal foi colocado em um tubo de centrífuga de polipropileno de 25 mL e 2,5 mL de solvente de extração (acetonitrila: isopropanol: água 3: 3: 2) foi adicionado e homogeneizado por 45 s. Entre cada homogeneização, o homogeneizador foi limpo com soluções de metanol, acetona, água e solvente de extração. O homogenato foi centrifugado a 2500 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi aliquotado 2 × 500 μL e um deles armazenado a −20 ° C para backup. A outra alíquota de 500 μL foi evaporada até a secura completa em um concentrador de armadilha fria centrivap. A alíquota seca foi ressuspensa em 500 μL de 50% de acetonitrila desgaseificada e centrifugada por 2 min a 14.000 rcf. O sobrenadante foi coletado em um tubo fresco e evaporado à secura em um concentrador de armadilha fria centrivap e finalmente submetido à derivatização.

Metabolismo primário por ALEX-CIS GCTOF MS

Os dados foram adquiridos usando os seguintes parâmetros cromatográficos, conforme descrito por Fiehn et al. [51]. Uma coluna Rtx-5Sil MS (Restek Corporation) foi usada com hélio como fase móvel. Um total de 0,5 μL de amostras foi injetado no tempo sem divisão 25 em um forro de vidro com defletores múltiplos com temperatura de injeção de 50 ° C aumentada para 250 ° C por 12 ° C s −1. A temperatura do forno foi programada para 50 ° C por 1 min, a rampa de 20 ° C por minuto até 330 ° C, que foi mantida constante por 5 min. O processamento de dados e os relatórios de dados foram feitos pelo NIH Center for Metabolomics.

Os dados de resultados brutos foram normalizados para reduzir o impacto dos desvios entre as séries da sensibilidade do instrumento, causados ​​pela manutenção da máquina, envelhecimento e parâmetros de ajuste. Usamos uma variante de normalização de vetor em que a soma de todas as alturas de pico para todos os metabólitos identificados, excluindo o desconhecido para cada amostra, foi calculada e denominada como mTIC. O mTIC foi usado para evitar os artefatos não biológicos potenciais para as normalizações biológicas, como sangramento de coluna, plastificantes ou outros contaminantes. As médias de mTIC foram determinadas entre diferentes grupos de tratamento e a seguinte equação foi usada para normalização do metabólito i da amostra j:

Esta normalização é semiquantificação relativa e expressa como alturas de pico normalizadas.

Análise quantitativa de enriquecimento do conjunto de metabólitos

MSEA é uma forma de identificar padrões biologicamente significativos que são significativamente enriquecidos em dados quantitativos de metabolômica e foi realizada usando a ferramenta do MetaboAnalyst [28, 52]. A análise de sobre-representação foi implementada usando o teste hipergeométrico para avaliar se um determinado conjunto de metabólitos é representado mais do que o esperado pelo acaso na lista de compostos fornecida. Unilateral P os valores são fornecidos após o ajuste para vários testes.

Ensaio de glicose-6 fosfatase

Cinquenta miligramas de tecido de fígado / cólon foram homogeneizados em 500 μL de tampão RIPA com inibidores de protease e o homogenato final foi coletado. A quantidade de fósforo inorgânico (Pi) liberada foi avaliada usando o método de Taussky-Shorr [53]. Resumidamente, 150 μL de tampão Tris 100 mM (pH: 6,5) foram misturados com 100 μL de glicose-6 fosfato 200 mM (Sigma-Aldrich Inc., EUA G7879) e incubados a 37 ° C por 5 min. Posteriormente, 10 μL de homogenato de tecido foram adicionados, misturados e incubados novamente a 37 ° C por 5 min. A reação foi encerrada pela adição de 90 μL de TCA a 10% e incubação a 25 ° C por 5 min. Finalmente, a mistura foi centrifugada a 4000 rpm por 10 min e o sobrenadante foi coletado. A quantidade de Pi liberada foi medida pela mistura do sobrenadante ou solução inorgânica de Pi (Sigma-Aldrich Inc., EUA P3869) com igual volume de reagente de cor Taussky-Shorr (molibdato de amônio 10% preparado em ácido sulfúrico 5 M 10 mL, sulfato ferroso heptahidratado 5 g em 100 mL de água destilada) e incubado a 25 ° C por 6 min. Finalmente, a absorbância foi lida a 660 nm. A atividade específica da glicose-6 fosfatase (G6Pase) foi eliminada da contribuição das atividades não específicas da fosfohidrolase subtraindo a atividade para 20 mMβ-glicerofosfato [54] (Sigma-Aldrich Inc., EUA G9422) e, finalmente, a atividade líquida da G6Pase foi expressa como μg de Pi liberado por mg de proteína.

Ensaio de glicogênio

Um total de 100 mg de tecido hepático foi homogeneizado em 500 μL de TCA a 3% e o homogenato foi centrifugado a 3.000 rpm por 5 min. Cinco volumes de etanol 95% frio foram adicionados ao sobrenadante e deixados durante a noite em temperatura ambiente para precipitar o glicogênio. Após uma pequena rotação por 10 s, o sobrenadante etanólico foi descartado e o pellet foi dissolvido em 250 μL de água desionizada. Branco e padrões (0,5 mg / mL de glicose) foram preparados com o mesmo volume de água desionizada. Um total de 1,25 mL de reagente antrona (antrona 50 mg, tioureia 1 g, H2TÃO4 72 mL em 100 mL de água desionizada) foram adicionados a todos os tubos e incubados à temperatura de ebulição por 15 min. Após o resfriamento, a absorbância foi medida a 620 nm contra o branco. Quantidade de glicogênio (mg / 100 g de tecido) = DU / DS × 0,1 × volume do extrato / grama de tecido × 100 × 0,9 onde DU = absorbância das amostras e DS = absorbância do padrão de glicose [55].

Administração de acetato de sódio

Os camundongos jejuaram por 4 horas antes do experimento. NaAc (100 mg / kg de peso corporal) foi administrado por via oral usando gavagem ou por RI continuamente durante sete dias. Antes da RIs, os camundongos foram manuseados suavemente e deixados para defecar e a defecação completa foi confirmada pressionando suavemente na extremidade distal do reto. Os camundongos foram tratados inversamente e NaAc foi administrado em um volume máximo de 20 μL usando pontas de 2–20 μL através da micropipeta. Finalmente, OGTT foi realizado por protocolos padrão. Os animais foram sacrificados no mínimo 24 horas após o OGTT e os órgãos foram retirados.

Coleta de amostras fecais humanas

Amostras fecais foram coletadas de pessoas diabéticas (n = 60) e controle (n = 60) da população anteriormente estudada para HbA1c e análise de OP. Pessoas com problemas intestinais ou relacionados ao estômago foram excluídas do estudo. Os voluntários de controle foram confirmados quanto à ausência de obesidade, hipertensão, dislipidemia ou outros problemas. O protocolo de coleta foi aprovado pela pesquisa interna e conselho de revisão, autorização ética, biossegurança e comitê de bem-estar animal da Universidade Madurai Kamaraj. Além disso, os detalhes do projeto foram explicados e seus detalhes no questionário anterior foram reconfirmados e um novo consentimento informado foi obtido (arquivo adicional 6). Posteriormente, no dia seguinte, amostras fecais de manhã cedo foram coletadas e armazenadas imediatamente em gelo. As amostras foram transportadas para o laboratório em 1 he armazenadas a −80 ° C. Os analistas que realizaram os parâmetros fecais eram cegos e desconheciam o status de exposição diabética ou OP das amostras.

Quantificação de ácidos graxos de cadeia curta nas fezes

Um total de 100 mg de fezes foi pesado e suspenso em 2 mL de PBS estéril e agitado em vórtex por 1 min. A mistura foi centrifugada a 3000 × g durante 10 min. Cinco microlitros do sobrenadante foram diluídos 1: 100 com PBS estéril. Cinco microlitros de butirato de etila (Sigma-Aldrich 109959) foram adicionados como padrão interno para uma concentração final de 5 mM. Posteriormente, 250 μL de HCl concentrado foram adicionados, seguido pela adição de 1 mL de éter dietílico (Merck LiChrosolv). A mistura foi agitada em vórtex por 1 min e centrifugada a 3000 × g por 10 min. Um total de 750 μL de fase superior foi coletado e derivatizado com 120 μL de N-tert-Butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) contendo 1% de terc-butildimetilclorossilano (TBDMSCI) (Sigma-Aldrich Inc., EUA 375934) por incubação a 80 ° C durante 20 min. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 48 h para assegurar a derivatização completa. A cromatografia gasosa foi executada conforme descrito por Frost et al. [56] por detector de ionização de chama. As temperaturas do injetor e detector de GC foram fixadas em 275 ° C. O programa de temperatura do forno foi otimizado para manter a 63 ° C por 3 min e então aumentar em 10 ° C min -1 até 190 ° C. O gás hélio foi usado como gás portador. A temperatura da linha de transferência foi ajustada para 280 ° C.Padrões externos para acetato foram preparados em concentrações de 25, 12,5, 6,25, 1,25 e 0,625 mM e ácido etilbutírico foi usado como o padrão interno em uma concentração de 100 mM. Os valores relatados foram normalizados de acordo com o peso da amostra original usada.

Estatisticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas nos softwares estatísticos SPSS versão 20.0 e GraphPad Prism versão 6.01. Para estudos de associação na pesquisa, as ORs ajustadas para idade e sexo e os ICs de 95% foram calculados. Para estudos em humanos, o teste U de Mann-Whitney não paramétrico foi empregado. Correlação de Pearson e regressão linear foram realizadas para demonstrar a força da relação entre dois parâmetros. Os resíduos de OP no plasma foram categorizados em quartis com base na distribuição ponderada da amostra. Para cada OP, usamos a regressão logística para estimar os ORs e os níveis de IC para diabetes, comparando cada quartil com o quartil inferior. Incluímos fatores de confusão prováveis ​​ou suspeitos em modelos com base em dados publicados anteriormente. Em cada análise, também avaliamos a significância das diferenças da proporção média de diabéticos nos quatro quartis do modelo por um teste χ2 de máxima verossimilhança generalizado. Nossos modelos de regressão foram ajustados com graus apropriados de ajuste. Ajustamos para idade, sexo, história familiar de diabetes e IMC.


Usando diluições para encontrar CFU

O procedimento para encontrar CFU de uma determinada amostra envolve primeiro a diluição dessa amostra. As diluições são então semeadas em placas com o meio de crescimento correto. Muitas vezes, diluições múltiplas são uma boa ideia, uma vez que a amostra original pode ser muito concentrada.

Depois de permitir que as bactérias cresçam nas placas por um determinado período de tempo, colônias individuais são contados em um prato. Se a amostra estava muito concentrada, então, em vez de colônias individuais, você verá uma grande área coberta com crescimento bacteriano, que é chamada de grama. Isso significa que você deve diluir ainda mais sua amostra e tentar cultivá-la novamente para que possa ver as colônias individuais.

Como as colônias individuais vêm de uma única bactéria que se replicou muitas vezes, apenas essas contam para a UFC.


Desenvolvimentos históricos

Uma das primeiras tentativas de cultura de tecidos foi feita em 1885 pelo zoólogo alemão Wilhelm Roux, que cultivou tecido de um embrião de pinto em uma solução de sal quente. O primeiro sucesso real veio em 1907, no entanto, quando o zoólogo americano Ross G. Harrison demonstrou o crescimento de processos de células nervosas de sapo em um meio de linfa coagulada. O cirurgião francês Alexis Carrel e seu assistente Montrose Burrows posteriormente aprimoraram a técnica de Harrison, relatando seus avanços iniciais em uma série de artigos publicados em 1910-1911. Carrel e Burrows cunharam o termo cultura de tecido e definiu o conceito. Posteriormente, vários experimentadores conseguiram cultivar células animais, usando como meio de cultura uma variedade de fluidos biológicos, como linfa, soro sanguíneo, plasma e extratos de tecidos. Nas décadas de 1980 e 1990, foram desenvolvidos métodos que permitiram aos pesquisadores cultivar com sucesso células-tronco embrionárias de mamíferos sob condições artificiais. Essas descobertas possibilitaram o estabelecimento e a manutenção de linhas de células-tronco embrionárias humanas, que aumentaram a compreensão dos pesquisadores da biologia humana e facilitaram muito o progresso na terapêutica e na medicina regenerativa.


Discussão

A plataforma PDOTS / MDOTS oferece várias vantagens sobre os métodos existentes para avaliar as respostas imunológicas tumorais ao ICB (consulte a Tabela 1), fornecendo uma janela para o microambiente imunológico do tumor e permitindo a avaliação de respostas agudas e dinâmicas ao ICB ao usar modelos murinos relevantes e pacientes amostras. Ao contrário dos organoides, 21,22 xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs) 23 e células tumorais circulantes (CTCs), 24 MDOTS e PDOTS não requerem dias ou semanas de manipulação ou propagação de tecidos e contêm células imunes autólogas infiltrantes de tumor. É importante ressaltar que MDOTS / PDOTS não devem ser confundidos com organóides, um método de cultura 3D distinto desenvolvido por Hans Clevers e Toshiro Sato, que aproveita as células-tronco do tecido nativo para propagar o tecido normal ou transformado. 25 Organoides, como PDXs e CTCs, podem ser usados ​​como parte de esforços de medicina personalizada, mas não possuem células estromais e imunológicas nativas, impedindo assim o estudo de interações tumor-imunológicas. Além disso, a geração de uma quantidade suficiente de organóides leva tempo, limitando assim a capacidade de rastreamento rápido de drogas.

Cultura de tipo Modelos de câncer Características / vantagens Limitações
In vitro ex vivo Cultura microfluídica 3D de: 26-32 Condições de cultura • Ideal para estudar a interação imunológico-tumoral no microambiente 3D Limitações de cultura • Incapacidade de recapitular interações biológicas in vivo dentro de todo o animal (exceto para o corpo em plataformas de chip)
• Capaz de modelar microambiente tumoral complexo (TME) e matriz extracelular (ECM) • Variabilidade no número de esferóides dentro do dispositivo
• Uso de espécimes derivados de pacientes e de camundongos (PDOTS, MDOTS) ou linhas celulares (esferóides de linha celular) • Difícil de manter a cultura de longo prazo (meses)
• Co-cultura multicelular dinâmica • Difícil de fornecer meio de cultura de células correto
• Reproduz interações parácrinas e de contato • Risco de contaminação durante o manuseio
• É responsável pelo crescimento tridimensional de células cancerosas
• Simula a organização local in vivo
• Cultura de médio prazo (1–2 semanas)
Esferóides de linha celular 18,29,30,32 Métodos de material e amp • Requer baixo número de células Problemas técnicos • Baixa reprodutibilidade e variabilidade nos dados (PDOTS)
• Capacidade de modular citocinas / gradientes
• Reduz reagentes
MDOTS 16,17 • Possibilidade de incluir estímulos de fluxo de fluido com bombas • Incapacidade de reproduzir os mesmos experimentos (PDOTS), a menos que após "bio-banco" da amostra e criar linhas de células do paciente
• Dispositivos microfluídicos são escalonáveis ​​(tamanho, número de células) • Difícil de avaliar / extrair resultados
PDOTS 16,17 Resultados e potencialidade do amplificador • Experimentos reproduzíveis (linha celular, MDOTS) • Requer classificação de células para coletar lisado de proteína e RNA de cada população de células
• Imagens em tempo real • Requer operador (es) experiente (s) e treinamento
• Capaz de avaliar a toxicidade e o metabolismo do medicamento • Rastreio de baixo rendimento (potencial rastreio de rendimento médio a alto)
• Ensaios Live / Dead • Alto custo (MDOTS, PDOTS)
• Perfil de citocina
• Alta reprodutibilidade com o mesmo fundo do mouse (MDOTS)
• Pode ser aplicado para estudos de migração (células do sistema imunológico)
• Facilidade de coleções de RNA de proteínas em massa
• Baixo custo (esferóides de linha celular)
• Potencial para medicina personalizada
In vitro ex vivo Cultura de células padrão 2D 31-35 Condições de cultura • Ideal para estudar processos autônomos de uma única célula cancerosa Limitações de cultura • Incapacidade de recapitular a interação biológica in vivo dentro do corpo humano inteiro
• Uso de linha celular comercial e derivada de paciente • Cultura bidimensional estática
• Cultura técnica simples • Falta do TME
• experimentos reproduzíveis • Não leva em conta o crescimento tridimensional das células cancerosas
• Cultura de baixo, médio a longo prazo • Falta ECM
Métodos de material e amp • Requer células, meio de cultura de células e pratos de cultura • Falta de células imunológicas
• Potenciais alterações genéticas de células cancerosas ao longo do tempo
• Sem co-cultura multicelular
• Sem possibilidade de incluir estímulos de fluxo de fluido com bombas
• Triagem de baixo rendimento
Resultados e potencialidade do amplificador • Mudança potencial do fundo genético das células cancerígenas originais Problemas técnicos
• Ensaio vivo / morto
• Perfil de citocina
• Imagens em tempo real
• Métodos fáceis para coletar lisados ​​de proteínas e RNAs
• Fácil avaliação / extração de resultados capazes de avaliar a toxicidade e o metabolismo do medicamento
• Baixo custo
• Triagem de alto rendimento (até placas de 96 ou 384 poços)
In vitro ex vivo Cultura transwell padrão 36-40 Condições de cultura • Ideal para estudar a sinalização parácrina, quimiotaxia (células imunes) e permeabilidade vascular (drogas) Limitações de cultura • Incapacidade de recapitular a interação biológica in vivo
• Modular citocinas / gradientes • Não imite as interações de contato no TME
• Cultura técnica simples • Baixa imitação da organização in vivo
• Co-cultura multicelular dinâmica
• Revestimento 2D com ECM
• Cultura de médio a longo prazo
Métodos de material e amp • Requer células, meio de cultura de células, inserção transwell (membrana) e poços de cultura Problemas técnicos • A força da gravidade (g) pode afetar os resultados
• Possível aplicação de fluxo transendotelial com plataformas customizadas / comerciais • Imagem difícil (depende da transparência da membrana)
Resultados e potencialidade do amplificador • Capaz de avaliar a toxicidade e o metabolismo do medicamento
• Perfil de citocina
• Fácil coleta de lisado de proteína e RNA de cada população de células sem classificação
• Resultados fáceis / reproduzíveis
• Baixo custo
• Triagem de alto rendimento (até placas de 96 ou 384 poços)
In vitro in vivo ex vivo Células tumorais circulantes (CTCs) 24,41-46 Condições de cultura • Métodos não invasivos de isolamento do sangue Limitações de cultura • Difícil de fornecer protocolos / meio para cultura
• Co-cultura multicelular • Carece de células imunes e estromais nativas
• Cultura de médio prazo (1–2 semanas) • Possível biologia diferente entre células tumorais circulantes e tumor dentro do microambiente nativo
• Versátil e compatível com várias plataformas e tipos de cultura (cultura 3D, organoides, modelos de mouse in vivo)
Métodos de material e amp • Uso de amostras derivadas de pacientes Problemas técnicos • Frequentemente presente apenas em pacientes com grande carga de doença
• Demora para propagar material suficiente para triagem / teste de drogas
Resultados e potencialidade do amplificador • Potencial para medicina personalizada • Difícil avaliar / extrair resultados
• Imagens em tempo real • Custos médios a altos
• Após a propagação, os CTCs podem ser usados ​​para testes de drogas antineoplásicas • Triagem de rendimento baixo a médio
In vitro ex vivo Organoides 21,22,47-49 Condições de cultura • Ideal para recapitular a fisiopatologia do tumor original Limitações de cultura • Carece de elementos imunes e estromais nativos
• Modelar TME de microambiente tumoral complexo • Demora para propagar material suficiente para triagem / teste de drogas
• Co-cultura única / multicelular • É difícil fornecer protocolos / meios de cultura de células corretos
• Responsável pelo crescimento de células cancerígenas tridimensionais • Risco de contaminação por alto nível de manuseio
• Organização mímica in vivo
• Vários métodos de isolamento do sangue periférico
• Possível repetir a avaliação ("biobanco vivo")
• Cultura de médio a longo prazo (até meses)
Métodos de material e amp • Uso de amostras derivadas de pacientes ou linhas celulares Problemas técnicos • Difícil de avaliar / extrair resultados
• Exigir classificação de células para coletar lisado de proteína e RNA de cada população de células (organóides multicelulares)
Resultados e potencialidade do amplificador • Imagens em tempo real • Triagem de rendimento baixo a médio
• Capaz de avaliar a toxicidade e o metabolismo do medicamento
• Fácil - lisados ​​de proteína em massa e extrações de RNA
• Custos baixos a médios
• Potencial para medicina personalizada
Na Vivo Modelos de camundongos Xenoenxertos 23,31,33,50–54 Condições de cultura • Ideal para estudar a interação biológica in vivo dentro de todo o sistema de cultura in vivo do corpo do animal usando amostras derivadas de pacientes Limitações de cultura • Tempo e mão-de-obra intensiva
• Responsável pelo crescimento tridimensional de células cancerígenas • Imagens desafiadoras em tempo real
• Organização mímica in vivo e TME • Requer operador (es) experiente (s) e treinamento
• Co-cultura multicelular • Diferenças genéticas entre as espécies
• Cultura de longo prazo (mais de meses) • Infraestrutura complexa e habilidades técnicas específicas necessárias
• Incompatível com triagem de alto rendimento • Falta de células imunológicas
• Estímulos de fluxo de fluido por circulação in vivo
Métodos de material e amp • Exigir instalações para ratos e animais Problemas técnicos • Exigir cultura longa para quantificar os resultados
• Variabilidade desafiadora de dados
Resultados e potencialidade do amplificador • Xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs) derivados de modelos de camundongos podem ser cultivados em dispositivos microfluídicos 3D ou cultivados como organoides • Colete lisado de proteína e RNA após o sacrifício do camundongo
• Altos custos
• Triagem de baixo rendimento
Na Vivo Modelos de camundongos imunocompetentes 31,33,54-56 Condições de cultura • Sistema de cultura in vivo usando amostras derivadas de pacientes Limitações de cultura • Tempo e mão-de-obra intensiva
• Interação biológica in vivo dentro de todo o corpo do animal • Imagens desafiadoras em tempo real
• Inclui interações imunológicas • Requer operador (es) experiente (s) e treinamento
• Responsável pelo crescimento tridimensional de células cancerígenas • Infraestrutura complexa e habilidades técnicas específicas necessárias
• Organização mímica in vivo e TME • Número limitado de combinações potenciais de medicamentos
• Cultura de longo prazo (mais de meses) • Drogas e anticorpos terapêuticos contra alvos de camundongos podem diferir de alvos humanos
• Apenas estudo de células de camundongo
Métodos de material e amp • Exigir instalações para ratos e animais Problemas técnicos • Exigir cultura longa para quantificar os resultados
Resultados e potencialidade do amplificador • Capaz de modelar heterogeneidade de resposta e resistência in vivo
• Capaz de avaliar a toxicidade e o metabolismo do medicamento • Variabilidade desafiadora de dados
• Estímulos de fluxo de fluido por circulação in vivo • Colete lisado de proteína e RNA após o sacrifício do camundongo
• Útil para avaliar drogas cujo mecanismo de ação leva tempo (por exemplo, agentes modificadores epigenéticos) • Altos custos
• MDOTS derivados de modelos de camundongos imunocompetentes podem ser cultivados em dispositivos microfluídicos 3D ou cultivados como organóides • Triagem de baixo rendimento

MDOTS / PDOTS oferecem vantagens significativas sobre organóides, PDXs e CTCs para respostas imunológicas de tumor de perfil ex vivo ao ICB, no entanto, existem várias limitações importantes inerentes à versão atual da plataforma. Em primeiro lugar, a versão atual da plataforma MDOTS / PDOTS atualmente só é capaz de avaliar as interações tumor-imunes de células imunes que já se infiltraram no tumor. Em outras palavras, PDOTS / MDOTS “v1.0” não pode recapitular o priming de células T (que ocorre principalmente em nódulos linfáticos) ou o recrutamento de células imunes virgens para o microambiente tumoral. Em segundo lugar, ainda temos que realizar uma avaliação abrangente das alterações tumorais, estromais e imunológicas durante o curso da cultura ex vivo, tanto em condições de controle quanto em resposta à ICB. Em terceiro lugar, o uso de biópsias com agulha central e FNAs é desafiador, e as amostras excisionais são preferidas para produzir número e qualidade de amp de MDOTS / PDOTS suficientes para o perfil ex vivo no momento, por último, a influência das dimensões do dispositivo, parâmetros biofísicos, fluxo intersticial, hipóxia, e metabólica nas interações tumor-imunes, especialmente a produção de citocinas, permanece pouco compreendida e exigirá mais investigação.



Comentários:

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